Sirtuins 基因家族及其剪接體在雌雄小鼠骨骼肌的時空表達譜研究

林曉駿，孫 瑜，謝社風，劉遠斌，陳冰彤，黃宇健，康 愷，吳 江

（ 廣東海洋大學濱海農業(yè)學院，廣東 湛江 524088 ）

可變剪接是指個體發(fā)育或細胞分化時有選擇地越過某些外顯子或某個剪接點進行變位剪接，進而形成不同mRNA 異構體的過程。生物體通過可變剪接可以由單個基因產生多個不同的蛋白質異構體，從而導致大量蛋白質變異[1]。因此，可變剪接在動物生長發(fā)育和生理代謝等過程中發(fā)揮重要的調控作用。可變剪接是調節(jié)基因表達和產生蛋白質組多樣性的重要機制，是導致真核生物基因和蛋白質數(shù)量較大差異的重要原因[2]?？勺兗艚优c牛、羊等動物的重要經(jīng)濟形狀的表達相關[3]，但其在生物體內的作用機制和在生物進化中發(fā)揮的作用還有待進一步探究。

Sirtuins基因家族因其與細胞命運密切相關受到廣泛關注[4-6]，但目前相關研究在畜牧獸醫(yī)方面較少?，F(xiàn)有研究表明，Sirt1基因的不同剪接體對細胞衰老具有一定影響[7]。有研究結果顯示，Sirt1-FL 抑制H2O2誘導的氧化損傷，而Sirt1-ΔExon8 則可促進氧化應激損傷。Sirtuins基因家族對骨骼肌方面的研究主要集中于其在Sirt1/PGC-1α 和AMPK/SIRT/PGC1α 相關能量代謝通路中[8-9]及其在氧化應激中發(fā)揮的作用[10]。以往對骨骼肌的相關研究顯示，Sirt1 和Sirt2 分別起到誘導對氧化應激的抵抗和動員脂質儲存的作用[11-12]；Sirt5 能夠有效去除賴氨酸羧基修飾，包括丙二酰賴氨酸、琥珀酰賴氨酸和戊二酰賴氨酸，從而對骨骼肌細胞代謝產生影響[13]；Sirt6蛋白水平會因其他系統(tǒng)的氧化應激而升高，促進DNA 雙鏈斷裂修復以減輕骨骼肌中由于ROS患病率增加而導致的基因組損傷[14-15]；Sirt7是一種組蛋白脫琥珀酸酶，在功能上與染色質致密化和基因組穩(wěn)定性相關[16]。

本研究通過半定量反轉錄、PCR擴增和瓊脂糖凝膠電泳方法檢測Sirtuins基因家族候選剪接體在不同周齡小鼠骨骼肌中的表達，發(fā)現(xiàn)Sirtuins基因家族候選剪接體的表達與所處周齡、所在部位具有密切的關系，研究結果為深入探究Sirtuins蛋白家族在哺乳動物體內的作用機制和Sirtuins基因家族候選剪接體在不同周齡小鼠骨骼肌中的表達機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

昆白小鼠由廣東海洋大學濱海農業(yè)學院動物遺傳育種與繁殖實驗室提供，飼養(yǎng)于廣東海洋大學濱海農業(yè)學院清潔級動物房，自主飲食和飲水，溫度（22±4） ℃，濕度55%±5%，室內光照明暗周期12 h/12 h。所有試驗操作嚴格遵守動物倫理和動物福利的要求，按照廣東海洋大學實驗動物管理委員會的相關規(guī)定進行試驗，倫理委員會審批號：SYXK-2018-0147。選取2、4、6、8 周齡體重均勻健康的小鼠10只，公母各半，共40只小鼠進行試驗。小鼠實施安死術后，分離大腿部骨骼肌，放入液氮凍存。

1.2 試劑與儀器

RNA 反轉錄試劑盒（PrimeSeriptTM feagent Kit with gDNA Eraser-PergectReal Time）購自寶日醫(yī)生物技術（北京）有限公司；TRIzol 試劑購自天根生化科技（北京）有限公司；100～2 000 bp DNA Marker購自生工生物工程（上海）股份有限公司；2×Easy Taq PCR Super Mix（+dye）購自北京全式金生物技術有限公司；瓊脂糖購自BIOWEST公司；核酸染色劑GoldViewTM Nuclic Acid Stain 購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司。

1.3 樣品采集

使用頸椎脫臼法處死雌雄小鼠共40只，快速識別并獲取黃豆大小雌雄鼠腿肌各12份，其中用于不同周齡剪接體驗證的各3份。分別放入加有200 μL Trizol液的EP管中，-80 ℃保存。運用Trizol法提取小鼠RNA。

1.4 引物設計（見表1、圖1）

圖1 引物設計模式Fig.1 Schematic diagram of primer

表1 qRT-PCR引物信息Tab.1 qRT-PCR primer information

參考NCBI的GeneBank數(shù)據(jù)庫中小鼠的Sirt1～Sirt7基因序列，可知Sirt1基因有2個已證實的剪接體，Sirt2有3個已證實的剪接體和3個預測變體，分別針對不同基因利用Primer Premier 5.0軟件設計引物。使用基因所對應引物的名稱代替對應Sirt2候選剪接體進行敘述，將NM_019812、NM_001159589 分別用Sirt1.1、Sirt1.2 指代。Sirt5 基因具有6種候選剪接體，Sirt5基因及其候選剪接體序列高度相似。其中候選剪接體1、2、3、4、5 等5 個序列相似度最高，在進行引物設計時，將候選剪接體1、2、3、4、5合并為一個序列進行設計，在堿基序列一致的片段進行引物設計。Sirt6 基因有2 個已證實的剪接體和1 個預測變體，Sirt7 有2 個已證實的剪接體，分別針對不同基因利用Primer Premier 5.0軟件設計引物。使用基因所對應引物的名稱代替對應Sirt6、Sirt7候選剪接體進行敘述。

1.5 目的基因擴增及表達量鑒定

Trizol 法提取RNA，RNA 反轉錄試劑盒反轉錄合成cDNA，PCR 擴增目的條帶。PCR 體系：PCR Mix 10 μL、ddH2O 8.2 μL、反轉錄產物小鼠cDNA 1 μL、內參0.8 μL。Sirt1 及其候選剪接體在94 ℃、3 min 36 s 條件下預變性；94 ℃變性30 s，56.6 ℃退火，72 ℃延伸1 min，35 個循環(huán)；72 ℃延伸9 min。Sirt2 及其候選剪接體在95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s，51 ℃退火30 s，72℃延伸1 min，28個循環(huán)；72℃延伸5 min。Sirt5及其候選剪接體在95 ℃預變性3 min；95 ℃條件下變性30 s，Sirt5.1、Sirt5-1.1、Sirt5-1.2 分別在51、60、52 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，34次循環(huán)；72 ℃延伸5 min。Sirt6及其候選剪接體在95 ℃條件下預變性3 min；95 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，34 個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。Sirt7 及其候選剪接體在95 ℃條件下預變性5min；95 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，34 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。β-actin 在95 ℃預變性3 min，95 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，34個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

以不同周齡的小鼠樣品與內參基因作對比，每個樣品重復3 次。擴增反應結束后采用ImageJ 軟件進行條帶分析，記錄IntDen值。利用Excel軟件計算基因相對表達量，SPSS 17.0 軟件進行單因素方差分析。結果以“平均值±標準差”表示，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 Sirtuins基因家族候選剪接體在雌性小鼠骨骼肌中的表達

2.1.1Sirt1 候選剪接體在雌性小鼠骨骼肌中的表達（見圖2）

圖2 Sirt1候選剪接體在雌性小鼠骨骼肌中的表達Fig.2 Expression of Sirt1 candidate spliceosome in skeletal muscle of female mice

由圖2 可知，2 周齡雌鼠骨骼肌中Sirt1.2 表達量顯著高于4、6、8周齡（P＜0.05）。

2.1.2Sirt2 候選剪接體在雌性小鼠骨骼肌中的表達（見圖3）

圖3 Sirt2候選剪接體在雌性小鼠骨骼肌中的表達Fig.3 Expression of Sirt2 candidate spliceosome in skeletal muscle of female mice

由圖3 可知，2 周齡雄鼠骨骼肌Sirt2.1 基因表達量極顯著高于4周齡（P＜0.01），6和8周齡雄鼠骨骼肌Sirt2.1基因表達量顯著高于4 周齡（P＜0.05）。4、6 和8 周齡雄鼠骨骼肌Sirt2.2 基因表達量均顯著高于2 周齡雄鼠（P＜0.05）。2 周齡雄鼠骨骼肌Sirt2.3 基因表達量極顯著高于4、6 和8 周齡（P＜0.01）。2 周齡雄鼠骨骼肌Sirt2.4 基因表達量極顯著高于8周齡（P＜0.01）。

不同樣品Sirt2.5 和Sirt2.6 基因進行相關電泳結果顯示，Sirt2.5 基因PCR 產物長度在250～500 bp，與預期產物大小135 bp 不相符；Sirt2.6 基因PCR 產物長度在500～750 bp，與預期產物大小393 bp不相符，因此可判斷預測變體Sirt2.5和Sirt2.6未檢出，后文不予討論。

2.1.3Sirt5 和Sirt7 候選剪接體在雌性小鼠骨骼肌中的表達（見圖4）

圖4 Sirt5和Sirt7候選剪接體在雌性小鼠骨骼肌中的表達Fig.4 Expression of Sirt5 and Sirt7 candidate spliceosomes in skeletal muscle of female mice

由圖4 可知，4 周齡雌性小鼠骨骼肌中Sirt5 表達量顯著高于6 周齡（P＜0.05）；6、8 周齡雌性小鼠骨骼肌中Sirt7的表達量顯著低于2、4周齡（P＜0.05）。Sirt5的候選剪接體XM_006516951.1、XM_006516952.3、XM_006516953.1、XM_011244413.2、XM_011244412.1、XM_006516954.1 以及Sirt7 的候選剪接體NM_001363439.1 均不表達，后文不再展開討論。

2.1.4Sirt6 候選剪接體在雌性小鼠骨骼肌中的表達（見圖5）

圖5 Sirt6候選剪接體在雌性小鼠骨骼肌中的表達Fig.5 Expression of Sirt6 candidate spliceosome in skeletal muscle of female mice

由圖5 可知，2 周齡雄性小鼠骨骼肌中Sirt6.1 的表達量顯著高于其他周齡（P＜0.05）。4周齡雌性小鼠骨骼肌中Sirt6.2的表達量顯著低于2、8周齡（P＜0.05），6周齡的表達量極顯著低于2、8周齡（P＜0.01）。

2.2 Sirtuins基因家族候選剪接體在雄性小鼠骨骼肌中的表達

2.2.1 Sirt1 候選剪接體在雄性小鼠骨骼肌中的表達（見圖6）

圖6 Sirt1候選剪接體在雄性小鼠骨骼肌中的表達Fig.6 Expression of Sirt1 candidate spliceosome in skeletal muscle of male mice

由圖6可知，各周齡雄鼠骨骼肌中Sirt1.1、Sirt1.2表達量差異均不顯著（P＞0.05）。

2.2.2 Sirt2 候選剪接體在雄性小鼠骨骼肌中的表達（見圖7）

圖7 Sirt2候選剪接體在雄性小鼠骨骼肌中的表達Fig.7 Expression of Sirt2 candidate spliceosome in skeletal muscle of male mice

由圖7 可知，6 周齡雄鼠骨骼肌Sirt2.1 基因表達量極顯著高于4 周齡（P＜0.01），顯著高于2、8 周齡（P＜0.05）；2 和8 周齡雄鼠骨骼肌Sirt2.1 基因表達量顯著高于4 周齡（P＜0.05）。6 和8 周齡雄鼠骨骼肌Sirt2.2 基因表達量極顯著高于2 周齡雄鼠（P＜0.01），顯著高于4 周齡（P＜0.05）；4周齡雄鼠骨骼肌Sirt2.2基因表達量顯著高于2周齡雄鼠（P＜0.05）。6周齡雄鼠骨骼肌Sirt2.3基因表達量極顯著高于4和8周齡雄鼠（P＜0.01）；2周齡雄鼠骨骼肌Sirt2.3基因表達量顯著高于4 和8 周齡雄鼠（P＜0.05）。6 周齡雄鼠骨骼肌Sirt2.4基因表達量極顯著高于2 和8 周齡（P＜0.01），顯著高于4周齡（P＜0.05）；4周齡雄鼠骨骼肌Sirt2.4基因表達量顯著高于2和8周齡雄鼠（P＜0.05）。

2.2.3Sirt5 和Sirt7 候選剪接體在雄性小鼠骨骼肌中的表達（見圖8）

圖8 Sirt5和Sirt7候選剪接體在雄性小鼠骨骼肌中的表達Fig.8 Expression of Sirt5 and Sirt7 candidate spliceosomes in skeletal muscle of male mice

由圖8可知，Sirt5在2周齡雄性小鼠骨骼肌內不表達，4 周齡時表達量顯著高于6、8 周齡（P＜0.05）；Sirt7 基因在2、4周齡雄性小鼠骨骼肌內表達高于6、8周齡（P＞0.05）。

2.2.4Sirt6 候選剪接體在雄性小鼠骨骼肌中的表達（見圖9）

圖9 Sirt6候選剪接體在雄性小鼠骨骼肌中的表達Fig.9 Expression of Sirt6 candidate spliceosome in skeletal muscle of male mice

由圖9 可知，2、4、6 周齡雄性小鼠骨骼肌中Sirt6.1 表達量差異不顯著（P＞0.05），均極顯著低于8周齡（P＜0.01）；2 周齡雄性小鼠骨骼肌中Sirt6.2 表達量顯著高于4 周齡（P＜0.05），極顯著高于6、8 周齡（P＜0.01）；4 周齡雄性小鼠骨骼肌中Sirt6.2表達量顯著高于6、8周齡（P＜0.05）。

3 討論

Sirt1是體內重要的能量代謝感受器，可感知機體的能量代謝狀態(tài)，通過改變下游分子的基因表達或活性調節(jié)機體能量代謝過程[17]。Chriett 等[18]研究表明，Sirt1 在豬骨骼肌中的表達水平從胚胎階段到出生呈逐漸下降的趨勢。在本研究中，對于骨骼肌這種耗能較多的組織，Sirt1 候選剪接體在不同周齡的雌、雄小鼠體內均保持較高的表達量，且Sirt1.2 在幼齡階段表達相對較高，但總體呈隨發(fā)育成熟表達量逐漸下降的趨勢。目前研究表明，隨著個體年齡增長的衰老階段，細胞中NAD 的含量表現(xiàn)出關聯(lián)下降（可以是由于細胞中NAMPT 水平下降導致），并可能啟動細胞內的補償機制從而導致Sirt1的表達量增加[19-20]，因此推測個體發(fā)育成熟細胞內NAD水平的增長會抑制Sirt1相關剪接體的表達。

本研究中，Sirt2.1、Sirt2.3、Sirt2.4表達量出現(xiàn)幼齡階段表達量較高且總體表達量具有隨年齡增長降低的趨勢，Sirt2.2 在幼齡階段表達較少，4 周齡后表達量趨于穩(wěn)定。根據(jù)小鼠的生長周期可知，出生至2周齡期間屬于哺乳期，滿2周齡時開始采食和飲水；出生后4～8周屬于生長期，其中雌性性成熟期為35～50 日齡，雄性為45～60 日齡。已有研究表明，Sirt2 負調節(jié)C2C12 骨骼肌細胞中的胰島素抵抗，且抑制Sirt2 也會增強細胞中的葡萄糖攝取[21]，這可能是Sirt2.1、Sirt2.3、Sirt2.4 隨發(fā)育成熟表達量逐漸下降的原因。本研究中，Sirt2的不同剪接體在骨骼肌組織中呈現(xiàn)不同的表達規(guī)律，推測Sirt2不同候選剪接體在骨骼肌發(fā)育過程中可能發(fā)揮著不同的作用，具體原因還有待進一步探究。

Sirt5 與能量代謝密切相關[22]。本試驗中，Sirt5 在4 周齡雄性小鼠骨骼肌中表達量顯著高于6、8 周齡；在2、4、8周齡及2、6、8周齡組間雌性小鼠骨骼肌中的表達量差異均不顯著，4 周齡雌性小鼠骨骼肌中的表達量顯著高于6周齡。王利紅等[23]研究發(fā)現(xiàn)，母豬Sirt5蛋白表達量總體低于公豬。本試驗結果也呈現(xiàn)雄性表達量略高于雌性的現(xiàn)象。Ryu等[24]研究表明，Sirt7與乳酸積累、運動表現(xiàn)密切相關。Chriett等[18]研究表明，Sirt7在豬骨骼肌中的表達水平與年齡增長呈現(xiàn)負相關關系。本試驗中，Sirt7在不同性別的小鼠骨骼肌中的表達均呈現(xiàn)隨年齡增長下降的趨勢，且在6周齡時出現(xiàn)明顯下降，總體上表達量保持穩(wěn)定。

現(xiàn)有研究表明，Sirt6 作為一種賴氨酸-脫乙酰酶和單-ADP-核糖基轉移酶，具有多效性作用[25]，但Sirt6 在代謝中的作用存在爭議。如Sirt6 基因敲除小鼠表現(xiàn)出脂肪組織質量減少和低血糖[26]。Sirt6 缺乏還導致Sirt6 依賴性轉錄沉默減弱，導致參與糖酵解和葡萄糖轉運的基因表達增加[27]。此外，Sirt6能夠提高骨骼肌的胰島敏感性從而降低血糖和治療肥胖[28]。

本研究對雄鼠骨骼肌的檢測結果表明，2周齡時，雄鼠骨骼肌中Sirt6.1表達量開始下滑，到第6周齡結束，第8周時表達量突然上升達到最大值；Sirt6.2 的表達量則是在2周齡時達到最大，之后隨著年齡增長而下滑，到8周齡時出現(xiàn)上升跡象。在對雌鼠骨骼肌的檢測表明，各周齡組Sirt6.1的表達量均保持在較高水平，2周齡時表達量最大，隨著年齡增長表達量稍微下滑，到第8周齡時有所回升；在雌性骨骼肌中Sirt6.2 表達量在2 周齡時最大，隨著年齡增長有大幅度下滑的跡象，但在8 周齡時有回升，這可能與Sirt6隨著年齡增長所需要能量的高低有關。

4 結論

本研究結果顯示，Sirt1.1 和Sirt1.2 的表達量隨周齡增長呈下降趨勢，6周齡時最低；Sirt2在2～8周齡小鼠骨骼肌中廣泛表達，其中Sirt2.4在小鼠各組織中PCR產物長度與預期產物大小相符，有表達且表達量較高；4周齡組雌性骨骼肌中Sirt5的表達量顯著高于6周齡組；Sirt6的兩個已知變體Sirt6.1、Sirt6.2在小鼠骨骼肌中較高表達，表達量隨著周齡增長而波動，表達量在第2周達到最高，隨年齡增長而下降，到第8周齡時出現(xiàn)回升的跡象；2、4周齡小鼠的骨骼肌中Sirt7基因表達量較高，6、8周齡小鼠的骨骼肌中Sirt7基因表達量較低，提示隨著小鼠年齡增加，Sirt7 基因表達水平逐漸降低。

本研究成功從雌雄小鼠骨骼肌中克隆得到Sirtuins家族成員的10種剪接體，并結合時空表達譜進行分析，為后期研究Sirtuins家族不同剪接體發(fā)揮的作用奠定了基礎。