戊型肝炎病毒基因3 型衣殼蛋白與Huh-7 細胞互作蛋白的篩選

梁 鵬，宋陽冉，連瑞雅，陳軼霞，李慧霞

（ 1. 西北民族大學生物醫(yī)學研究中心 生物工程與技術(shù)國家民委重點實驗室，甘肅 蘭州 730030 ； 2. 西北民族大學生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730030 ）

HEV基因3型中ORF2蛋白參與調(diào)節(jié)病毒的復制和增殖、裝配及與宿主蛋白互作，由于HEV的體外增殖困難且HEV 模式動物也是近年來的研究熱點，因而發(fā)掘與ORF2互作的宿主蛋白指導動物模型的構(gòu)建仍具有一定的科學意義。基于此，本研究利用免疫共沉淀和蛋白質(zhì)譜分析技術(shù)，結(jié)合生物信息學分析，篩選與ORF2蛋白相互作用的宿主蛋白，為探索動物與宿主之間的靶蛋白與ORF2 的互作及其參與HEV感染提供獸醫(yī)公共衛(wèi)生的預警體系，實現(xiàn)動物HEV的常態(tài)跟蹤和防控。

1 材料與方法

1.1 試劑與抗體

Not I 和Nhe I 兩種限制性內(nèi)切酶、高保真酶PrimeSTAR premix、T4-DNA連接酶和感受態(tài)細胞DH-5α均購自Takara公司；高敏ECL發(fā)光底物、5×轉(zhuǎn)膜緩沖液膜購自Bio-rad 公司；Lipofectamine 3000 購自Invitrogen 公司；Myc-Tag Mouse mAb鼠單克隆抗體購自生工生物工程（上海）公司；GAPDH 鼠多單克隆抗體購自北京全式金生物技術(shù)股份有限公司；銀染試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司；pCAGEN-myc空載、HEV Kernow C1/P6和Huh-7細胞均由生物工程與技術(shù)國家民委重點實驗室保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 ORF2真核表達載體的構(gòu)建與鑒定

以HEV Kernow C1/P6基因為模板，設(shè)計針對ORF2全長的特異性引物ORF2-F：5'-GTTGAGCAGAACCCGAAGAG-3'（下劃線為Not I 酶切位點），ORF2-R：5'-CGGGCTCAGTCAAGTAAAGC-3'（下劃線為Nhe I 酶切位點）。PCR 反應體系（50 μL）：ORF2-F 1 μL、ORF2-R 1 μL、PrimeSTAR premix(2X) 25 μL、P6 質(zhì)粒2 μL、DEPC水21 μL。

反應程序參照PrimeSTAR premix說明書推薦條件，利用瓊脂糖凝膠電泳回收PCR產(chǎn)物。限制性內(nèi)切酶Not I和Nhe I 分別酶切pCAGEN-myc 空載和PCR 回收產(chǎn)物，37℃，7～8 h；將兩種酶切產(chǎn)物分別回收后，利用T4 DNA Ligase進行連接反應：4 ℃、12 h；之后按照感受態(tài)使用說明書，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH-5α中，涂板至氨芐青霉素抗性細菌平板上，37 ℃、12～16 h；挑取單克隆菌落，依次進行菌液PCR鑒定和雙酶切鑒定，陽性菌液送至北京擎科生物科技有限公司測序。

1.2.2 Huh-7細胞轉(zhuǎn)染與表達鑒定

用10% FBS-DMEM 培養(yǎng)的Huh-7 細胞，經(jīng)胰酶消化后，以4×105個細胞/孔鋪至6 孔板中，待細胞密度生長至70%～80%，用Lip3000 轉(zhuǎn)染ORF2 重組質(zhì)粒（2 μg/孔），36～48 h 后離心收細胞，NP40 細胞裂解液（含蛋白酶抑制劑PMSF），冰上裂解20 min，低溫，12 000 g離心15 min，轉(zhuǎn)移上清，加入5×Loading Buffer，煮樣5 min，進行SDSPAGE 和Western blotting，Myc 標簽抗體用于檢測重組質(zhì)粒是否正確表達。

1.2.3 免疫共沉淀分析

想要讓學生的家長不擔心學生的學習成績，那么就需要教師能夠先給學生安排合理的時間，要讓學生學會合理地分配自己的業(yè)余時間，能夠讓學生學習足球技巧和學習理論知識兩個都不耽誤，并讓學生在成績穩(wěn)定的情況下，和學生家長協(xié)商，適當參加足球活動，并讓學生家長能正確地看待體育教學，了解體育教學的重要意義。還可以向?qū)W生家長介紹足球的價值，不僅能夠鍛煉身體，還能夠培養(yǎng)學生之間的團結(jié)力,是學生發(fā)展“德、智、體、美、勞”方面的重要基礎(chǔ)。

按上述操作方法進行細胞轉(zhuǎn)染，收集Huh-7 細胞，獲得細胞裂解上清；按照Protein G Agarose 使用說明書進行Co-IP 試驗，取10μL Protein G Agarose，加入5 μL Myc-Tag Mouse mAb 抗體，室溫孵育1 h；加細胞裂解液并充分混勻后，置于4 ℃翻轉(zhuǎn)搖床孵育過夜；2 500 r/min 離心5 min，棄去上清，同樣方法用PBS 洗滌5 次；最后加入20 μL PBS 和相應體積的Loading Buffer，制備蛋白樣品。以上均設(shè)置一個空載體對照組，ORF2 轉(zhuǎn)染設(shè)置3 個平行組（A、B和C）。

1.2.4 銀染試驗和蛋白質(zhì)譜分析

參照銀染試劑盒說明書進行銀染試驗，注意操作中一定要使用純水或超純水，以降低顯色背景顯色時間約為1～2 min，蛋白條帶出現(xiàn)后快速加入終止液，以防過曝；顯色后，切膠條，低溫保存，送上海中科新生命生物科技有限公司，利用QE 質(zhì)譜儀進行蛋白質(zhì)譜分析，MASCOT 等質(zhì)譜匹配軟件分析蛋白數(shù)據(jù)。

1.2.5 生物信息學分析

基于蛋白質(zhì)譜分析獲得的蛋白數(shù)據(jù)，利用Venny2.1.0分析對照組與試驗組的差異蛋白；將獲得的靶蛋白輸入STRING 蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)庫，進一步篩選與ORF2 互作的靶蛋白，篩選條件設(shè)置為：最低相互作用得分為高可信度0.7 分，數(shù)據(jù)來源為試驗驗證。將獲得蛋白序列號上傳至STRING 數(shù)據(jù)庫進行檢索，使用R（4.2.1）版本獲得網(wǎng)絡(luò)內(nèi)部的蛋白相互作用關(guān)系，綜合以上信息并使用Cytoscape 3.5.0軟件構(gòu)建相互作用蛋白網(wǎng)絡(luò)。

分別使用R軟件（4.2.1）版本語言包中的ggplot2[3.3.6]和cluster Profiler，對靶蛋白進行GO分析和KEGG分析，顯著性cut-off值一般設(shè)置為校正后P＜0.05，對富集分析結(jié)果進行可視化分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 pCAGEN-myc-ORF2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及其在Huh-7細胞中的表達鑒定（見圖1）

圖1 pCAGEN-myc-ORF2重組質(zhì)粒的構(gòu)建與表達鑒定Fig.1 Construction and expression identification of pCAGEN-myc-ORF2 recombinant plasmid

由圖1（a）可知，利用HEV Kernow C1/P6 質(zhì)粒為模板cDNA，通過PCR反應成功克隆出ORF2全長基因，與預期條帶大小接近（1 983 bp），且無非特異性擴增條帶。

由圖1（b）、圖1（c）可知，連接產(chǎn)物經(jīng)轉(zhuǎn)化挑菌后，菌液PCR鑒定發(fā)現(xiàn)，1、2、4、5均為陽性；提取質(zhì)粒后的雙酶切鑒定發(fā)現(xiàn)兩個克隆酶切條帶大小均合適，將兩個陽性菌液測序后，將測序正確的陽性克隆命名為pCAGEN-Myc-ORF2。

由圖1（d）可知，該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進Huh-7細胞后，Western blotting 鑒定發(fā)現(xiàn)pCAGEN-Myc-ORF2-1 成功表達，與預期條帶大小一致（72 kD）。

2.2 ORF2互作蛋白的篩選（見圖2、圖3）

圖2 免疫共沉淀產(chǎn)物銀染分析Fig.2 Silver staining analysis of CO-IP products

圖3 韋恩圖分析Fig.3 Wayne diagram analysis

由圖2可知，與對照組相比，試驗組KerORF2-A、B、C等3 條泳道均有多條差異條帶，并且3 個試驗組條帶基本一致。切膠進行蛋白質(zhì)譜分析后，利用MASCOT 等質(zhì)譜匹配軟件分析蛋白數(shù)據(jù)，分析獲得的不同組別的蛋白數(shù)據(jù)，將對照組和3個試驗組（KerORF2-A、B、C）蛋白的序列號（Acession No.）輸入Venny 2.1.0 中，經(jīng)韋恩分析最終得到37個潛在的互作蛋白（見圖3）。

2.3 生物信息學分析（見圖4、表1、圖5）

圖4 ORF2-Huh-7互作蛋白的互作網(wǎng)絡(luò)圖Fig.4 Interaction network diagram of ORF2-Huh-7 interacting proteins

圖5 GO和KEGG富集分析Fig.5 GO and KEGG enrichment analysis

通過R（4.2.1）軟件篩選互作蛋白并上傳STRING數(shù)據(jù)庫得到23 個蛋白的相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，發(fā)現(xiàn)這些蛋白之間存在復雜的互作關(guān)系（見圖4），如VDAC1、ENO1、HSP90AA1、RPL7/19/24 等。

由表1可知，23個靶蛋白主要參與了生物過程（BP）有27 個、涉及的細胞組分（CC）有27 種，以及相關(guān)分子功能（MF）9個；KEGG分析得到2個途徑與疾病/病毒相關(guān)。

使用R（4.2.1）版本中的ggplot2 包對GO 富集分析和KEGG 信號通路結(jié)果取前3 進行可視化，得到主要參與的BP：RNA 剪接的調(diào)控、細胞質(zhì)翻譯、端粒酶活性的調(diào)節(jié)；CC：胞質(zhì)核糖體、空泡腔、細胞質(zhì)大核糖體亞單位；MF：鈣黏蛋白結(jié)合、泛素-蛋白質(zhì)連接酶、蛋白質(zhì)連接酶結(jié)合中的泛素；KEGG：核糖體和新型冠狀病毒（見圖5）。

3 討論

探究病毒蛋白與宿主蛋白之間的相互作用，有助于揭示病毒的感染和致病機制，為提出新的抗病毒策略提供線索[7]。人HEV感染主要通過食用肉制品，HEV可在肝臟和膽汁中蓄積，也可在小腸及大腸內(nèi)增殖。動物HEV 與人HEV 的分割界限越來越模糊，且豬養(yǎng)殖數(shù)量大、養(yǎng)豬業(yè)的從業(yè)人員多等因素導致豬HEV成為主要的公共衛(wèi)生問題。目前研究多將豬作為HEV 的重要病毒庫，且近年來HEV的關(guān)鍵性作用靶點也是研究熱門；而且，HEV 在人群中造成規(guī)模流行需要經(jīng)過進一步的遺傳進化及宿主嗜性改變[8]。基于以上原因，本研究選擇豬作為研究對象。

由于HEV主要以無囊膜形式傳播，含有主要抗原表位的衣殼蛋白直接參與病毒對細胞的吸附和入侵[9]。近年來，為探索與病毒感染相關(guān)的宿主蛋白，針對ORF2與宿主蛋白的互作研究取得一定的進展[10]。研究發(fā)現(xiàn)，ORF2 可以與多種跨膜蛋白互作，參與HEV的吸附和入侵，如硫酸乙酰肝素蛋白（HSPG）[11]和脫唾液酸糖蛋白受體1/2（ASGR1/2）[12]；此外，ORF2 還與一些分子伴侶相關(guān)，如與熱休克蛋白90（HSP90）相互作用，參與HEV在細胞間的轉(zhuǎn)運[13]；ORF2過表達時，HSP72、HSP70B和HSP40等因子表達水平上調(diào)，猜測有利于HEV感染細胞抵抗凋亡[14]；ORF2也可競爭性地使因子Ikβ 與Cul1 和SKP1 的結(jié)合顯著減少，調(diào)節(jié)病毒的復制和增殖[15]。近期有研究發(fā)現(xiàn)，細胞周期調(diào)控蛋白42（CDC42）和Ras相關(guān)蛋白1b（Rap1b）直接結(jié)合ORF2，利用感染性克隆驗證發(fā)現(xiàn)上述兩種蛋白均在HEV 的早期感染階段發(fā)揮作用[16]。綜上，雖然眾多與ORF2 互作的宿主蛋白已被發(fā)現(xiàn)，但由于缺乏高效的體外培養(yǎng)體系等原因，已有相關(guān)研究大多未能揭示其在HEV感染中的具體作用機制[11]，且決定HEV感染的關(guān)鍵受體蛋白尚未被發(fā)現(xiàn)。因此，探索與ORF2 互作的宿主蛋白仍具有一定的科學意義，既能夠發(fā)現(xiàn)新的參與HEV感染的宿主細胞蛋白，也有望篩選到HEV感染的關(guān)鍵受體。

本研究構(gòu)建HEV ORF2真核表達質(zhì)粒，并成功表達于HEV 易感細胞系-Huh-7 細胞中，模擬了病毒感染的細胞內(nèi)環(huán)境下ORF2的表達，利用免疫共沉淀-蛋白質(zhì)譜技術(shù)，初步獲得與ORF2互作的37個細胞蛋白，生物信息學分析結(jié)果表明，其中23個靶蛋白存在復雜的互作網(wǎng)絡(luò)關(guān)系；這些蛋白多參與眾多細胞器的合成，參與RNA剪接的調(diào)控、細胞質(zhì)翻譯等生物過程，參與胞質(zhì)核糖體、空泡腔等細胞器的合成，同時也在如鈣黏蛋白結(jié)合、泛素-蛋白質(zhì)連接酶等功能中發(fā)揮作用，并且影響核糖體合成途徑、參與新型冠狀病毒感染等。

Tian 等[10]和Subramani 等[11]分別利用酵母雙雜交技術(shù)篩選與ORF2 互作蛋白，前者主要針對基因1 型和4 型HEV 毒株，與本研究所篩選到的靶蛋白幾乎無重疊，僅有相同蛋白家族的ACTG1。而后者針對基因1 型和3 型HEV 毒株，篩選到的ORF2 互作蛋白僅有兩個：PCBP1 和RPL29；RPL29 與本研究中篩選到的RPL7/19/24 屬于同類蛋白。本研究篩選獲得了23個靶蛋白，為ORF2互作蛋白的數(shù)據(jù)庫填補了空白。其中VDAC1、ENO1和HSP90AA1等蛋白均參與病毒的感染過程[17-19]，VDAC1、BAG2 和PSMB4等蛋白與癌癥相關(guān)[20-22]，推測可能與本試驗選取的宿主細胞Huh-7是肝癌細胞相關(guān)。本研究HEV 基因型的靶向蛋白提供了依據(jù)，為后續(xù)攻克病毒至關(guān)藥物靶點提供科學解釋。

4 結(jié)論

本研究使HEV ORF2 的重組質(zhì)粒成功表達于Huh-7細胞中，經(jīng)免疫共沉淀分析、銀染和蛋白質(zhì)譜分析獲得37 個靶蛋白，生物信息學分析其涉及的細胞成分、通路途徑和疾病與病毒的關(guān)系，為后續(xù)深入研究其他HEV基因型以及動物與宿主間的細胞蛋白與ORF2 的互作及其在HEV感染中的分子機制及獸用藥物靶點提供了一定參考。