利用CRISPR/Cas9 技術(shù)構(gòu)建G3BP2 基因缺失型BHK21 細胞系

陳琳暉，屈春惠，王世民

（ 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052 ）

基因編輯是一種針對基因組和轉(zhuǎn)錄本進行精確修改的技術(shù)，通過核酸酶在基因組的特定位置形成特異性雙鏈斷裂，生物體會通過非同源末端連接或同源重組修復(fù)斷裂雙鏈[1]。成簇規(guī)律的間隔短回文重復(fù)序列（CRISPR）及相關(guān)蛋白酶9（Cas9）構(gòu)成的CRISPR-Cas9 系統(tǒng)是目前最常用的基因編輯技術(shù)，通過特異性的單向?qū)NA（sgRNA）序列，引導(dǎo)Cas9 蛋白特異結(jié)合到靶序列處行使DNA 切割功能[2-3]，已廣泛應(yīng)用于各行業(yè)并展現(xiàn)出巨大的潛力[4-5]。當(dāng)細胞受到外界影響，如氧化應(yīng)激、熱休克、病毒感染、紫外線照射時，胞質(zhì)中會產(chǎn)生致密的顆粒樣結(jié)構(gòu)，這種物質(zhì)被稱為應(yīng)激顆粒（SGs）[6]。SG 主要由RNA 結(jié)合蛋白、T 細胞胞質(zhì)內(nèi)抗原1（TIA-1）、GTPase 活化蛋白SH3 結(jié)構(gòu)域結(jié)合蛋白（G3BP）等成分構(gòu)成[7]。近年來，一些研究表明，宿主細胞被病毒感染可產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)形成SG，阻止病毒蛋白的翻譯，抑制病毒復(fù)制[8]。

目前，圍繞其中G3BPs的功能研究主要集中于腫瘤以及應(yīng)激顆粒，G3BP 也作為應(yīng)激顆粒蛋白被人們所熟知[9-11]。G3BP基因在1996年首次通過與Ras-GAP的SH3結(jié)構(gòu)域的共免疫沉淀被鑒定出來[12]，同年從小鼠中分離出第二個與G3BP具有高度同源性的基因[13]，這兩個基因按照被發(fā)現(xiàn)的順序排列被稱為G3BP1 和G3BP2[14-15]。G3BPs主要在RNA 加工和信號傳導(dǎo)方面起到作用[16]。作為G3BPs蛋白家族成員，G3BP1 和G3BP2 雖然具有相似的功能，但也各具組織特異性表達?；诖?，本研究建立穩(wěn)定的G3BP2 缺失型BHK21 細胞系，并驗證其對細胞抗應(yīng)激的影響，以期為細胞天然免疫的進一步研究以及研制相關(guān)病毒的疫苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 細胞株、菌種和質(zhì)粒本試驗所用BHK-21 細胞、DH5α 感受態(tài)細胞、pX459載體新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物與免疫學(xué)實驗室保存。

1.1.2 試劑、引物與儀器

質(zhì)粒提取試劑盒（TIANGEN 公司）；DNA 提取試劑盒（Omega 公司）；Bbs Ⅰ酶、T4 連接酶（賽默飛公司）；2×taq plus master mix、lipo 8000 轉(zhuǎn)染試劑、CCK-8、T7 核酸內(nèi)切酶Ⅰ（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；GAPDH 一抗、G3BP2一抗、山羊抗兔IgG二抗（Bioss公司）。PCR引物由擎科生物科技有限公司合成。

SCI1000-G PCR儀（美國SCILOGEX公司）；垂直超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司）；恒溫培養(yǎng)搖床、C02細胞培養(yǎng)箱（美國Thermo公司）；光學(xué)顯微鏡（尼康有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 sgRNA的設(shè)計和寡核苷酸鏈的合成

根據(jù)NCBI 數(shù)據(jù)庫獲得G3BP2 基因序列，針對G3BP2基因的兩個外顯子設(shè)計兩對sg RNA，送南京擎科生物有限公司合成。利用在線設(shè)計網(wǎng)站（http://crispor.tefor.net/）分析得出具體sg RNA得分后，選擇得分較高的第1個外顯子中的一個sg RNA（sg RNA1）和第2 個外顯子中的一個sg RNA（sg RNA2）共兩組作為備選序列。所選擇的兩個外顯子均處于所有轉(zhuǎn)錄本的共有區(qū)域并且位置靠前，可確保試驗過程中能夠?qū)3BP2基因的所有轉(zhuǎn)錄本進行編輯。在模板的5'端添加CACC，反義鏈模板的3'端添加AAAC，形成與Bbs Ⅰ酶的黏性末端互補的末端，設(shè)計相對應(yīng)的敲除鑒定引物，引物信息見表1。

表1 引物信息Tab.1 Primer information

1.2.2 敲除載體構(gòu)建

使用Bbs Ⅰ限制性內(nèi)切酶切割常用于基因編輯的線性化質(zhì)粒pX459，并按照凝膠回收試劑盒說明書進行切膠回收。之后將設(shè)計的兩對sg RNA分別構(gòu)建到pX459載體上，將退火后的寡核苷酸雙鏈連接上線性化的pX459 載體，轉(zhuǎn)化后挑取單克隆菌落培養(yǎng)提質(zhì)粒。

退火體系：將合成的引物稀釋成濃度為100 μmol/L，各取5 μL的正反鏈引物溶液。

退火程序：95 ℃ 5 min，室溫10 min，冰浴5 min。

連接體系：線性化pX459質(zhì)粒4 μL、雙鏈sg RNA引物2 μL、10×T4 DNA 連接酶緩沖液1 μL、T4 DNA 連接酶1 μL，補水至10 μL；16 °C過夜。

連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化于DH5α 感受態(tài)細胞中，涂布于氨芐抗性固體平板上，37 °C 培養(yǎng)過夜。挑取單菌落擴大培養(yǎng)后作為模板進行菌液PCR，核酸膠驗證后，選取陽性克隆送南京擎科生物科技有限公司測序。

1.2.3 敲除載體驗證

將BHK-21細胞接種于6孔板，第2 d待細胞長至80%融合度時，將2 條重組質(zhì)粒G3BP2-sgRNA 分別轉(zhuǎn)染BHK2-1 細胞，轉(zhuǎn)染過程嚴格按照說明書進行。轉(zhuǎn)染24 h后添加嘌呤霉素，使其終濃度為20 mg/L。在該濃度嘌呤霉素作用下，未轉(zhuǎn)染的細胞會被殺死，之后每天按照該濃度進行換液培養(yǎng)，進行為期7 d 的細胞篩選。取各自存活的部分細胞用于基因組檢測，檢測引物信息見表1。另一部分細胞使用T7 核酸內(nèi)切酶Ⅰ酶切驗證，選出效果最好的sgRNA重組質(zhì)粒用于穩(wěn)定敲除細胞株篩選。

1.2.4 穩(wěn)定敲除細胞的篩選

使用胰酶消化細胞并進行無限稀釋，接種至96孔板培養(yǎng)，將sgRNA1與sgRNA2共轉(zhuǎn)染BHK21細胞，24 h后使用20 mg/L 嘌呤霉素篩選，培養(yǎng)基中嘌呤霉素的濃度可下調(diào)至原濃度的一半，細胞不再大量死亡后待細胞長成單克隆細胞群落，取部分細胞用于基因組檢測。將有切割修復(fù)效果的單克隆細胞長成細胞團后擴大培養(yǎng)，收集部分單克隆細胞和正常細胞，提取細胞總蛋白進行蛋白質(zhì)印跡技術(shù)（WB）檢測G3BP2蛋白表達量，選擇幾乎不表達G3BP2的細胞株繼續(xù)傳代培養(yǎng)。將有切割修復(fù)效果及G3BP2 蛋白不表達的單克隆細胞最終轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶中穩(wěn)定傳代培養(yǎng)。

將2 μmol/L 的二硫蘇糖醇（DTT）加入G3BP2-/-細胞株和野生型細胞株中1 h 后鏡檢觀察，以此評估該構(gòu)建細胞系的抗應(yīng)激能力。將野生型BHK21 細胞與G3BP2-/-細胞于45 ℃的環(huán)境下同樣放置1 h，1 h后在顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，以此測試G3BP2-/-細胞對熱應(yīng)激的反應(yīng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 G3BP2-sgRNA載體的構(gòu)建

針對G3BP2 基因的兩個外顯子設(shè)計并合成兩對sgRNA，結(jié)果見圖1（a）；將兩對sgRNA 分別構(gòu)建到pX459載體上，轉(zhuǎn)化后挑取單克隆菌落培養(yǎng)提質(zhì)粒送至公司測序，測序結(jié)果完全正確，結(jié)果見圖1（b）。重組載體分別命名為：G3BP2-sgRNA1、G3BP2-sgRNA2。

圖1 G3BP2-sgRNA載體的構(gòu)建Fig.1 Construction of G3BP2-sgRNA vector

2.2 G3BP2-sg RNA 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BHK21 細胞的驗證結(jié)果（見圖2）

圖2 G3BP2-sg RNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BHK21細胞驗證結(jié)果Fig.2 Results of transfection of G3BP2-sg RNA plasmid into BHK21 cells

由圖2 可知，將重組質(zhì)粒分別瞬時轉(zhuǎn)染BHK21 細胞，嘌呤霉素篩選，提取細胞基因組DNA 后使用T7核酸內(nèi)切酶Ⅰ酶切和測序。序列比對結(jié)果顯示，sgRNA靶位點處存在雜峰。上述結(jié)果表明，重組質(zhì)粒具有敲除效果。

2.3 穩(wěn)定敲除G3BP2基因的BHK21細胞系篩選（見圖3）

圖3 穩(wěn)定敲除G3BP2基因的BHK21細胞系篩選Fig.3 BHK21 cell line screening with stable knockout of G3BP2 gene

試驗共篩選近60株細胞，最后得到7株細胞，將這7株細胞繼續(xù)傳代培養(yǎng)以檢測敲除穩(wěn)定性，在傳代培養(yǎng)至十代后提取蛋白進行WB檢測，結(jié)果見圖3（a）。

由圖3（a）可知，有3 株細胞（D9、F8、G9）恢復(fù)了G3BP2蛋白表達，但蛋白表達量仍顯著低于野生型細胞的蛋白表達；有3 株細胞（C8、E10、F9）仍幾乎不表達G3BP2蛋白，表明這3 株細胞敲除穩(wěn)定性良好；而E8 細胞株雖然未表現(xiàn)出蛋白表達，但其在大于70 kD附近存在背景，不排除是非特異性結(jié)合。

之后提取C8、E10、F9細胞株的DNA進行PCR擴增及測序，結(jié)果顯示，敲除細胞株與野生型細胞株相比發(fā)生了約220 bp 大小的堿基片段缺失，結(jié)果見圖3（b）。結(jié)果表明，經(jīng)基因敲除及篩選成功生成了3株G3BP2-/-細胞株。

2.4 敲除G3BP2對細胞應(yīng)激的影響（見圖4）

圖4 敲除G3BP2對細胞應(yīng)激的影響Fig.4 Effect of G3BP2 knockdown on cellular stress

由圖4 可知，與野生型BHK21 相比，缺失G3BP2 基因的BHK21細胞對外界環(huán)境的變化更敏感。在正常情況下BHK21 的細胞形態(tài)為梭形，使用DTT 溶液處理細胞1 h后，缺失G3BP2 基因的BHK21 細胞會縮成近圓形并且細胞膜結(jié)構(gòu)不明顯；而野生型的BHK21 細胞仍能夠較好地保持梭形的細胞形態(tài)，并與正常細胞形態(tài)差別不大。即使在PBS 孵育的條件下，缺失G3BP2 基因的BHK21 細胞形態(tài)更易受到影響而變成圓形，而野生型BHK21 的細胞形態(tài)幾乎不發(fā)生改變。

之后測試G3BP2-/-細胞對熱應(yīng)激的反應(yīng)，結(jié)果顯示，顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，與野生型細胞相比，G3BP2-/-細胞抵御熱應(yīng)激的能力更弱，表現(xiàn)為細胞發(fā)生了聚集、團塊化并且大量細胞脫落不再貼壁；而野生型細胞大部分仍可維持貼壁。雖然有研究稱，敲低G3BP2不會影響熱應(yīng)激形成的應(yīng)激顆粒的數(shù)量[17]，但從眼觀細胞表征來看，不論是DTT 造成的應(yīng)激還是熱應(yīng)激，G3BP2-/-均表現(xiàn)出低抵抗性。

3 討論

帶有熒光標簽的EHV-IgD囊膜蛋白表達質(zhì)粒會使細胞產(chǎn)生熒光斑點。對與gD囊膜蛋白互作的宿主蛋白進一步研究后，本研究猜測產(chǎn)生的熒光斑點為應(yīng)激顆粒。G3BP1與G3BP2均是參與應(yīng)激顆粒形成的蛋白，且均可與gD 囊膜蛋白發(fā)生相互作用。但有研究表明，敲除G3BP1的小鼠表現(xiàn)出胚胎致死性[18]，因而本試驗選擇對G3BP2進行研究。G3BP2 具有兩種亞型，分別是G3BP2a 和G3BP2b[15,19]，在WB 檢測中有時會出現(xiàn)兩個條帶，分析原因可能與裂解液的強弱以及裂解液的時間長短有關(guān)。本研究使用CRISPR-Cas9 系統(tǒng)對編輯該蛋白的基因進行敲除，針對G3BP2 的兩個外顯子分別設(shè)計了一對sgRNA，使用sgRNA設(shè)計網(wǎng)站（http://crispor.tefor.net/），選擇評分高且脫靶率較低的sgRNA構(gòu)建到PX459載體上；該載體可表達Cas9 蛋白，并帶有嘌呤霉素抗性，轉(zhuǎn)染后可使用嘌呤霉素篩選陽性細胞。

本研究先使用單gRNA進行敲除，單克隆篩選后進行WB 檢測，發(fā)現(xiàn)篩選出的細胞株仍能夠表達G3BP2 蛋白，測序結(jié)果也顯示堿基雖然發(fā)生了缺失但并未造成移碼突變。為提高敲除效果，本研究采取雙gRNA共轉(zhuǎn)染產(chǎn)生片段基因敲除的方式，即將兩個帶有sgRNA的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入BHK21 細胞，再重復(fù)之前的篩選步驟。DNA 進行核酸膠電泳成像后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，部分細胞株不止一個條帶，其原因可能與二倍體有關(guān)。此前，本課題組也曾針對DNA 電泳出現(xiàn)兩條帶的細胞進行二次單克隆篩選，發(fā)現(xiàn)篩選出的細胞仍為兩條帶。結(jié)果表明，sgRNA可能在兩條染色體上發(fā)生了不同的切割，或與DNA 自身隨機修復(fù)有關(guān)。本試驗將幾乎不表達G3BP2蛋白的細胞株繼續(xù)培養(yǎng)數(shù)代后，檢測這種敲除的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，有3株細胞恢復(fù)了蛋白表達，但G3BP2 的表達量仍低于野生型BHK21 細胞。有一株細胞在非目的大小附近出現(xiàn)了條帶，可能屬于抗體非特異性結(jié)合，結(jié)果成功篩選出幾乎不表達G3BP2蛋白的三株細胞，并且敲除穩(wěn)定性良好。

隨后本研究使用DTT對G3BP-/-細胞的抗應(yīng)激能力進行檢測[20]，結(jié)果顯示，在相同濃度、處理時間及細胞密度的條件下，經(jīng)藥物處理后，部分G3BP2-/-細胞形態(tài)變圓，部分細胞發(fā)生了凋亡，大部分細胞膜結(jié)構(gòu)不再清晰；而野生型細胞的形態(tài)表型幾乎不發(fā)生變化。之后使用熱應(yīng)激測試了細胞，發(fā)現(xiàn)熱應(yīng)激同樣會對G3BP2-/-細胞造成損傷，使其發(fā)生明顯的表征變化。上述研究結(jié)果表明，G3BP2-/-細胞的抗應(yīng)激能力明顯弱于野生型細胞，這可能與G3BP2蛋白參與細胞抗應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)，缺失G3BP2會導(dǎo)致細胞對無法抵抗多種應(yīng)激。雖然G3BP2 可能不參與熱休克途徑的應(yīng)激顆粒的形成[21-22]，但缺失G3BP2的細胞抗應(yīng)激能力顯著減弱，表明G3BP2本身可能并不單純僅依靠形成應(yīng)激顆粒保護細胞。

4 結(jié)論

本研究利用CRISPR/Cas9 技術(shù)成功構(gòu)建了PX459-G3BP2-sgRNA 重組質(zhì)粒，并最終得到了穩(wěn)定的G3BP2-/-細胞系，并通過WB試驗在蛋白水平上驗證其敲除效率并且驗證了其生物學(xué)功能。