3 株乳酸菌復(fù)合發(fā)酵制備的后生元對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的抑菌活性及機(jī)制

蘭冬雪，瞿茜楠，于浩東，黃 天，彭傳濤，姚國(guó)強(qiáng)，趙金山，李兆杰,*

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島 266109；2.青島特種食品研究院，山東青島 266109；3.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018）

根據(jù)國(guó)際益生菌和益生元科學(xué)協(xié)會(huì)（ISAPP）2021 年發(fā)布的后生元共識(shí)聲明，后生元是指“對(duì)宿主健康有益的無(wú)生命微生物和/或其成分的制劑”[1]。后生元含有多種活性成分，包括肽聚糖、磷壁酸等菌體成分，以及維生素、有機(jī)酸、細(xì)菌素、短鏈脂肪酸、酶和氨基酸等活性代謝產(chǎn)物[1]。根據(jù)微生物的類型、菌株和代謝產(chǎn)物的不同，后生元的效果也不同[2]。使用后生元有助于改善健康，已有研究表明，后生元具有免疫調(diào)節(jié)、預(yù)防感染、抗菌、抗病毒、抗氧化、抗肥胖、抗糖尿病、抗高血壓、抗增殖、抗突變、抗腫瘤和減少食物過(guò)敏等作用[3-5]。后生元在宿主體內(nèi)發(fā)揮預(yù)防和治療雙重作用，臨床上使用后生元來(lái)緩解一系列疾病的癥狀，如嬰兒絞痛、成人特應(yīng)性皮炎和腹瀉等。除具有多種功效外，后生元還具有多種優(yōu)勢(shì)：一是具有更高的安全性。后生元對(duì)一些特殊人群如新生兒、腸道手術(shù)人群以及一些敏感人群同樣適應(yīng)，而且后生元不受抗生素的干擾抑制，沒(méi)有傳遞耐藥基因風(fēng)險(xiǎn)；二是具有更高的穩(wěn)定性。后生元可以耐受高溫、氧氣等環(huán)境，因此具有更長(zhǎng)的保質(zhì)期，運(yùn)輸儲(chǔ)存也更方便；三是具有更廣泛的作用靶點(diǎn)，不僅限于腸道，口腔、皮膚、泌尿生殖道或鼻咽等都可作為后生元的靶點(diǎn)，而且更易于被腸道吸收，提高利用率。后生元因其清晰的化學(xué)結(jié)構(gòu)和安全劑量參數(shù)等，被認(rèn)為是天然的免疫刺激劑、抗炎劑、抗氧化劑、抗菌劑以及生長(zhǎng)促進(jìn)劑[6]。

根據(jù)ISAPP 對(duì)后生元的定義，后生元不是單一的或純化的化合物，是由多種活性成分組成的混合物。因此后生元通常是作為一個(gè)整體進(jìn)行研究和開(kāi)發(fā)應(yīng)用。盡管如此，對(duì)其活性成分的解析、作用機(jī)制的研究仍是后生元研究的一個(gè)重要方向，這將為后生元的進(jìn)一步研究和產(chǎn)業(yè)化提供重要的理論和科學(xué)依據(jù)。以抑菌功能后生元為例，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，后生元中發(fā)揮抑菌作用的成分有胞外多糖、細(xì)菌素、有機(jī)酸等，對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、大腸桿菌、鼠傷寒沙門(mén)氏菌、銅綠假單胞菌等常見(jiàn)的致病菌具有較好的抑菌效果[7-8]。李書(shū)鴻等[9]通過(guò)對(duì)植物乳桿菌代謝產(chǎn)物的研究發(fā)現(xiàn)，其抑菌活性與植物乳桿菌菌株、病原指示菌及發(fā)酵碳源相關(guān)，且受上清液低pH 的影響，其中主要的抑菌物質(zhì)有機(jī)酸。研究發(fā)現(xiàn)由鼠李糖乳桿菌L. 1.0320 中純化出細(xì)菌素1.0320 在靶細(xì)胞細(xì)胞膜上形成孔洞，增加細(xì)胞膜通透性，增加質(zhì)子動(dòng)力勢(shì)PMF（proton motive force）的耗散，破壞細(xì)胞膜的完整性，導(dǎo)致胞內(nèi)內(nèi)容物流出，誘導(dǎo)細(xì)菌死亡[10]。從微生物滅活方式來(lái)看，目前，制備后生元的方法通常有熱處理、γ或紫外線照射、酶處理、超聲處理、高壓處理、溶劑萃取或它們的組合進(jìn)行裂解等。大多數(shù)情況下，熱處理是滅活益生菌菌體的常用方法，但作用時(shí)間和溫度因微生物種類不同而不同，還取決于微生物自身的耐熱性[11]。此外，2 株或者多株菌共發(fā)酵時(shí)不同菌株間會(huì)存在互作關(guān)系，從而引起菌株代謝活動(dòng)發(fā)生變化[12-13]，這給特定功能后生元的制備提供了思路。

近年來(lái)，抗生素耐藥性的出現(xiàn)導(dǎo)致治療失敗的風(fēng)險(xiǎn)增加、復(fù)發(fā)和醫(yī)療保健系統(tǒng)成本增加[14]。耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）菌株是最常見(jiàn)的抗生素耐藥菌之一，對(duì)大多數(shù)β-內(nèi)酰胺類抗生素具有耐藥性，包括甲氧西林、青霉素、碳青霉烯類、頭孢菌素類及其衍生物。由于其分布廣泛且具有多重耐藥性，已成為令人擔(dān)憂的超級(jí)細(xì)菌[15-16]。此外，MRSA還是一種常見(jiàn)的皮膚化膿感染致病菌，易通過(guò)接觸傳播形成流行傳播，引起敗血癥、膿毒血癥等疾病。MRSA 可形成具有保護(hù)作用的生物膜，阻擋抗菌劑，產(chǎn)生耐藥性，使治療效果變差。生物膜是附著在表面的微生物群落，它們由胞外聚合物基質(zhì)的結(jié)構(gòu)支持，該基質(zhì)包含一種或多種胞外多糖、蛋白質(zhì)和DNA，在細(xì)菌感染的持續(xù)存在中起重要作用[17]。MRSA 生物膜的存在致使其致病性和耐藥性增加，因此開(kāi)發(fā)針對(duì)MRSA 的綠色、不產(chǎn)生耐藥性的天然抗菌制劑成為解決MRSA 致病性及耐藥性的關(guān)鍵。

因此，本研究擬通過(guò)多株益生菌復(fù)合發(fā)酵，制備一種對(duì)MRSA 具有抑菌活性的后生元，研究其對(duì)MRSA 的抑菌活性及對(duì)MRSA 生物膜的影響，并探究其抑菌作用機(jī)制，為后生元在食品、醫(yī)療中使用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

乳酸乳球菌乳亞種Postbio-F3、副干酪乳酪桿菌Postbio-P6、發(fā)酵粘液乳桿菌Postbio-Q7 來(lái)自青島農(nóng)業(yè)大學(xué)益生菌與后生元基礎(chǔ)研究與開(kāi)發(fā)應(yīng)用創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)室乳酸菌菌種庫(kù)；耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）ATCC 43300 美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)；甲氧西林 北京百奧萊博科技有限公司；LB 肉湯培養(yǎng)基、MRS 肉湯培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（NA） 青島海博生物技術(shù)有限公司；活性氧檢測(cè)試劑盒 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；胃蛋白酶（酶活力3 U/mg）、木瓜蛋白酶（酶活力600 U/mg）、蛋白酶K（酶活力30 U/mg）、胰蛋白酶（酶活力10 U/mg）、淀粉酶（酶活力100 U/mg）、脂肪酶（酶活力350 U/mg）TaKaRa 公司。

SU5000 掃描電子顯微鏡 株式會(huì)社日立制作所；TU-1810 型可見(jiàn)分光光度計(jì) 普析通用公司；Centrifuge 5810R 型冷凍離心機(jī) 艾本德公司；CLC111ECO 型恒溫培養(yǎng)箱 MMM Medcenter Einrichtungen GmbH 公司；CMax Plus 酶標(biāo)儀 美國(guó)MD 公司；SCIENTZ-WSQ 型全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀 寧波新芝生物科技股份有限公司；Supcre G10 型全自動(dòng)菌落分析儀 杭州迅數(shù)科技有限公司；BD FACSCalibur 流式細(xì)胞儀 美國(guó)BD 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 具有抑菌功能的后生元的制備 參考文獻(xiàn)[18-19]報(bào)道方法并適當(dāng)修改進(jìn)行后生元的制備。將副干酪乳酪桿菌Postbio-P6、發(fā)酵粘液乳桿菌Postbio-Q7、乳酸乳球菌乳亞種Postbio-F3 按2%接種量分別接種MRS 液體培養(yǎng)基進(jìn)行活化，培養(yǎng)條件為37 ℃好氧發(fā)酵24 h，pH 約3.8。將活化培養(yǎng)物按2%接種量分別接種MRS 液體培養(yǎng)基進(jìn)行二代培養(yǎng)，培養(yǎng)條件同上。將二代培養(yǎng)物分別按3%、2%、3%接種量接種同一MRS 液體培養(yǎng)基進(jìn)行復(fù)合發(fā)酵，發(fā)酵條件為37 ℃，好氧發(fā)酵24 h。發(fā)酵結(jié)束后首先進(jìn)行鏡檢，通過(guò)菌落形態(tài)判斷菌的增殖情況，然后將培養(yǎng)液于121 ℃高溫高壓滅菌30 min，通過(guò)菌落計(jì)數(shù)法確認(rèn)是否完全滅活，將制備的后生元于-20 ℃保存?zhèn)溆?。此外，通過(guò)測(cè)試3 種菌不同接種量下的抑菌活性，篩選確定3 種菌的最佳接種量。

1.2.2 抑菌實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 抑菌圈 將MRSA 接種到LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)16 h 活化備用。將最佳接種量條件下制備的后生元8000 r/min 離心10 min，分別收集上清液和沉淀（滅活菌體），上清液過(guò)0.22 μm 濾膜，沉淀用等量無(wú)菌水重懸。采用抑菌圈法分別驗(yàn)證后生元的上清液、沉淀以及未經(jīng)離心的混合液對(duì)MRSA的抑菌活性。MRSA 用生理鹽水稀釋107CFU/mL的菌液后，吸取20 μL 菌液加入到30 mL 未凝固的LB 培養(yǎng)基（45 ℃以下）中，充分混勻后傾注到培養(yǎng)皿中。待培養(yǎng)基凝固后，用打孔器在培養(yǎng)基上打直徑為 8 mm 的小孔。吸取上述后生元 200 μL 到瓊脂孔，做3 個(gè)重復(fù)，對(duì)照孔加等量PBS（pH7.4，0.01 mol/L）。將培養(yǎng)皿置于4 ℃擴(kuò)散4 h 后放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h，測(cè)量抑菌圈的大小[20-21]。

1.2.2.2 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定 將MRSA 用生理鹽水稀釋成1×105CFU/mL 的菌液，分別吸取100 μL 菌液加入到48 孔板的5 個(gè)孔中，然后吸取100 μL 濃度為12.5%、25%、50%和100%的YDFF 分別加入到孔中，對(duì)照孔中用等量PBS（pH7.4）代替，最后向每個(gè)孔中加入800 μL LB 培養(yǎng)基，組成1 mL 的培養(yǎng)體系，每個(gè)樣品做3 個(gè)重復(fù)，37 ℃下振蕩培養(yǎng)，每隔1 h 使用微生物生長(zhǎng)曲線分析儀測(cè)量OD600值，24 h后對(duì)所有結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并繪制成圖。

1.2.3 后生元YDFF 對(duì)MRSA 的抑菌特性

1.2.3.1 酶對(duì)后生元YDFF 抑菌活性的影響 分別配置10 mg/mL 的胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶K、胰蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶溶液，與后生元按1:9混合，使酶的終濃度為1mg/mL。分別在酶最適宜pH 下置于 37 ℃水浴反應(yīng)30 min，用相同體積的水與后生元混合作為對(duì)照，然后通過(guò)抑菌圈法測(cè)定各種酶對(duì)抑菌活性的影響。

1.2.3.2 pH 對(duì)后生元YDFF 抑菌活性的影響 用5 mol/L 的NaOH 和5 mol/L 的HCl 分別將后生元YDFF 的pH 調(diào)至3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，按照1.2.2.1 的方法進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，測(cè)量并記錄抑菌圈直徑，分別測(cè)試不同pH 對(duì) YDFF 抑菌活性的影響。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇合適的pH 用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3.3 后生元YDFF 中胞外多糖的抑菌活性判斷參考文獻(xiàn)[22]的方法，采用乙醇沉淀法對(duì)后生元YDFF 中的胞外多糖進(jìn)行粗提。在后生元（pH7.0）中加入終濃度為 10%（質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)）的三氯乙酸，充分混合，4 ℃靜置過(guò)夜以沉淀蛋白，然后 4 ℃、12000 r/min 離心15 min 取上清，慢慢加3 倍體積的冰乙醇，4 ℃靜置24 h，沉淀多糖。4 ℃、12000 r/min離心15 min 棄上清液，收集沉淀，揮發(fā)去除沉淀中的乙醇后進(jìn)行冷凍干燥，得到胞外粗多糖提取物。配置12.5%、25%、50%胞外多糖溶液，通過(guò)抑菌圈法測(cè)試不同濃度胞外多糖的抑菌活性。

1.2.4 后生元YDFF 對(duì)MRSA 的抑菌機(jī)制

1.2.4.1 后生元YDFF 對(duì)MRSA 生物膜形成的影響參考文獻(xiàn)[23]方法，通過(guò)結(jié)晶紫染色法測(cè)定后生元YDFF 對(duì)MRSA 生物膜形成的抑制作用。具體步驟如下：在96 孔平底培養(yǎng)板中每孔加入100 μL濃度為106CFU/mL 的MRSA 菌懸液和100 μL 濃度為25%、50%和100%的YDFF（pH7.0），對(duì)照組中加入等量的水，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h 后，除凈上層培養(yǎng)基以及游離細(xì)菌，用200 μL PBS 清洗3 次，再添加 200 μL 0.4%結(jié)晶紫染色15 min，吸走結(jié)晶紫；用無(wú)菌水清洗3 次洗去浮色，待干燥后用30%醋酸溶液脫色，用酶標(biāo)儀測(cè)定OD600，按照以下公式計(jì)算后生元YDFF 對(duì)MRSA 生物膜形成的抑制率。

式中：ODc為對(duì)照組OD 值： ODt為后生元處理組的OD 值。

1.2.4.2 后生元YDFF 對(duì)MRSA 形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響將MRSA 活化并稀釋至106～107CFU/mL，8000 r/min，離心10 min，用PBS 清洗3 次，除凈上清液，加入100 μL 濃度100%的后生元YDFF（pH7.0），對(duì)照組加入等量的水。置于37 ℃水浴鍋30 min 后，8000 r/min，離心10 min 收集沉淀，用PBS 清洗3 次，除凈上清液，用 2.5% 的戊二醛溶液 4 ℃固定24 h；8000 r/min，離心10 min，用PBS 洗滌3 次，除凈上清液；用濃度遞增的乙醇（30%、50%、70%、80%、90%及100%）依次進(jìn)行梯度脫水，脫水后對(duì)菌體細(xì)胞進(jìn)行真空冷凍干燥，干燥后進(jìn)行噴金包被，掃描電子顯微鏡觀察細(xì)菌的細(xì)胞形態(tài)變化[24-25]。

1.2.4.3 后生元YDFF 對(duì)MRSA 胞內(nèi)DNA 泄漏的影響 根據(jù)Yin 等[26]的方法，將MRSA 活化并稀釋至106～107CFU/mL 后，8000 r/min，離心10 min，用PBS 清洗3 次，除凈上清液，分別加入100 μL 濃度為25%、50%、100%的后生元YDFF（pH7.0），對(duì)照組加入等量的水。置于37 ℃水浴30 min 后，利用紫外分光光度計(jì)，通過(guò)比較陰性對(duì)照與后生元處理過(guò)后的MRSA 在260 nm 波長(zhǎng)下吸光度值的變化，檢測(cè)后生元處理MRSA 后的DNA 泄漏情況。

1.2.4.4 后生元YDFF 對(duì)MRSA 胞內(nèi)ROS 產(chǎn)生的影響 采用活性氧檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。試劑盒中的探針2',7'-二氯二氫熒光素二乙酸酯（H2DCF-DA）可以與細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的ROS 反應(yīng)生成熒光素，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光素的熒光強(qiáng)度即可間接檢測(cè)ROS 的產(chǎn)量[27]。離心收集106～107CFU/mL 的MRSA菌體，用 PBS 清洗3 次后重懸于 900 μL PBS 中，分別加入100 μL 濃度為25%、50%和100%的后生元YDFF（pH7.0），37 ℃水浴 30 min，未處理組用水做對(duì)照，分別加入終濃度為 10 mmol/L H2DCF-DA 37 ℃避光染色1 h，然后用PBS 清洗，最后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)后生元對(duì)MRSA 胞內(nèi)ROS 產(chǎn)生的影響。

1.2.5 后生元YDFF 對(duì)MRSA 抗生素耐藥性影響

根據(jù)美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)（CLSI）的標(biāo)準(zhǔn)并參考文獻(xiàn)方法[28]，使用棋盤(pán)式微量液基稀釋法（簡(jiǎn)稱棋盤(pán)法）檢測(cè)后生元YDFF 對(duì)MRSA 的耐藥性影響。首先測(cè)定后生元YDFF 和β-內(nèi)酰胺類抗生素甲氧西林的最小抑菌濃度（MIC），并測(cè)定其對(duì)MRSA的分級(jí)抑菌濃度指數(shù)（FICI），F(xiàn)ICI≤0.5 為兩者抗菌具有協(xié)同作用，F(xiàn)ICI>4 為拮抗作用，0.5

式中：MICa和MICb分別表示藥物后生元和甲氧西林單用時(shí)的MIC 值，MICab是后生元在甲氧西林聯(lián)合下的MIC 值，MICba是甲氧西林在后生元聯(lián)合下的MIC 值[29]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本文中所有實(shí)驗(yàn)均平行三次。所有數(shù)據(jù)均以平均值（mean）±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）表示。采用 Origin 8.0 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，組間兩兩比較采用t檢驗(yàn)法。

2 結(jié)果與分析

2.1 具有抑菌功能的后生元的制備

本研究對(duì)3 株菌的不同初始接種量進(jìn)行了驗(yàn)證，由表1 可知，副干酪乳酪桿菌Postbio-P6、發(fā)酵粘液乳桿菌Postbio-Q7、乳酸乳球菌乳亞種Postbio-F3 在接種量分別為3%、2%、3%時(shí)所制備的后生元活性最高，說(shuō)明在此接種比例下，菌株之間通過(guò)互作關(guān)系能夠刺激相關(guān)代謝通路高量表達(dá)，從而產(chǎn)生更多抑菌活性物質(zhì)，因此選用該接種量所制備的后生元用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。本研究采用高溫高壓方法制備后生元YDFF（含有死菌體和代謝產(chǎn)物），經(jīng)測(cè)試抑菌活性未受影響，說(shuō)明YDFF 中的抑菌活性物質(zhì)耐受高溫高壓。此外，通過(guò)菌落計(jì)數(shù)法檢測(cè)后生元YDFF 無(wú)活菌生長(zhǎng)，證明高溫高壓方法滅菌完全。

表1 不同接種量對(duì)后生元抑菌活性的影響Table 1 Effects of different inoculated doses

2.2 后生元YDFF 對(duì)MRSA 的抑菌作用

2.2.1 抑菌圈實(shí)驗(yàn) 如圖1A 所示，后生元YDFF 上清液和后生元YDFF 混合液對(duì)MRSA 均有明顯的抑制作用。后生元YDFF 上清液對(duì)MRSA 的抑菌圈直徑為19.1±1.5 mm，后生元YDFF 混合液對(duì)MRSA的抑菌圈直徑為18.5±1.2 mm，而后生元YDFF 死菌體無(wú)抑菌活性。綜上結(jié)果選用上清液進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

圖1 后生元YDFF 對(duì)MRSA 的抑菌活性Fig.1 Antibacterial activity of postbiotic YDFF on MRSA

2.2.2 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定 不同濃度的后生元YDFF對(duì)MRSA 生長(zhǎng)變化趨勢(shì)影響如圖1B 所示，未加后生元的空白對(duì)照組細(xì)菌生長(zhǎng)呈現(xiàn)出典型的S 型生長(zhǎng)曲線。添加濃度為50%和100%的后生元YDFF完全抑制了細(xì)菌的生長(zhǎng)，OD 值基本不變；添加濃度為25%的后生元YDFF 在20 h 前細(xì)菌不生長(zhǎng)，20 h開(kāi)始輕微生長(zhǎng)；而添加12.5%后生元盡管沒(méi)有完全抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)，但細(xì)菌的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期大大推遲，較對(duì)照推遲了12 h。上述結(jié)果說(shuō)明后生元YDFF 可以顯著抑制MRSA 的生長(zhǎng)。

2.3 后生元YDFF 對(duì)MRSA 的抑菌特性

2.3.1 不同酶對(duì)后生元YDFF 抑菌活性的影響 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了7種不同的酶對(duì)后生元YDFF 抑菌活性的影響，結(jié)果如圖2 所示。從圖中可以看出，后生元YDFF 對(duì)木瓜蛋白酶、蛋白酶K、胰蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶較為敏感，對(duì)胃蛋白酶不敏感。其中，后生元YDFF 經(jīng)蛋白酶K 處理后其活性完全喪失，由此可推斷，后生元YDFF 中發(fā)揮抑菌作用的可能是蛋白類物質(zhì)。

圖2 不同酶對(duì)后生元YDFF 抑菌活性的影響Fig.2 Effects of different enzymes on the antibacterial activity of posttiotic YDFF

2.3.2 不同pH 對(duì)后生元YDFF 抑菌活性的影響由圖3 可知，后生元YDFF 在pH3.0～9.0 范圍內(nèi)均具有抑菌活性。在酸性條件下（pH3.0～6.0），隨著pH 降低，抑菌活性呈現(xiàn)增高趨勢(shì)；而在中性和堿性條件下（pH7.0～9.0），抑菌活性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，在pH8.0 時(shí)活性達(dá)到最大。通常后生元成分中發(fā)揮抑菌作用的主要有細(xì)菌素和有機(jī)酸等物質(zhì)[30-31]，YDFF 在pH7.0 時(shí)仍保持較好活性，說(shuō)明YDFF 中除了有機(jī)酸還有其他活性抑菌成分。上述結(jié)果說(shuō)明YDFF 抑菌活性具有較寬的pH 耐受范圍，這對(duì)YDFF的實(shí)際應(yīng)用具有重要意義。

圖3 不同pH 對(duì)YDFF 抑菌活性的影響Fig.3 Effects of pH on the antibacterial activity of YDFF

2.3.3 后生元YDFF 中胞外多糖的抑菌活性判斷通過(guò)乙醇沉淀法粗提后生元YDFF 中的胞外多糖，并驗(yàn)證后生元中的胞外多糖是否具有抑菌活性。如圖4 所示，12.5%、25%、50%的胞外多糖對(duì)MRSA均無(wú)抑菌作用，初步判斷后生元中發(fā)揮抑菌活性的物質(zhì)不是多糖。

圖4 后生元YDFF 中胞外多糖的抑菌活性Fig.4 Antibacterial activity of extracellular polysaccharides in YDFF on MRSA

2.4 后生元對(duì)MRSA 生物膜形成的影響

本論文通過(guò)結(jié)晶紫染色法測(cè)定了后生元YDFF對(duì)MRSA 生物膜形成的抑制作用。由圖5 可知，后生元YDFF 對(duì)MRSA 生物膜的形成具有顯著的抑制作用（P<0.001），100%、50%、25%后生元對(duì)MRSA生物膜的抑制率分別為81.2%、78.3%、76.8%，且呈現(xiàn)一定的濃度依賴性。據(jù)報(bào)道，細(xì)菌的生物膜與細(xì)菌的致病性、毒力密切相關(guān)，尤其與其抗生素耐藥性相關(guān)[32]。由此推斷，后生元YDFF 可能會(huì)通過(guò)破壞MRSA生物膜抑制細(xì)菌生長(zhǎng)并降低細(xì)菌的耐藥性。

圖5 后生元YDFF 對(duì)MRSA 生物膜的形成的影響Fig.5 Effect of the YDFF on biofilm formation of MRSA

2.5 后生元對(duì)MRSA 形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

通過(guò)掃描電鏡觀察后生元YDFF 對(duì)MRSA 菌體形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響，如圖6 所示，對(duì)照組中未經(jīng)后生元處理的MRSA 菌體細(xì)胞為典型的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，菌體圓型，表面圓潤(rùn)光滑，細(xì)胞表面完全沒(méi)有破損，結(jié)構(gòu)完整，而且菌體生長(zhǎng)良好，沒(méi)有聚集皺縮；后生元YDFF處理的MRSA 細(xì)胞壁和細(xì)胞膜被破壞，菌體變形并有溶解現(xiàn)象，細(xì)胞完整性喪失，細(xì)胞整體結(jié)構(gòu)坍塌。由此可見(jiàn)，后生元YDFF 可以有效地破壞MRSA 的菌體結(jié)構(gòu)，對(duì)MRSA 具有損傷作用，能夠引起細(xì)胞內(nèi)容物的泄漏。

圖6 后生元YDFF 對(duì)MRSA 的形態(tài)結(jié)構(gòu)影響Fig.6 Effect of YDFF on the morphological structure of MRSA

2.6 后生元對(duì)MRSA 胞內(nèi)DNA 泄漏的影響

當(dāng)細(xì)胞膜通透性受到破壞時(shí)，細(xì)胞膜的選擇性下降，DNA 等細(xì)胞內(nèi)容物流出。因此通過(guò)測(cè)定DNA泄漏可以反映細(xì)菌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整性[33]。如圖7所示，經(jīng)后生元YDFF 處理后，MRSA 胞內(nèi)DNA 出現(xiàn)了泄漏（P<0.001），且隨著后生元濃度的增加，胞內(nèi)DNA 泄漏量也逐漸增多，說(shuō)明后生元YDFF 破壞了MRSA 細(xì)胞膜的完整性，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物外泄。

圖7 后生元YDFF 對(duì)MRSA 的DNA 泄漏影響Fig.7 Effect of postibiotic YDFF on DNA leakage in MRSA

2.7 后生元YDFF 對(duì)MRSA 胞內(nèi)ROS 產(chǎn)生的影響

活性氧ROS 是一種可參與許多細(xì)胞的生理活動(dòng)的重要分子，它能維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡，與細(xì)胞的生長(zhǎng)和死亡密切相關(guān)，但過(guò)量的ROS 會(huì)引發(fā)細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而導(dǎo)致細(xì)胞損傷[34-36]。本論文通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)后生元YDFF 對(duì)MRSA 胞內(nèi)ROS 產(chǎn)生的影響，如圖8A 所示，對(duì)照組檢測(cè)到的產(chǎn)熒光素的細(xì)菌占比為6.31%，添加25%、50%、100%后生元檢測(cè)到的產(chǎn)熒光素的細(xì)菌占比分別為14.4%、33.8%、52.9%，且隨著后生元濃度升高，熒光強(qiáng)度也增加，具有顯著的濃度依賴性（圖8B），說(shuō)明后生元YDFF 可以顯著促進(jìn)胞內(nèi)ROS 升高，這可能也是后生元YDFF 對(duì)MRSA 產(chǎn)生抑菌活性的其中一個(gè)原因。

圖8 不同濃度后生元YDFF 對(duì)MRSA 胞內(nèi)ROS 產(chǎn)量的影響Fig.8 Effects of different concentrations of postbiotic YDFF on intracellular ROS production of MRSA

2.8 后生元YDFF 對(duì)抗生素耐藥性影響

為驗(yàn)證后生元YDFF 對(duì)MRSA 抗生素耐藥性的影響，本研究聯(lián)合后生元YDFF 與β-內(nèi)酰胺類抗生素甲氧西林，測(cè)定其對(duì)MRSA 的FICI。結(jié)果如表2所示，后生元YDFF 和甲氧西林聯(lián)合用藥后，后生元的MIC 由原來(lái)的0.78%降低至0.025%，甲氧西林的MIC 由原來(lái)的0.98 μg/mL 降低至0.25 μg/mL，而聯(lián)用后FICI 降低至0.38（<0.5），說(shuō)明YDFF 可以顯著降低MRSA 對(duì)甲氧西林的耐藥性，與甲氧西林聯(lián)合具有協(xié)同增強(qiáng)作用。后生元YDFF 降低MRSA耐藥性可能與其抑制MRSA 生物膜有關(guān)，這為有效緩解細(xì)菌耐藥性問(wèn)題、減少抗生素使用提供了新的解決思路。

表2 后生元YDFF 對(duì)MRSA 耐藥性的影響Table 2 Effect of postbiotic YDFF on antibiotic resistance of MRSA to methicillin

3 結(jié)論

本研究通過(guò)復(fù)合發(fā)酵多株益生菌制備得到一種對(duì)MRSA 具有顯著抑菌活性的后生元YDFF。實(shí)驗(yàn)證明后生元YDFF 抑菌活性具有較好的pH 耐受性，在pH3.0～9.0 均可發(fā)揮抑菌作用，且在pH 中性條件下仍保持較高抑菌活性，說(shuō)明后生元YDFF 中發(fā)揮抑菌作用的主要成分不只是有機(jī)酸；提取后生元YDFF 胞外多糖并驗(yàn)證其抑菌活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)胞外多糖無(wú)抑菌活性，表明后生元YDFF 中發(fā)揮抑菌作用的不是多糖類；酶敏感性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)蛋白酶K 可以使后生元YDFF 抑菌活性完全喪失。綜上結(jié)果初步推斷后生元YDFF 中發(fā)揮抑菌作用的主要成分可能為蛋白類物質(zhì)。對(duì)后生元YDFF 的抑菌活性機(jī)制研究表明，后生元YDFF 通過(guò)破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)增加細(xì)胞膜通透性、抑制生物膜形成、增加胞內(nèi)ROS 濃度等多種方式發(fā)揮抑菌作用。另外，本研究通過(guò)測(cè)定FICI 值來(lái)驗(yàn)證后生元YDFF 對(duì)MRSA 耐藥性的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示后生元YDFF 和甲氧西林聯(lián)用的FICI 降低至0.38，說(shuō)明YDFF 和甲氧西林對(duì)MRSA具有協(xié)同抗菌作用，YDFF 可以顯著降低MRSA 對(duì)甲氧西林的耐藥性，這為有效緩解細(xì)菌耐藥性問(wèn)題、減少抗生素使用提供了新的解決思路。

本論文初步判斷后生元YDFF 中發(fā)揮抑菌作用的主要物質(zhì)可能是蛋白類的活性物質(zhì)，這尚需對(duì)其抑菌活性成分進(jìn)行進(jìn)一步解析。另外，在抑菌機(jī)制方面，通過(guò)轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白組學(xué)等多組學(xué)技術(shù)，深入闡明后生元對(duì)細(xì)菌發(fā)揮作用的分子機(jī)制也是未來(lái)研究的重要方向。