通脈顆粒HPLC指紋圖譜研究

【摘要】目的：初步建立通脈顆粒HPLC指紋圖譜，為評(píng)價(jià)其質(zhì)量提供依據(jù)。方法：通脈顆粒甲醇提取物的分析采用Diamonsil Plus C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相乙腈-0.1%磷酸水，梯度洗脫；體積流量0.5 mL/min；柱溫40℃；檢測(cè)波長(zhǎng)313 nm。結(jié)果：12批通脈顆粒的指紋圖譜相似度≥0.975，共標(biāo)定出20個(gè)共有峰，指認(rèn)2個(gè)共有峰（葛根素、阿魏酸）。結(jié)論：該方法操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確可靠、專屬性強(qiáng)，重復(fù)性良好，可以用于通脈顆粒的質(zhì)量控制。

【關(guān)鍵詞】通脈顆粒；HPLC；指紋圖譜；質(zhì)量控制

【DOI編碼】10.3969/j.issn.1674-4977.2023.06.028

【基金項(xiàng)目】吉林省發(fā)展和改革委員會(huì)產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究與開(kāi)發(fā)項(xiàng)目（2021C041-3）。

Study on the HPLC Fingerprint of Tongmai Granule

ZHANG Hao

（Liaoning Panjin Inspection and Testing Center， Panjin 124010， China）

Abstract： Objective：The research aims to establish HPLC fingerprint for Tongmai Granule，providing evidence for further assessment on its quality.Methods：The methanol extract of Tongmai Granule is analysed using Diamonsil Plus C18 chromatographic column （250 mm×4.6 mm，5μm）；with acetonitrile-0.1% phosphate acid as its mobile phase；volume flow 0.5 mL/min and temperature 40℃；eluted gradiently and tested under the wavelength of 313 nm.Results： The fingerprints of all 12 samples of Tongmai Granule share a similarity of at least 0.975，20 common peaks have been labelled with 2 of them identified （puerarin and ferulic acid）.Conclusion：The method adopted has turned out to be convenient、reliable、accurate、specific、and easily repeatable，which can be applied for the quality control of Tongmai Granule.

Key words： Tongmai Granule； HPLC； fingerprint； quality control

通脈顆粒系臨床常用藥，具有活血通脈之功效，用于缺血性心腦血管疾病、動(dòng)脈硬化、腦血栓、腦缺血、冠心病、心絞痛等病癥，處方由丹參、川芎、葛根三味藥材組成[1]。在國(guó)內(nèi)有50余家企業(yè)生產(chǎn)通脈顆粒，藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)20余個(gè)。不同生產(chǎn)廠家依據(jù)不同藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)生產(chǎn)的通脈顆粒存在著一定差異，從而影響通脈顆粒的臨床療效及應(yīng)用。因此，建立全面合理的通脈顆粒質(zhì)量評(píng)價(jià)方法，進(jìn)一步規(guī)范其臨床應(yīng)用非常重要。

指紋圖譜技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于各種中藥材和成方制劑的質(zhì)量控制[2-12]。其中，HPLC指紋圖譜技術(shù)是應(yīng)用較多的一類，具有分析速度快、分離效果好、分析結(jié)果準(zhǔn)確度高等優(yōu)點(diǎn)[13-19]。部分通脈顆粒藥品標(biāo)準(zhǔn)中僅對(duì)一種或兩種化學(xué)成分進(jìn)行了定量控制，中藥的化學(xué)成分十分復(fù)雜，僅僅通過(guò)一種或幾種化學(xué)成分的測(cè)定難以全面評(píng)價(jià)其質(zhì)量。本實(shí)驗(yàn)建立了通脈顆粒HPLC指紋圖譜，為全面地進(jìn)行通脈顆粒的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。

1.1儀器

島津LC-20AT高效液相色譜儀（日本島津公司）；DL-180超聲清洗機(jī)（浙江石浦海天電子儀器廠）；XS-205DU電子天平（METTLER TOLEDO）；0.45μm濾膜（天津津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

1.2試藥

葛根素（質(zhì)量分?jǐn)?shù)96.8%，批號(hào)110752-202217）、阿魏酸（質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.4%，批號(hào)110773-201915）均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；乙腈、甲醇、磷酸均為色譜純；水為純凈水。

本研究應(yīng)用于HPLC指紋圖譜分析的12批通脈顆粒樣品分別選自4個(gè)生產(chǎn)企業(yè)，并且從每個(gè)通脈顆粒生產(chǎn)廠家中選取3個(gè)不同批號(hào)，樣品來(lái)源信息見(jiàn)表1。

2.1色譜條件

Diamonsil Plus C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相乙腈（A）-0.1%磷酸水（B），梯度洗脫，0～20 min，10%～ 20%A；20～40 min，20%～40%A；40～45 min，40%～10%A；體積流量0.5 mL/min；柱溫40℃；檢測(cè)波長(zhǎng)313 nm；進(jìn)樣量5μL。

2.2對(duì)照品溶液的制備

取葛根素、阿魏酸對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為48.12μg/mL、53.97μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.3供試品溶液的制備

取通脈顆粒，研細(xì)，取約2.5 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加入甲醇50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲40 min，放冷后補(bǔ)足失重，搖勻，濾過(guò)，即得。

2.4方法學(xué)考察

1）專屬性。按“2.1”項(xiàng)色譜條件，分別取新鮮制備的供試品溶液和空白試劑（色譜級(jí)甲醇）進(jìn)樣，記錄HPLC圖，空白試劑不干擾供試品溶液的測(cè)定，表明專屬性良好。

2）精密度。取通脈顆粒（廠家批號(hào)：D3），按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件下，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄HPLC圖，以阿魏酸（13號(hào)峰）為內(nèi)參比峰，各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.23%～0.72%，相對(duì)峰面積的RSD為0.69%～1.89%，表明儀器的精密度良好。

3）穩(wěn)定性。取通脈顆粒（廠家批號(hào)：D3），按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件下，室溫下放置0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，記錄HPLC圖，以阿魏酸（13號(hào)峰）為內(nèi)參比峰，各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.18%～0.67%，相對(duì)峰面積的RSD為0.96%～1.82%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

4）重復(fù)性。取通脈顆粒（廠家批號(hào)：D3）6份，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，記錄HPLC圖，以阿魏酸（13號(hào)峰）為內(nèi)參比峰，各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.42%～0.89%，相對(duì)峰面積的RSD為0.96%～1.97%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.5指紋圖譜的建立及相似度評(píng)價(jià)

分別取所選取的12批通脈顆粒，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，記錄HPLC圖，采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”（2012版），設(shè)S1圖譜為參照?qǐng)D譜，時(shí)間窗寬度為0.2，采用中位數(shù)法，進(jìn)行色譜峰匹配，建立共有模式，標(biāo)記了20個(gè)共有峰，得到12批通脈顆粒樣品HPLC指紋圖譜（S1-S12）及對(duì)照?qǐng)D譜（R）（見(jiàn)圖1）。以生成的對(duì)照?qǐng)D譜為參照標(biāo)準(zhǔn)，12批通脈顆粒樣品的相似度為0.975～ 0.995，相似度良好，結(jié)果見(jiàn)表2。說(shuō)明所選取的通脈顆粒成分組成一致性良好，質(zhì)量穩(wěn)定。

2.6色譜峰的指認(rèn)

選取的12批通脈顆粒樣品的HPLC指紋圖譜中，標(biāo)定出了20個(gè)共有峰，并通過(guò)對(duì)照品比對(duì)指認(rèn)2個(gè)共有峰，分別是6號(hào)峰葛根素、13號(hào)峰阿魏酸，供試品溶液（圖2）和對(duì)照品溶液（圖3）。

本實(shí)驗(yàn)首先考察了不同體積分?jǐn)?shù)（25%、50%、75%、100%甲醇）的提取溶劑對(duì)通脈顆粒的提取效果，結(jié)果表明，采用體積分?jǐn)?shù)100%的甲醇提取效果較好。色譜條件分別考察了不同的流動(dòng)相（乙腈-0.1%磷酸水、乙腈-0.2%磷酸水、甲醇-0.1%磷酸水、甲醇-0.2%磷酸水）、不同檢測(cè)波長(zhǎng)（254 nm、280 nm、313 nm、350 nm）、不同柱溫（30℃、35℃、40℃、45℃）及不同體積流量（0.5 mL/min、0.7 mL/min、0.8 mL/min、1.0 mL/min）等條件，由于本實(shí)驗(yàn)研究的化學(xué)成分較多，各成分在不同條件下各有優(yōu)劣，綜合各方面因素加以分析和考慮，最終色譜條件采用乙腈-0.1%磷酸水為流動(dòng)相、檢測(cè)波長(zhǎng)313 nm、柱溫40℃、體積流量0.5 mL/min，所得到各成分色譜峰分離度高、峰型好、基線平穩(wěn)。

通過(guò)指紋圖譜得出，選取的12批通脈顆粒指紋圖譜的相似度為0.975～0.995，相似度較高，且專屬性、精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性均較好，說(shuō)明所建立的通脈顆粒HPLC指紋圖譜分析方法穩(wěn)定可靠，可操作性強(qiáng)。12批通脈顆粒中共有色譜峰的峰面積略有一些差別，表明不同廠家批次的通脈顆粒的成分含量有一定的差異和不同，需要更深一步研究。

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【作者簡(jiǎn)介】

張浩，男，1987年出生，副主任中藥師，碩士，研究方向?yàn)橹兴庂|(zhì)量控制。

（編輯：侯睿琪）