siRNA靶向沉默鞘氨醇激酶 -1對前列腺癌PC-3細胞生物學(xué)行為的影響

李 想，時 湛，馬瑞寧，孫曉青

(1.徐州醫(yī)學(xué)院，2.徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，江蘇徐州 221000)

·基礎(chǔ)研究·

siRNA靶向沉默鞘氨醇激酶 -1對前列腺癌PC-3細胞生物學(xué)行為的影響

李 想1，時 湛1，馬瑞寧1，孫曉青2

(1.徐州醫(yī)學(xué)院，2.徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，江蘇徐州 221000)

目的 探討siRNA靶向沉默SPHK1基因?qū)η傲邢侔㏄C-3細胞生物學(xué)行為的影響。方法 使用脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)染人前列腺細胞株P(guān)C-3細胞，通過RT-PCR和Western-blot方法分別檢測特異性siRNA對SPHK1基因在mRNA和蛋白水平上的沉默效果，CCK-8法測定細胞生長曲線并觀察細胞增殖被抑制情況，Annexin V-PI法檢測細胞凋亡情況，采用Transwell小室法檢測細胞在侵襲力方面的變化。結(jié)果 經(jīng)SPHK1 siRNA轉(zhuǎn)染后，PC-3細胞中SPHK1的表達均低于陰性對照組(NC)和空白組(P<0.05)；并且SPHK1 siRNA抑制細胞的增殖能力，使其凋亡率增加，侵襲力降低。結(jié)論 通過抑制前列腺癌PC-3細胞SPHK1基因的表達，抑制細胞增殖并降低侵襲力，使其凋亡增加，顯示出在前列腺癌的發(fā)生發(fā)展中SPHK1基因發(fā)揮著重要的作用。

RNA干擾；前列腺癌；鞘氨醇激酶-1；細胞增殖；細胞凋亡

許多西方國家中，前列腺癌是男性最常見的惡性腫瘤，占男性癌癥死因第二位。隨著近年來我國人群生活水平的改善和人口老齡化，我國前列腺癌發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升趨勢，成為影響我國居民健康的主要惡性腫瘤之一[1]。同時，我國前列腺癌與西方前列腺癌發(fā)生有所不同。喪失了手術(shù)良機，預(yù)后較差，生存期也較短，目前尚無滿意的治療方法和技術(shù)。RNAi(RNA interference,RNAi)是在mRNA水平上高度特異的基因沉默技術(shù)，其介導(dǎo)識別并切割同源性mRNA分子，從而致使該基因不被表達[2]。鞘氨醇激酶(sphingosine kinase,SPHK)是維持細胞內(nèi)鞘脂平衡的重要限速酶，目前已知在哺乳動物中存在兩種SPHK異構(gòu)酶—SPHK1(主要存在于細胞質(zhì))和SPHK2(主要存在于細胞核)[3]。其主要是通過增加細胞內(nèi)1-磷酸鞘氨醇(sphingosine 1-phosphate,S1P)并降低神經(jīng)酰胺和鞘氨醇，促進細胞的存活和增殖。其中S1P是一個重要的存活因子，能直接對抗神經(jīng)酰胺(Cer)和鞘氨醇(Sp)，從而能阻止細胞內(nèi)Cer和Sp水平的過度升高，三者之間的動態(tài)平衡決定著細胞的生死與存亡[4]，同時多種腫瘤內(nèi)發(fā)現(xiàn)SPHK1其本身的mRNA和蛋白質(zhì)水平明顯升高，并且腫瘤惡性程度以及預(yù)后等臨床病理特征與表達水平相關(guān)，因此被普遍認為是癌基因[5]。近來研究表明，SPHKl的活性增強在多種腫瘤中起到抵抗放、化療的作用，其中也包括前列腺腺癌[6]。本實驗通過觀察特異性小干擾RNA靶向沉默SPHK1基因?qū)θ饲傲邢侔㏄C-3細胞的增殖、侵襲和凋亡的影響，希望為未來治療前列腺癌提供一種新的方法和視角。

1 材料與方法

1.1 材料 人前列腺PC-3細胞株購自上海中國科學(xué)院細胞庫。3條SPHK1 siRNA及陰性對照組siRNA由上海吉瑪制藥技術(shù)公司合成。RPMI 1640培養(yǎng)基購于Thermo科技公司。無支原體胎牛血清購于杭州四季青公司。Lipofectamine TM2000購自Invitrogen公司。TRNzol總RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒及PCR試劑盒購于天根生化科技公司。SPHK1和內(nèi)參照GAPDH的引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)公司合成。兔抗人SPHK1多康隆抗體采購自美國Cell Signaling Technology公司。熒光標(biāo)記山羊抗兔IgG購自美國 LI- COR 公司。β-catin購自Bioworld公司。RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒(增強型)購于上海碧云天公司。CCK-8試劑盒購于VICMED公司。AnnexinV-FITC/PI 細胞凋亡試劑盒購自南京凱基生物科技公司。Transwell小室購于Millipore公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 前列腺癌PC-3細胞用含10%胎牛血清及RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，放置于37℃、含5% CO2的培養(yǎng)箱中，細胞融合度達90%左右時，以0.25%胰蛋白酶消化并按1∶3比例傳代。按細胞數(shù)為3×105/孔在6孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)接種細胞，加入含10%胎牛血清的PRMI1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h使細胞融合度達40%～50%，此時參考LipofectamineTM2000脂質(zhì)體說明書進行轉(zhuǎn)染。

1.2.2 siRNA轉(zhuǎn)染三條SPHK1 siRNA siRNA-1(1 104)：sense 5′-GCAGCUUCCUUGAACCAUUTT-3′,Anti-sense 5′-AAUGGUUCAAGGAAGCUGCTT-3′；siRNA-2(1 603)：sense 5′-GCGUCAUGCAUCUGUUCUATT-3′,Anti-sense 5′-UAGAACAGAUGCAUGACGCTT-3′；siRNA-3(1 813):sense 5′-GUGCACCCAAACUACUUCUTT-3′,Anti-sense 5′-AGAA-GUAGUUUGGGUGCACTT-3′；Negative control：sense 5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′,Anti-sense 5′-AC-GUGACACGUUCGGAGAATT-3′。將PC-3細胞分為空白對照組(BLANK)、陰性對照組(negative control,NC)、siRNA-1組、siRNA-2組和siRNA-3組。取100 pmol siRNA稀釋于250 μL、無血清及抗生素的PRMI 1 640培養(yǎng)基中，混勻后室溫中靜置5 min，再以250 μL、無血清及抗生素的PRMI 1 640培養(yǎng)基稀釋5 μL LipofectamineTM2000脂質(zhì)體，混勻后室溫下靜置5 min，混合稀釋后的siRNA及轉(zhuǎn)染試劑，室溫靜置20 min，將500 μL轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入6孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)，混勻后放入37℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，6 h后更換含10%的胎牛血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，并按照實驗設(shè)計時間分別收集細胞以繼續(xù)進行后續(xù)實驗。

1.2.3 RT-PCR檢測SPHK1基因表達 GenBank檢索目的基因序列，交付上海生物工程技術(shù)服務(wù)公司設(shè)計并合成引物，序列如下：SPHK1上游引物5′-CCGACGAGGACTTTGTGCTA-3′，下游引物5′-AACCGCTGACCATCCAGAAG-3′，產(chǎn)物長度336 bp。并以GAPDH作為內(nèi)參照，上游引物5′-GGTGGACCTGACCTGCCGTCTAGA-3′，下游引物5′-TTACTCCTTGGAGGCCATGTGGG-3′,產(chǎn)物長度280 bp。參照TRNzol試劑說明書對各組細胞總RNA進行提取，并用分光光度計測定A280和A260值，計算出各組純度及濃度，各組樣品重復(fù)3次。采用天根公司TIANScript RT Kit試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄生存所對應(yīng)的cDNA，按照2×Taq PCR Mastermix(KT201)在25 μL反應(yīng)體系中進行擴增，反應(yīng)條件如下：94℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s，59℃退火30 s，72℃延伸1 min，以上循環(huán)25次，再以72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖電泳進行檢測，在UVP圖像處理儀中攝片，利用Image J軟件統(tǒng)計灰度值。SPHK1灰度值與內(nèi)參GAPDH灰度值的比值作為比較參數(shù)，選取沉默效果最佳的一組siRNA進行后續(xù)實驗。

1.2.4 Western blotting檢測各組SPHK1蛋白表達 選取沉默效果最佳的siRNA作為實驗組轉(zhuǎn)染細胞，對空白組、陰性對照組及實驗組轉(zhuǎn)染48 h后，棄凈陳舊培養(yǎng)基后，加入預(yù)冷PBS洗滌2遍，加入RIPA裂解液，刮取各組細胞總蛋白，BCA法測定總蛋白濃度，SDS-PAGE法進行凝膠電泳，待半干后轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，用5%脫脂牛奶封閉2 h后，加入一抗(1∶1 000),4℃孵育過夜，Washing buffer洗膜后，加入二抗(1∶10 000)室溫孵育2 h，避光下再以Washing buffer洗膜后，將NC膜置于Odyssey紅外激光成像系統(tǒng)掃描板上掃描成像。利用Image J軟件測定各個條帶的灰度值，各組間相互比較的參數(shù)為SPHK1條帶灰度值與其相應(yīng)的GAPDH條帶灰度值的比值。

1.2.5 CCK-8法檢測細胞增殖能力 根據(jù)設(shè)置的4個時間點(24、48、72、96 h)取4塊96孔細胞培養(yǎng)板，每塊96孔板內(nèi)細胞分為3組：空白組、NC組以及SPHK1-siRNA-1組。轉(zhuǎn)染方法同前，轉(zhuǎn)染24 h后用0.25%胰酶消化各組細胞，加入含10%FBS的PRMI 1640培養(yǎng)基并調(diào)整各組濃度為2×104/mL的細胞懸液，每孔加入100 μL細胞懸液，每個時間點設(shè)置3個復(fù)孔。各96孔板放入37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中。每個時間點取出對應(yīng)的96孔板，每孔內(nèi)加入10 μL的CCK-8溶液，小心混勻后再次放入培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h，計時后取待測96孔板放入酶標(biāo)儀測定儀中，測定460 nm處吸光度(A)值。計算各孔平均值，繪制生長曲線。

1.2.6 Transwell小室法檢測細胞侵襲能力 按無血清培養(yǎng)基：Matrigel原液=4∶1稀釋Matrigel基質(zhì)膠，取50 μL加入Transwell小室的上室，置于超凈臺內(nèi)風(fēng)干過夜。收集轉(zhuǎn)染24 h后各組細胞，加入無血清培養(yǎng)基制備成濃度為2×105/mL的細胞懸液，取200 μL均勻鋪至Transwell小室，下室內(nèi)加入含10% FBS的培養(yǎng)基600 μL，各組設(shè)3個復(fù)孔。經(jīng)36 h培養(yǎng)箱培養(yǎng)后，取出Transwell小室，棉簽擦去上室未穿膜的細胞，加入95%的甲醛固定30 min，再用結(jié)晶紫染色30 min，PBS沖洗Transwell小室3遍后，于200倍顯微鏡下隨機選取4個視野拍照，計數(shù)穿膜的細胞數(shù)。1.2.7 AnnexinV-FITC/PI法檢測細胞凋亡 轉(zhuǎn)染方法及步驟同前，6孔板內(nèi)3組細胞(空白組、NC組、SPHK1-siRNA-1組)轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，吸盡各孔內(nèi)陳舊培養(yǎng)基，用預(yù)冷PBS洗滌細胞2次，以1×107/mL的密度重懸細胞于1×BindingBuffer(含Ca2+)中，取其中100 μL細胞懸液加入1.5 mL塑料離心管中，分別加入5 μL Annexin及10 μL PI，輕輕混勻后避光孵育15 min，每個樣品再加入400 μL1×Binding Buffer后于1 h內(nèi)進行流式細胞儀檢測(AnnexinV-FITC為綠色熒光，PI為紅色熒光)，使用FLowJo7.6軟件分析3組PC-3細胞的凋亡情況。

2 結(jié) 果

2.1 RT-PCR法半定量檢測PC3細胞內(nèi)SPHK1mRNA的相對表達量(相對于內(nèi)參GAPDH mRNA) 由電泳結(jié)果可示實驗組SPHK1 mRNA的表達低于陰性對照組和空白對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。各組mRNA表達量(%)如下：陰性對照組92.08±1.66，siRNA-1組38.88±2.07，siRNA-2組64.7±3.05，siRNA-3組75.61±2.63，以siRNA-1沉默效果最佳。siRNA-1為本實驗最佳干擾序列，進行后續(xù)實驗(圖1)。

圖1 RT-PCR檢測PC3細胞轉(zhuǎn)染SPHK1 mRNA的表達

A:瓊脂糖凝膠電泳圖；B：SPHK1 mRNA表達率(與BLANK組和NC組比較，*P<0.05；與siRNA-2組和siRNA-3組比較，#P<0.05)。

2.2 Western-blot檢測SPHK1蛋白表達 檢測分析各組Western-blot條帶示，內(nèi)參照GAPDH為均一顯影條帶，實驗組siRNA-1的SPHK1蛋白表達水平均低于NC組及BLANK組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。各組SPHK1蛋白表達量(%)如下：NC組89.13±4.43，siRNA-1組38.07±3.56(圖2)。

圖2 Western-blot檢測轉(zhuǎn)染各siRNA后細胞SPHK1蛋白的表達

A：SDS-PAGE電泳圖；B：SPHK1蛋白表達率(與BLANK組和NC組比較，*P<0.05)

2.3 沉默SPHK1基因?qū)C-3細胞增殖的影響 實驗結(jié)果示SPHK1-siRNA-1對PC-3細胞有一定的抑制作用，在24、48、72、96 h這4個時間點的吸光度與NC組、BLANK組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。而NC組與BLANK組相比，差異則無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。提示PC-3細胞增殖所受的抑制效果隨時間延長而增加(表1)。

2.4 沉默SPHK1基因?qū)毎忠u力的影響 沉默PC-3細胞中SPHK1基因后，細胞在Transwell小室內(nèi)的穿膜細胞數(shù)分別如下：BLANK組(192±17)個/HP，NC組(174±21)個/HP，siRNA-1組(89±12)個/HP，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果示沉默SPHK1可降低PC-3細胞的侵襲能力(圖3)。

表1 各組PC-3細胞不同時間點的OD值 (±s，n=3)

BLANK組和NC組比較，*P<0.05; 與BLANK組比較，**P>0.05。

圖3 Transwell侵襲實驗結(jié)果(A、B、C：×200)

A:BLANK組; B:NC組; C:siRNA-1組; D:柱狀圖(與 BLANK組和NC組比較,*P<0.05)。

2.5 沉默SPHK1基因?qū)毎蛲龅挠绊?流式細胞結(jié)果示：細胞轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，PC-3細胞siRNA-1組凋亡率為(38.8±1.84)%，與BLANK組(19.18±1.63)%和NC組(20.53±1.09)%相比，凋亡率明顯增高(P<0.05)。說明沉默SPHK1基因后的PC-3細胞凋亡率增加(圖4、圖5)。

圖4 流式細胞儀檢測siRNA沉默SPHK1基因?qū)C3細胞凋亡的影響

圖5 siRNA沉默SPHK1基因?qū)C-3細胞凋亡率的影響

與 BLANK組和NC組比較，*P<0.05。

3 討 論

神經(jīng)酰胺/鞘氨醇和S1P是細胞內(nèi)神經(jīng)鞘脂的重要代謝產(chǎn)物，它們之間的平衡形成了一個所謂的“鞘脂變阻器”。而“變阻器”唯一的調(diào)控開關(guān)—鞘氨醇激酶-1(SPHK1)即維持細胞內(nèi)鞘脂平衡的關(guān)鍵限速酶，通過催化神經(jīng)酰胺以及鞘氨醇來增加胞內(nèi)S1P，以促進細胞增殖和存活[7]。鞘氨醇激酶-1(S1P)活化是由細胞外信號調(diào)解激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)介導(dǎo)，SPHK1通過激活ERK1 / 2 - ETS1和NF-κB通路，上調(diào)相關(guān)啟動子活性，過表達基質(zhì)蛋白金屬酶-1(MMP-1)mRNA和其蛋白水平[8]，使其第225位點上的絲氨酸發(fā)生磷酸化[9]。而MMPs幾乎能降解細胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)中的各種蛋白成分,破壞腫瘤細胞侵襲的組織學(xué)屏障，在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵性作用。SUKOCHEVA等[10]證實，在人乳腺癌細胞增殖和生長的過程中，17-β-雌二醇(E2)誘導(dǎo)的表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)反式激活是通過由SPHK1控制的一種新穎的信號系統(tǒng)來驅(qū)動；E2刺激SPHK1活化并釋放S1P，后者與細胞膜表面的特異G蛋白耦聯(lián)受體-內(nèi)皮細胞分化基因-3(endothelial differentiation gene-3,EDG-3)結(jié)合，導(dǎo)致MMP依賴性的EGFR反式激活，從而調(diào)節(jié)多種腫瘤細胞的遷移信號[10]。同時，SPHK1通過增強EGFR磷酸化，促進人表皮調(diào)節(jié)素(epiregulin,EREG)和人雙調(diào)蛋白(amphiregulin,AREG)的上調(diào)，最終增強腫瘤細胞的侵襲能力[11]。

另外，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，在生長因子的作用下，SPHK1易位至胞膜上，通過與生長因子共同機制促進細胞的增殖和腫瘤形成。非轉(zhuǎn)化的NIH-3T3成纖維細胞過表達SPHK1基因完成表型轉(zhuǎn)化，使其不僅在軟瓊脂培養(yǎng)基上大量增殖，并且能夠在裸鼠體內(nèi)形成腫瘤[12]。研究顯示，SPHK1基因還參與血管生成。在無血清和脫離細胞外基質(zhì)的環(huán)境下，內(nèi)皮細胞通過過表達SPHK1基因從而提高存活率。此外在SPHK1-SPHK2雙缺失的小鼠模型上已證實，這些激酶是血管發(fā)育和血管發(fā)生不可缺少的[13]。綜合上述結(jié)果表明，SPHK1不僅通過S1P影響腫瘤細胞本身，而且對腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中血管生成所需的細胞因子等具有協(xié)同或允許作用。這為以SPHK1為靶點治療腫瘤的新型治療策略提供了可靠的依據(jù)。

本次實驗應(yīng)用RNAi技術(shù)構(gòu)建靶向SPHK1基因的小干擾片段并沉默SPHK1基因。實驗結(jié)果顯示，在沉默SPHK1基因后，不僅從轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)人前列腺癌PC-3細胞中相應(yīng)基因mRNA的水平，而且還從翻譯水平下調(diào)PC-3細胞中SPHK1蛋白的表達量。說明SPHK1基因不僅在PC-3細胞中表達，而且SPHK1-siRNA抑制了該基因的表達。轉(zhuǎn)染后，采用CCK-8法檢測4個時間點的A值，與空白組以及陰性對照組相比，siRNA干擾組細胞增殖被抑制，生長減緩。通過模擬體內(nèi)細胞外基質(zhì)環(huán)境，進行Transwell實驗表明沉默SPHK1基因可明顯對PC-3細胞的穿膜、侵襲能力抑制。為進一步了解沉默SPHK1基因?qū)C-3細胞的影響，運用流式細胞術(shù)檢測3組PC-3細胞的凋亡情況，結(jié)果顯示siRNA干擾組的凋亡率明顯高于其他2組。我們的實驗顯示，通過利用RNA干擾技術(shù)沉默前列腺癌PC-3細胞SPHK1基因，下調(diào)該基因在細胞中表達，能夠抑制細胞的增殖、侵襲能力，同時提高細胞凋亡率。這些生物學(xué)行為的改變可能與SPHK1參與的腫瘤發(fā)生中血管的形成等機制有關(guān)。通過本次實驗，有望為今后深入研究SPHK1基因與前列腺癌打下基礎(chǔ)，并為未來基因靶向治療前列腺癌提供新的思路。

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(編輯 王 瑋)

Effects of SPHK1 RNAi on prostate cancer PC-3 cells

LI Xiang1, SHI Zhan1, MA Rui-ning1, SUN Xiao-qing2

(1. Xuzhou Medical College; 2. Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College, Xuzhou 221000, China)

Objective To investigate the effects of silencing of sphingosine kinase-1 (SPHK1) gene expression by siRNA on the biological behavior of human prostate cancer PC-3 cells. Methods Lipofectamine 2000 (Lipo) was used to transfect the siRNA targeting SPHK1 gene into PC-3 cells. The expression of SPHK1 was examined by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) and Western-blot. The change of proliferation was detected by CCK-8.The apoptosis was investigated by Annexin V-PI. The activities of motility and invasion was assessed by Transwell chamber invasion assay in vitro. Results The expression levels of SPHK1 mRNA and protein in the cells transfected with siRNA were significantly lower than in blank group and in negative control (NC) group (P<0.05). The proliferation of PC-3 cells was remarkable inhibited, the invasion was decreased, and apoptosis was increased. Conclusion The inhibition of SPHK1 gene expression by siRNA could inhibit cells from proliferation, reduce invasion and increase apoptosis, which suggest that SPHK1 gene plays a key role in the pathogenesis and development of prostate cancer.

RNA interference; prostate cancer; sphingosine kinase-1; proliferation; apoptosis

2015-01-08

2015-05-05

孫曉青，教授，主任醫(yī)師.E-mail：sunheyao@126.com

李想(1989-)，男(漢族)，醫(yī)學(xué)碩士.研究方向：前列腺癌的基因治療.E-mail：jerryideal@sina.com

R737.25

A

10.3969/j.issn.1009-8291.2015.09.015