慢病毒介導(dǎo)ACTHR過表達(dá)對人腎上腺皮質(zhì)癌H295R細(xì)胞的增殖影響

胡東亮，劉同族，倪 棟，王行環(huán)

(武漢大學(xué)中南醫(yī)院泌尿外科，武漢 430071)

·基礎(chǔ)研究·

慢病毒介導(dǎo)ACTHR過表達(dá)對人腎上腺皮質(zhì)癌H295R細(xì)胞的增殖影響

胡東亮，劉同族，倪 棟，王行環(huán)

(武漢大學(xué)中南醫(yī)院泌尿外科，武漢 430071)

目的 研究ACTHR高表達(dá)對人腎上腺皮質(zhì)癌H295R細(xì)胞的影響，并探討ACTHR在腎上腺腫瘤發(fā)病中的作用。方法 用慢病毒包裝的ACTHR高表達(dá)載體感染H295R細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)組，同時設(shè)立對照組。用WST-1法及細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測感染后細(xì)胞的增殖情況，感染48 h后TUNEL法檢測細(xì)胞的凋亡情況。結(jié)果 WST-1增殖檢測發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖活性呈雙重變化趨勢，在前3天內(nèi)增殖活性高于對照組細(xì)胞，尤其是第2天達(dá)到頂峰，但第4天后增殖活性低于對照組細(xì)胞；細(xì)胞計(jì)數(shù)法顯示在增殖活性最高時，實(shí)驗(yàn)組和對照組細(xì)胞分別為(5.3±0.21) ×103和 (3.8±0.24) ×103個，兩組細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果對比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而TUNEL結(jié)果顯示熒光鏡下兩組細(xì)胞的凋亡情況無明顯差異(P>0.05)。結(jié)論 ACTHR對腎上腺腫瘤的影響具有時間依賴性，但可能主要以促進(jìn)細(xì)胞增殖為主，而對凋亡影響不明顯。

人促腎上腺皮質(zhì)激素受體；H295R細(xì)胞；腎上腺腫瘤;增殖；凋亡

人促腎上腺皮質(zhì)激素受體(adrenocorti cotrophic hormone receptor, ACTHR)主要分布于腎上腺皮質(zhì)，腎上腺髓質(zhì)中鮮有報(bào)道。以往對ACTHR的認(rèn)識主要集中在其對皮質(zhì)醇激素的調(diào)節(jié)上，而關(guān)于ACTHR在腎上腺腫瘤中的研究較少。近年來相關(guān)文獻(xiàn)顯示ACTH對腎上腺的生長發(fā)育和狀態(tài)維持發(fā)揮重要作用[1]，甚至是促進(jìn)腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞增殖的誘導(dǎo)劑，而這一效應(yīng)依賴于其受體ACTHR。目前為止，關(guān)于ACTHR與腎上腺腫瘤發(fā)病機(jī)制的報(bào)道比較少見，僅有的報(bào)道集中在組織水平的檢測上，缺乏細(xì)胞水平研究。為此，我們應(yīng)用人腎上腺皮質(zhì)癌H295R細(xì)胞，研究ACTHR高表達(dá)對其增殖影響，進(jìn)而探討ACTHR在腎上腺腫瘤成瘤機(jī)制中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 H295R細(xì)胞購自美國ATCC；DMEM/F12培養(yǎng)基購自美國Invitrogen公司；Nu serum血清購自美國BD公司；ITS+1購自美國Sigma公司；ACTHR高表達(dá)通過慢病毒載體感染細(xì)胞實(shí)現(xiàn)(深圳Biowit公司)；WST-1細(xì)胞增殖檢測試劑盒和TUNEL凋亡檢測試劑盒均購自江蘇碧云天公司。cDNA合成試劑盒及熒光定量PCR SYBR Green I試劑盒(Fermentas公司)；AxyPrep總RNA小量制備試劑盒(Axygen公司)，兔抗人ACTHR抗體及羊抗兔二抗(Abcam公司)；ECL顯色試劑盒購自Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 采用DMEM/F12培養(yǎng)基+2.5%Nu serum+1%ITS+1培養(yǎng)H295R細(xì)胞，置37℃、飽和濕度、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞傳代采用0.25%胰蛋白酶，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)時盡量使細(xì)胞匯合度達(dá)到80%～90%。

1.2.2 慢病毒載體包裝ACTHR高表達(dá) 依據(jù)慢病毒包裝試劑盒說明書，按感染復(fù)數(shù)multiplicity of infection(MOI)= 20加入ACTHR高表達(dá)載體：慢病毒pLVX-mCMV-ACTHR-ZsGreen，同時加入終濃度為8 μg/mL聚凝胺，空白對照孔不加病毒，陰性對照組加無ACTHR的空病毒，輕輕混勻，置于37 ℃、 5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，感染24 h后用完全培養(yǎng)基換液。

1.2.3 熒光定量PCR 取感染48 h后的各組細(xì)胞，按RNA提取試劑盒及cDNA合成試劑盒說明書操作，分別提取RNA并合成cDNA，按熒光定量PCR SYBR Green I試劑盒說明書操作性實(shí)時定量PCR。反應(yīng)體系為25 μL, ACTHR引物參考文獻(xiàn)[2],上游引物：5′ CTCATTCATTTTGCCCAGAAAGTT 3′, 下游引物：5′GGATCTTTTCTTCCTTGTAGCACTTG 3′；GAPDH上游引物：5′- GTGAAGGTCGGAGTCAACG -3′，下游引物：5′- TGAGGTCAATGAAGGGGTC -3′。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性15 s, 60℃退火60 s，共40個循環(huán)。循環(huán)結(jié)束后計(jì)算CT值，CT值代表熒光信號由本底進(jìn)入指數(shù)增長階段達(dá)到閾值所對應(yīng)的PCR循環(huán)次數(shù)。各組ACTHR的基因表達(dá)水平按國際常用的△△CT法[3]進(jìn)行分析，進(jìn)而對比其基因高表達(dá)效果。

1.2.4 Western blot 將感染后48 h的各組細(xì)胞裂解提取蛋白，BCA方法測蛋白濃度，以10%濃度的SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜，5%脫脂奶封閉，加入兔抗人ACTHR抗體及內(nèi)參β-actin一抗，4℃孵育過夜，TBST緩沖液沖洗 PVDF膜3次，每次10 min。羊抗兔IgG二抗在37℃孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min。洗膜后用ECL化學(xué)發(fā)光法顯色，圖像經(jīng)Quantity One軟件分析后以吸光值作為半定量指標(biāo)，對比各組ACTHR蛋白表達(dá)水平進(jìn)而計(jì)算ACTHR的蛋白表達(dá)情況。

1.2.5 WST-1法檢測細(xì)胞增殖率 取對數(shù)生長期細(xì)胞，胰酶消化后按2 000個(100 μL)/孔的密度接種于96孔板。實(shí)驗(yàn)分3組，分別是pLVX-mCMV-ACTHR -ZsGreen組、陰性對照組和空白對照組。實(shí)驗(yàn)步驟按試劑盒說明書操作：取10 μL WST-1溶液加入到96孔板細(xì)胞中，培養(yǎng)1 h后在搖床上搖動1 min，混勻后在酶標(biāo)儀上測A450-A630值,每天記錄1次，共5 d；將每組細(xì)胞的吸光值，繪制細(xì)胞增殖曲線。另外，在細(xì)胞增殖活性最高時段，對各組細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，與實(shí)驗(yàn)開始時的2 000個細(xì)胞進(jìn)行對比，進(jìn)而判斷ACTHR高表達(dá)對細(xì)胞增殖的影響作用。

1.2.6 TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡 將適量對數(shù)生長期的各組細(xì)胞接種24孔板，感染后48 h行細(xì)胞凋亡檢測。按照試劑說明書操作，簡要步驟如下：經(jīng)4% 多聚甲醛固定后，PBS洗滌，室溫下3%雙氧水浸泡10 min。在4℃環(huán)境中，用細(xì)胞通透液作用2 min(或者在冰上)。PBS洗滌后滴加50 μL TUNEL反應(yīng)混合液。在密閉的暗濕盒中于37℃反應(yīng)1 h，在熒光顯微鏡下觀察并拍照。

2 結(jié) 果

2.1 Western blot 和Real-time PCR檢測ACTHR在各組細(xì)胞中的表達(dá) 與對照組相比，ACTHR mRNA水平和蛋白表達(dá)水平在慢病毒組細(xì)胞中明顯增加，其蛋白水平約增加2.4倍，mRNA表達(dá)水平增加18倍(圖1)；差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖2)。這表明慢病毒組細(xì)胞有效地促進(jìn)了ACTHR的高表達(dá)。

圖1 Western blot 檢測慢病毒感染H295R細(xì)胞后ACTHR蛋白表達(dá)水平

圖2 各組細(xì)胞ACTHR mRNA表達(dá)水平

2.2 WST-1測定ACTHR高表達(dá)對H295R細(xì)胞增殖的影響 通過連續(xù)5 d的檢測，可以看出隨著時間的推移，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞和陰性對照組細(xì)胞增殖水平呈不同變化趨勢。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖活性呈雙重變化趨勢，即呈先促進(jìn)后抑制，在前3 d內(nèi)增殖活性高于對照組細(xì)胞，尤其是在第2天達(dá)到頂峰，但第4天后增殖活性低于對照組細(xì)胞，而且隨著時間的延長這種趨勢更加明顯(P<0.05,圖3)。但對照組細(xì)胞增殖活性一直呈平穩(wěn)上升趨勢。

圖3 WST-1法測量兩組細(xì)胞的增殖情況

2.3 細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果 通過增殖曲線變化趨勢，發(fā)現(xiàn)ACTHR高表達(dá)組H295R細(xì)胞在第2天增殖活性最高，因此，選擇這一高峰時刻記錄細(xì)胞總數(shù)變化情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組和對照組細(xì)胞由最初的2 000個/孔分別達(dá)到(5.3±0.21) ×103和 (3.8±0.24) ×103個(圖4)，兩組細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果對比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.4 ACTHR過表達(dá)對H295R細(xì)胞凋亡的影響 與陰性對照組相比，熒光顯微鏡下觀察ACTHR高表達(dá)組凋亡細(xì)胞情況未見有明顯差異(P>0.05，圖5)，這說明ACTHR可能對H295R細(xì)胞凋亡無顯著作用或影響不明顯。

圖4 增殖活性最高時各組細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果

圖5 ACTHR過表達(dá)對H295R細(xì)胞凋亡的影響(×200)

3 討 論

從胚胎期到出生后，腎上腺的組織形態(tài)及細(xì)胞成分都在發(fā)生分化。這種變化與細(xì)胞增殖及凋亡密切相關(guān)的，二者維持動態(tài)平衡，一旦平衡被打破便會向著占優(yōu)勢的一方發(fā)展并引起相應(yīng)疾病[4]。與其他腫瘤不同，腎上腺腫瘤除種類繁多外，腫瘤細(xì)胞還分泌不同的激素。不同的腎上腺皮質(zhì)條帶，其細(xì)胞特性和生理功能不同，如HORNSBY等[5]認(rèn)為人出生后腎上腺發(fā)育過程中細(xì)胞增殖主要發(fā)生在球狀帶和束狀帶細(xì)胞，而細(xì)胞凋亡則主要發(fā)生在網(wǎng)狀帶細(xì)胞。就ACTHR而言，多數(shù)學(xué)者是通過ACTH刺激而間接了解其作用的。PAYET等[6]通過向腎上腺皮質(zhì)中注射ACTH發(fā)現(xiàn)球狀帶細(xì)胞增生，而束狀帶細(xì)胞萎縮；MAZZUCO等[7]發(fā)現(xiàn)球狀帶細(xì)胞刺激久了就會向束狀帶細(xì)胞分化：由此可見，腎上腺細(xì)胞自身的不同特征決定了對外界刺激的差異性。

就腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞而言，目前已經(jīng)建立的細(xì)胞系不多，除H295R細(xì)胞外，研究和應(yīng)用較多的是人腎上腺皮質(zhì)癌細(xì)胞(SW-13 cell)及小鼠腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞(Y1 cell)。與其他組織或細(xì)胞不同，腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞具有較強(qiáng)的種屬及細(xì)胞特異性[8]，Y1細(xì)胞來源于小鼠，SW-13細(xì)胞是從小細(xì)胞來源的無功能腎上腺皮質(zhì)癌中培養(yǎng)起來的細(xì)胞系[9]，不能表達(dá)重要的類固醇激素和必要的生長因子，因而上述兩種細(xì)胞的應(yīng)用均受到一定限制。H295R細(xì)胞是目前國際上研究腎上腺皮質(zhì)功能公認(rèn)的理想細(xì)胞，具有穩(wěn)定表達(dá)類固醇激素的特點(diǎn)，在激素分泌和細(xì)胞特征上與原代培養(yǎng)的人腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞最接近，被廣泛應(yīng)用于腎上腺皮質(zhì)的激素分泌、分子調(diào)控、基因多態(tài)性、腫瘤發(fā)病、藥物實(shí)驗(yàn)等各項(xiàng)研究中。

為進(jìn)一步了解ACTHR的可能作用機(jī)理，我們應(yīng)用H295R細(xì)胞進(jìn)行了后續(xù)研究。研究發(fā)現(xiàn)ACTHR高表達(dá)對H295R細(xì)胞增殖活性呈雙重影響效應(yīng)，即先促進(jìn)后抑制，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞在前3天內(nèi)增殖活性高于對照組細(xì)胞，尤其是在2天后達(dá)到頂峰，但第4天后增殖活性低于對照組細(xì)胞，而且隨著時間的延長這種趨勢更加明顯。這與既往人們對ACTH的雙重刺激認(rèn)識相符合，許多學(xué)者研究顯示ACTH對腎上腺皮質(zhì)激素及細(xì)胞生長的作用主要體現(xiàn)在刺激后早期階段，從24～72 h不等[10]。這說明ACTHR對H295R細(xì)胞有促增殖或生長作用，但具有一定的時間依賴性，在細(xì)胞凋亡檢測中未發(fā)現(xiàn)兩組細(xì)胞有差異性。腫瘤的發(fā)生往往是增殖及凋亡一方或雙方失衡引起，我們推測ACTHR對H295R細(xì)胞的影響可能以促增殖為主，對凋亡無影響或不明顯。

腫瘤的發(fā)生具有多因素參與、多環(huán)節(jié)促成的特點(diǎn)，本文初步探討了ACTHR在常見腎上腺腫瘤中的表達(dá)及其可能對腎上腺腫瘤的發(fā)生起促進(jìn)的作用。由于腎上腺腫瘤多數(shù)具有內(nèi)分泌功能，因而進(jìn)一步的研究必須考慮機(jī)體內(nèi)環(huán)境及相互影響等因素。對ACTHR的深入研究有望成為了解腎上腺腫瘤成瘤機(jī)制及激素分泌的新突破口。

[1] CHAN LF, METHERELL LA, CLARK AJ. Effects of melanocortins on adrenal gland physiology [J]. Eur J Pharmacol, 2011, 660(1):171-180.

[2] MORRIS DG, KOLA B, BORBOLI N, et al. Identification of adrenocorticotropin receptor messenger ribonucleic acid in the human pituitary and its loss of expression in pituitary adenomas [J]. J Clin Endocrinol Metab, 2003, 88(12): 6080-6087.

[3] NOGUEIRA EF, VARGAS CA, OTIS M,et al. Angiotensin-Ⅱ acute regulation of rapid response genes in human, bovine, and rat adrenocortical cells [J]. J Molecul Endocrinol, 2007, 39(6): 365-374.

[4] VINSON GP. Glomerulosa function and aldosterone synthesis in the rat[J]. J Molecul Endocrinol, 2004, 217(1-2): 59-65.

[5] HORNSBY PJ. Aging of the human adrenal cortex[J]. Ageing research reviews, 2002,1(2):229-242.

[6] PAYET N, LEHOUX JG, ISLER H. Effect of ACTH on the proliferative and secretory activities of the adrenal glomerulosa [J]. Acta endocrinologica (Copenh), 1980, 93(3):365-374.

[7] MAZZUCO TL, GRUNENWALD S, LAMPRON A, et al. Aberrant hormone receptors in primary aldosteronism [J]. Hormone & Metabol Res, 2010, 42(6):416-423.

[8] ULLERAS E, OHLSSON A, OSKARSSON A. Secretion of cortisol and aldosterone as a vulnerable target for adrenal endocrine disruption - screening of 30 selected chemicals in the human H295R cell model [J]. J Appl Toxicol, 2008, 28(8): 1045-1053.

[9] DELHANTY PG, KOETSVELD PM, GAUNA C, et al. Ghrelin and its unacylated isoform stimulate the growth of adrenocortical tumor cells via an anti-apoptotic pathway [J]. Am J Physiol Endocrinol Metab, 2007, 293(1): 302-309.

[10] XING Y, PARKER CR, EDWARDS M, RAINEY WE. ACTH is a potent regulator of gene expression in human adrenal cells[J]. J Molecul Endocrinol, 2010, 45(1):59-68.

(編輯 王 瑋)

Lentivirus-mediated over-expression of ACTHR on the proliferation of human adrenocortical H295R cells

HU Dong-liang, LIU Tong-zu,NI Dong, WANG Xing-huan

(Department of Urology, Zhongnan Hospital of Wuhan University, Wuhan 430071, China)

Objective To explore the effect of adrenocorti cotrophic hormone receptor (ACTHR) over-expression on the proliferation of human adrenocortical H295R cells, and to investigate its role in the pathogenesis of adrenal tumors. Methods H295R cells transfected by lentivirus-mediated ACTHR served as the experimental group. H295R cells without virus infection served as control group. The cell proliferation at different ACTHR levels was evaluated with WST-1 and cell count. Cell apoptosis after 48 hours was measured with TUNEL. Results Higher proliferation activity was observed in the experimental cells than in the control cells in the first three days, which peaked on the second day. But this trend reversed on the fourth day. The number of experimental and control cells were (5.3±0.21) ×103and (3.8±0.24) ×103at peak stage, (P<0.05). By contrast, there was no significant difference between the two groups in cell apoptosis. Conclusion ACTHR affects H295R cells in a time-dependent manner. It has stronger effect on the proliferation than on the apoptosis of H295R cells.

adrenocorti cotrophic hormone receptor; H295R cell; adrenal tumor;proliferation;apoptosis

2015-02-11

2015-04-27

國家自然科學(xué)基金(No.81200579)

胡東亮(1982-)，男(漢族)，醫(yī)學(xué)博士，主治醫(yī)師.研究方向：腎上腺疾病基礎(chǔ)研究.E-mail: hdlhdl2008@163.com

R691.9

A

10.3969/j.issn.1009-8291.2015.09.014