左氧氟沙星聯(lián)合芪歸銀方對(duì)銅綠假單胞菌生物膜和綠膿菌素的影響

賴曉靜，李顏伶，吳珺，徐廣，劉湉，王凱赫，母磊鑫，劉清泉，馬群*（.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 0488；.北京中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京 0488；3.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院北京市中醫(yī)研究所，中醫(yī)感染性疾病基礎(chǔ)研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 0000）

銅綠假單胞菌是醫(yī)院內(nèi)感染中常見的革蘭氏陰性病原菌，耐藥機(jī)制復(fù)雜[1]。其中生物膜（biofilm，BF）是其典型的適應(yīng)性耐藥機(jī)制之一，生物膜能幫助銅綠假單胞菌躲避人體免疫系統(tǒng)清除和抗菌藥物攻擊，對(duì)常用抗菌藥物產(chǎn)生耐藥性[2]；隨著生物膜的形成，銅綠假單胞菌的重要毒力因子綠膿菌素的分泌水平將顯著提高[3]，導(dǎo)致細(xì)菌的致病性和感染性增強(qiáng)[4-5]，病情遷延反復(fù)[6]，給臨床治療帶來了極大的挑戰(zhàn)。

隨著臨床單用抗菌藥物治療生物膜感染的效果越來越不盡如人意，聯(lián)合用藥的給藥策略獲得了廣泛的認(rèn)可[6-8]。多項(xiàng)研究表明抗菌藥物聯(lián)合中藥能有效抑制生物膜耐藥機(jī)制，提高療效[9-11]。芪歸銀方（Qiguiyin decoction，QGYD）由黃芪、金銀花、當(dāng)歸、青蒿、虎杖5味中藥配伍組成，聯(lián)合廣譜抗菌藥物使用具有良好的抗感染效果[11-12]，目前關(guān)于QGYD干預(yù)銅綠假單胞菌生物膜形成的研究還未見報(bào)道。本論文基于提取物和含藥血清兩個(gè)層次，研究芪歸銀方（QGYD）聯(lián)合左氧氟沙星（LEV）對(duì)敏感/耐藥銅綠假單胞菌生物膜和綠膿菌素的影響，為中藥聯(lián)合抗菌藥物防治生物膜感染的臨床用藥提供參考。

1 材料

1.1 菌株來源

標(biāo)準(zhǔn)銅綠假單胞菌ATCC27853一代菌株（編號(hào)：BNCC337940，北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院）；多重耐藥銅綠假單胞菌臨床分離株（樣本號(hào)：19PXSP2218，北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院檢驗(yàn)科）。

1.2 試藥

中藥飲片黃芪600 g、金銀花150 g、當(dāng)歸100 g、青蒿150 g、虎杖100 g（批號(hào)分別為90541102、93451002、90280901、93051001、90510501，北京三和藥業(yè)有限公司），經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)楊瑤君教授鑒定均為正品。左氧氟沙星對(duì)照品（批號(hào)：Y02N7C23971，HPLC≥99%，上海源葉生物技術(shù)有限公司）。左氧氟沙星片[批號(hào)：BX00A1，第一三共制藥（北京）有限公司]。

M-H瓊脂、M-H肉湯（青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司，批號(hào)分別為20210124、20201202）；0.4%草酸銨結(jié)晶紫染液（批號(hào)：R20710）、2.5%戊二醛固定液（批號(hào)：L26O11G12-8919）、氯化鎂、甘油、硫酸鉀（分析級(jí)，上海源葉生物技術(shù)有限公司）；蛋白胨（批號(hào)：20190102，北京博奧拓達(dá)科技有限公司）；濃鹽酸，氯仿（分析級(jí)，北京中醫(yī)藥大學(xué)?；饭芾韨}(cāng)庫(kù)）。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)Wistar雄性大鼠80只，體重240～280 g，許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0006，動(dòng)物批號(hào)：No.111011211101075631，購(gòu)自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物房，飼養(yǎng)條件為恒溫（24±2）℃，相對(duì)濕度為40%～70%，12 h 光照和黑暗循環(huán)模擬正常晝夜周期。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（No.4-2021113001-4079）。

1.4 儀器

立式壓力蒸汽滅菌器（型號(hào)：YXQ-100A，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司）；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（型號(hào)：DHG-9070A，上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；電熱恒溫水浴鍋（型號(hào)：HH-S6，北京科偉永興儀器有限公司）；高速冷凍離心機(jī)[型號(hào)：Sorvall ST 8R，賽默飛世爾（蘇州）儀器有限公司]；生物安全柜[型號(hào)：1374，賽默飛世爾（蘇州）儀器有限公司]；氣浴恒溫振蕩儀（型號(hào)：ZD-85，濟(jì)寧市翰業(yè)機(jī)械設(shè)備有限公司）；微生物可編程培養(yǎng)箱[型號(hào)：LT-IBX120N，立德泰勊（上海）科學(xué)儀器有限公司]；酶標(biāo)分析儀（型號(hào)：DNM-9602，北京朗新技術(shù)有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 藥物的制備

2.1.1 藥液的制備 采用課題組前期工藝優(yōu)化選定的提取方法[13]制備生藥質(zhì)量濃度為2 g·mL-1的QGYD藥液。參照臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（CLSI）（2019版）文件配制LEV對(duì)照品儲(chǔ)備液，無菌分裝-20℃凍存。課題組前期體外抑菌研究表明，單用LEV對(duì)照品藥液對(duì)銅綠假單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC27853）和耐藥菌株（19PXSP2218）的MIC分別為0.8 μg·mL-1、8 μg·mL-1；參照CLSI（2019版）中的二倍稀釋法，用MHB培養(yǎng)基將LEV對(duì)照品溶液稀釋至2、1、1/2、1/4、1/8 最低抑菌濃度（MIC）。根據(jù)QGYD臨床人日處方量（110 g生藥/60 kg）和LEV臨床人日處方量（0.6 g/60 kg），用MHB培養(yǎng)基將2 g·mL-1的QGYD藥液配制得293.3、146.7、73.3、36.7 μg·mL-1或2933.3、1466.7、733.3、366.7 μg·mL-1的QGYD藥液。依次將LEV（除1/8MIC）和QGYD藥液從高濃度到低濃度配對(duì)等體積混合，制備LEV+QGYD組藥液。LEV組藥液LEV終質(zhì)量濃度分別為0.1、0.2、0.4、0.8 μg·mL-1或1.0、2.0、4.0、8.0 μg·mL-1（1/8、1/4、1/2、1MIC），LEV+QGYD組藥液LEV終質(zhì)量濃度同LEV組，QGYD終質(zhì)量濃度分別為146.7、73.3、36.7、18.3 μg·mL-1（或1466.7、733.3、366.7、183.3 μg·mL-1）。

2.1.2 含藥血清的制備 Wistar雄性大鼠80只，隨機(jī)分為4組，分別是LEV組、QGYD組、LEV+QGYD組和空白對(duì)照組，每組20只。根據(jù)LEV說明書日給藥劑量、QGYD臨床日給藥劑量和大鼠等效劑量系數(shù)折算，LEV組大鼠LEV給藥劑量為0.0625 g/（kg·d）；QGYD組大鼠QGYD給藥劑量為11.5 g/（kg·d）；LEV+QGYD組大鼠LEV給藥劑量為0.0625 g/（kg·d），QGYD給藥劑量為11.5 g/（kg·d）；空白對(duì)照組大鼠灌胃等劑量的生理鹽水，每日2 次，連續(xù)5 d。

末次給藥前12 h禁食不禁水，灌胃后1 h經(jīng)腹主動(dòng)脈無菌手法采血，4℃離心分離血清（2500 r·min-1，20 min），同組血清混合，56℃水浴30 min滅活，-80℃保存。課題組前期血清藥理學(xué)研究表明，LEV組含藥血清對(duì)銅綠假單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株和耐藥菌株的MIC90依次為15%、55%[14]。用MHB培養(yǎng)基分別將各組血清稀釋到1MIC后，采用二倍稀釋法制備1/2、1/4、1/8MIC的含藥血清，血清終濃度為1.9%、3.8%、7.5%、15.0%或6.9%、13.8%、27.5%、55.0%（1/8、1/4、1/2、1MIC）。

2.2 銅綠假單胞菌生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

吸取0.5 MCF 銅綠假單胞菌（ATCC27853）或耐藥菌株（19PXSP2218）菌液加入藥液或含藥血清（1/8、1/4、1/2、1MIC）中，充分吹打混勻。吸取200 μL加入96孔板中，每孔銅綠假單胞菌菌濃度為1.5×106CFU·mL-1，各濃度設(shè)置4個(gè)平行孔，同時(shí)設(shè)置同稀釋比例陰性對(duì)照孔（藥液/血清）、MHB肉湯培養(yǎng)基陽(yáng)性對(duì)照孔、MHB肉湯培養(yǎng)基陰性對(duì)照孔。將96孔板置于恒溫震蕩搖床中37℃、220 r·min-1培養(yǎng)24 h。每間隔1 h用酶標(biāo)儀測(cè)定96孔板液體在波長(zhǎng)600 nm下的吸光度值（A），重復(fù)以上實(shí)驗(yàn)3次。結(jié)果見圖1、2。藥液部分結(jié)果表明，與陽(yáng)性對(duì)照組相比，當(dāng)LEV藥物濃度為1、1/2、1/4、1/8MIC時(shí)，LEV組和LEV+QGYD組銅綠假單胞菌（標(biāo)準(zhǔn)/耐藥）24 h生長(zhǎng)量均明顯降低，銅綠假單胞菌（標(biāo)準(zhǔn)/耐藥）的生長(zhǎng)均被明顯抑制。與LEV組相比，LEV聯(lián)用QGYD后對(duì)銅綠假單胞菌（標(biāo)準(zhǔn) /耐藥）的抑制作用無明顯變化。血清部分結(jié)果表明，當(dāng)血清濃度為1、1/2、1/4、1/8MIC時(shí)，與陽(yáng)性對(duì)照組相比，LEV組、QGYD組、LEV+QGYD組和空白對(duì)照組銅綠假單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株生長(zhǎng)量均明顯降低。血清濃度為1/2MIC時(shí)，LEV聯(lián)用QGYD后對(duì)銅綠假單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的抑制作用增強(qiáng)。與陽(yáng)性對(duì)照組相比，當(dāng)血清濃度為 1、1/2MIC時(shí)，LEV組、QGYD 組、LEV+QGYD組銅綠假單胞菌耐藥菌株生長(zhǎng)量均明顯降低；當(dāng)血清濃度為1/4、1/8MIC時(shí)，LEV組銅綠假單胞菌耐藥菌株生長(zhǎng)量明顯提高。與LEV組相比，當(dāng)血清濃度為1/2、1/4MIC時(shí)，LEV聯(lián)用QGYD后對(duì)銅綠假單胞菌耐藥菌株的抑制作用增強(qiáng)，血清濃度為1/8MIC時(shí)，LEV聯(lián)用QGYD后對(duì)銅綠假單胞菌耐藥菌株的抑制作用呈增強(qiáng)的趨勢(shì)。

圖1 藥液對(duì)銅綠假單胞菌菌株生長(zhǎng)的影響（±s，n＝4）Fig 1 Effect of liquid medicine on the growth of Pseudomonas aeruginosa strains（±s，n＝4）

圖2 含藥血清對(duì)銅綠假單胞菌菌株生長(zhǎng)的影響（±s，n＝4）Fig 2 Effect of medicated serum on the growth of Pseudomonas aeruginosa strains（±s，n＝4）

2.3 結(jié)晶紫染色法測(cè)定銅綠假單胞菌生物膜形成量

參照“2.1”項(xiàng)下方法制備藥液和含藥血清。吸取0.5 MCF 銅綠假單胞菌（ATCC27853）或耐藥菌株（19PXSP2218）菌液加入藥液或含藥血清（1/8、1/4、1/2、1MIC）中，充分吹打混勻。吸取200 μL加入96孔板中，每孔銅綠假單胞菌濃度為1.5×106CFU·mL-1，各濃度設(shè)置4個(gè)平行孔，同時(shí)設(shè)置MHB肉湯培養(yǎng)基陽(yáng)性對(duì)照孔、MHB肉湯培養(yǎng)基陰性對(duì)照孔。將96孔板置于恒溫培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)24 h（銅綠假單胞菌 ATCC27853）或48 h（耐藥菌株19PXSP2218）。取出96孔板，小心倒掉孔內(nèi)菌液，生理鹽水洗滌2次。加入200μL的2.5%戊二醛固定20 min（避光），生理鹽水洗滌2次。加入 200 μL 的 0.4%結(jié)晶紫染色液染色15 min（避光），生理鹽水清洗3～4次。96孔板室溫下避光放置干燥，待孔內(nèi)無明顯液體，加入200 μL 95%乙醇脫色溶解10 min，用酶標(biāo)儀測(cè)定96孔板液體595 nm波長(zhǎng)下A值，結(jié)果如圖3所示。

藥液部分結(jié)果顯示，與陽(yáng)性對(duì)照組相比，1MIC的LEV組、LEV+QGYD組銅綠假單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株生物膜形成量顯著減少。與LEV組相比，LEV+QGYD組（1、1/2、1/4、1/8MIC）銅綠假單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株生物膜形成量無減少的趨勢(shì)。與陽(yáng)性對(duì)照組相比，LEV組（1、1/2、1/4MIC）和LEV+QGYD組（1、1/2、1/4、1/8MIC）銅綠假單胞菌耐藥菌株生物膜形成量均顯著減少。與LEV組相比，LEV+QGYD組（1/2、1/4、1/8MIC）銅綠假單胞菌耐藥菌株生物膜形成量均明顯減少。

血清部分結(jié)果顯示，與陽(yáng)性對(duì)照組相比，血清濃度為1、1/2MIC的LEV組、QGYD組和空白對(duì)照組銅綠假單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株生物膜形成量均明顯減少。與LEV組相比，當(dāng)血清濃度為1/2、1/4MIC時(shí)，LEV+QGYD組銅綠假單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株生物膜形成量明顯減少。與陽(yáng)性對(duì)照組相比，當(dāng)血清濃度為1、1/2MIC時(shí)，QGYD組、LEV+QGYD組和空白對(duì)照組銅綠假單胞菌耐藥菌株生物膜形成量明顯減少。與陽(yáng)性對(duì)照組相比，LEV組（1MIC）銅綠假單胞菌耐藥菌株生物膜形成量明顯減少，LEV組（1/8MIC）生物膜形成量明顯增加。與LEV組相比，LEV+QGYD組（1、1/2、1/4、1/8MIC）、QGYD組（1/2、1/4MIC）和空白對(duì)照組（1/2、1/4MIC）銅綠假單胞菌耐藥菌株生物膜形成量明顯減少。

2.4 氯仿萃取法測(cè)定銅綠假單胞菌的綠膿菌素含量

參照上述方法，用PDP培養(yǎng)基（不含瓊脂）替代MHB培養(yǎng)基稀釋藥液和含藥血清后，吸取0.5 MCF 銅綠假單胞菌（ATCC27853）或銅綠假單胞菌（19PXSP2218）菌液加入藥液或含藥血清（終濃度為1/8、1/4、1/2、1MIC）中，充分吹打混勻，每支搖菌管中銅綠假單胞菌菌濃度為1.5×106CFU·mL-1，體系為1 mL。將搖菌管放入恒溫震蕩搖床37℃、220 r·min-1培養(yǎng)24 h。實(shí)驗(yàn)設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照組和陰性對(duì)照組，每組設(shè)5個(gè)平行（血清3個(gè)平行），重復(fù)實(shí)驗(yàn) 3 次。吸取 860μL 的含菌液體加入到1.5 mL的離心管中，12 000 r·min-1離心1 min。吸取800 μL上清液轉(zhuǎn)移至2 mL的離心管中，加入800 μL的氯仿，渦旋混勻后，4500 r·min-1離心 10 min，可觀察到液體分層，上層為淡黃色，下層由無色變?yōu)榈{(lán)色或藍(lán)綠色。吸取700 μL下層液體移至1.5 mL的離心管中，并加入140 μL的0.2 mol·L-1稀鹽酸，渦旋混勻后，4500 r·min-1離心10 min?？捎^察到液體分層，上層液體由無色轉(zhuǎn)為粉色或紫紅色，下層液體變?yōu)闊o色。吸取100 μL上層液體加入96孔板，用酶標(biāo)儀檢測(cè)520 nm波長(zhǎng)下吸光度值。結(jié)果如圖4所示。

圖4 藥液（A）和含藥血清（B）對(duì)銅綠假單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC27853）和耐藥菌株（19PXSP2218）綠膿菌素的影響Fig 4 Effect of liquid medicine（A）and medicated serum（B）on the secretion of pyocyanin in Pseudomonas aeruginosa standard strain（ATCC27853）and drug-resistant strain（19PXSP2218）（±s，n＝5）

藥液部分結(jié)果表明，當(dāng)LEV藥物濃度為1、1/2、1/4、1/8MIC時(shí)，與陽(yáng)性對(duì)照組相比，LEV組和LEV+QGYD組銅綠假單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株綠膿菌素分泌量均明顯減少。當(dāng)LEV藥物濃度為1/2、1/4MIC時(shí)，LEV聯(lián)用QGYD后抑制銅綠假單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株綠膿菌素產(chǎn)生的作用明顯增強(qiáng)。與陽(yáng)性對(duì)照組相比，LEV組（1、1/2、1/4MIC）和LEV+QGYD組（1、1/2、1/4、1/8MIC）銅綠假單胞菌耐藥菌株綠膿菌素分泌量均明顯減少。與LEV組相比，當(dāng)LEV濃度為1/2MIC時(shí)，LEV聯(lián)用QGYD后抑制銅綠假單胞菌耐藥菌株產(chǎn)生綠膿菌素的作用明顯增強(qiáng)。

血清部分結(jié)果表明，與陽(yáng)性對(duì)照組相比，當(dāng)血清濃度為1、1/2、1/4MIC時(shí)，QGYD組、LEV+QGYD組和空白對(duì)照組銅綠假單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株綠膿菌素分泌量明顯減少。與陽(yáng)性對(duì)照組相比，LEV組（1、1/2MIC）銅綠假單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株綠膿菌素分泌量明顯減少；LEV組（1/4MIC）無明顯變化；LEV組（1/8MIC）綠假單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株綠膿菌素分泌量增加。與LEV組相比，LEV+QGYD組（1/2、1/4MIC）和QGYD組（1/4、1/8MIC）銅綠假單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株綠膿菌素分泌量均明顯減少，空白對(duì)照組（1、1/2、1/4、1/8MIC）無明顯變化。當(dāng)血清濃度為1、1/2、1/4、1/8MIC時(shí)，與陽(yáng)性對(duì)照組相比，LEV組、QGYD組、LEV+QGYD組和空白對(duì)照組銅綠假單胞菌耐藥菌株綠膿菌素分泌量均明顯減少。與LEV組相比，當(dāng)血清濃度為1/8MIC時(shí)，LEV+QGYD組、QGYD組和空白對(duì)照組銅綠假單胞菌耐藥菌株綠膿菌素分泌量均明顯減少。

2.5 大鼠含藥血清中LEV濃度的測(cè)定

本研究沿用課題組前期確定的 UPLC-MS/MS測(cè)定大鼠含藥血清中LEV的濃度[14]。用甲醇作溶劑制備80、40、20、10、4、2、1、0.4μg·mL-1的LEV系列對(duì)照溶液，同時(shí)制備環(huán)丙沙星（20 μg·mL-1）內(nèi)標(biāo)溶液。取空白血清20 μL，分別加入LEV系列溶液和內(nèi)標(biāo)溶液（20μg·mL-1）各5 μL，加入50 μL甲醇沉淀蛋白，渦旋1 min，4℃離心15 min（14 000 r·min-1），取上清液，氮?dú)獯蹈珊蠹尤? mL初始比例的流動(dòng)相復(fù)溶，渦旋30 s，4℃離心15 min（14 000 r·min-1）取上清液，進(jìn)樣1 μL分析測(cè)定，含藥血清用相同方法處理并進(jìn)樣分析。

① 色譜條件：Waters Acquity TMUPLC色譜柱ACQUITYCSHC18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），流速0.3 mL·min-1，樣品室溫度10℃，柱溫40℃，進(jìn)樣體積1 μL。流動(dòng)相0.1%甲酸水（A）-乙腈（B），梯度洗脫：0～0.1 min，90%→85%A；0.1～3.0 min，85%→20%A；3.0～3.5 min，20%→90%A。② 質(zhì)譜條件：Waters三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，采用電噴霧離子源，正離子檢測(cè)模式，離子對(duì)選擇LVFXm/z362.2395～261.1767，錐孔電壓44 V，碰撞能量22 eV；CPFXm/z332.1651～245.1919，錐孔電壓42 V，碰撞能量20 eV。毛細(xì)管電壓2.5 kV，離子源溫度150℃，去溶劑氣溫度350℃，去溶劑氣流速650 L·h-1，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式檢測(cè)。測(cè)得LEV在大鼠血清中標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y＝0.057 97x+0.1266（r＝0.9991）。LEV在 2～400 ng·mL-1與峰面積線性關(guān)系良好。含藥血清中LEV的質(zhì)量濃度結(jié)果如表1所示。

表1 含藥血清中左氧氟沙星的藥物濃度(n＝6)Tab 1 Concentration of levofloxacin in the serum with drug (n＝6)

2.6 大鼠血清中 TNF-α和 IL-2 的測(cè)定

測(cè)定結(jié)果見表2，與空白對(duì)照組相比，LEV組TNF-α表達(dá)水平明顯升高，IL-2表達(dá)水平無明顯變化；QGYD組、QGYD聯(lián)合LEV組TNF-α和IL-2均無明顯變化。與LEV組相比，QGYD聯(lián)合LEV組TNF-α和IL-2表達(dá)水平均明顯降低。

表2 含藥血清中TNF-α和IL-2表達(dá)水平(n＝5，ng·mL-1)Tab 2 TNF-α and IL-2 expression in the serum with drug (n＝5，ng·mL-1)

2.7 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS Statistics 21.0、GraPhPad Prism 8.0.1分別進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和作圖，計(jì)量資料采用±s表示，符合正態(tài)分布且方差齊時(shí)采用單因素方差分析，組間比較采用LSD-t法，符合正態(tài)分布但方差不齊時(shí)采用單因素方差分析，組間比較采用Dunnett-T3法，對(duì)不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用非參數(shù)檢驗(yàn)。

3 討論

LEV是一種氟喹諾酮類抗菌藥物，具有廣譜和強(qiáng)效的抗菌特點(diǎn)，對(duì)銅綠假單胞菌的抗菌活性顯著，中國(guó)成人社區(qū)獲得性肺炎和治療指南中推薦LEV與其他藥物聯(lián)合用于臨床上耐藥銅綠假單胞菌感染的治療。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于中藥聯(lián)合抗菌藥物對(duì)細(xì)菌生物膜和綠膿菌素影響的研究多為體外研究[15-18]，但中藥復(fù)方復(fù)雜的成分和理化性質(zhì)，會(huì)對(duì)體外抑菌實(shí)驗(yàn)形成干擾，影響研究結(jié)果的準(zhǔn)確性和科學(xué)性[19-20]。血清藥理學(xué)為中藥復(fù)方提供了新的思路[21]，中藥含藥血清不受無機(jī)鹽、鞣質(zhì)等化學(xué)成分，滲透壓和pH值等物理因素的影響，更符合中藥在體內(nèi)代謝的實(shí)際情況，有利于中藥復(fù)方的藥效及作用機(jī)制研究[22-23]。本文針對(duì)銅綠假單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株和耐藥菌株兩種菌株，基于QGYD中藥提取物和含藥血清兩個(gè)層次開展生物膜和綠膿菌素的研究，同時(shí)實(shí)驗(yàn)測(cè)得LEV組與LEV+QGYD組血清中LEV含量相近（分別為6.14 μg·mL-1和5.12 μg·mL-1），避免了聯(lián)用組血清中抗菌藥物濃度高于單用組血清影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的現(xiàn)象，同時(shí)本研究測(cè)定了各組大鼠血清中炎癥因子的表達(dá)量，探索QGYD增敏LEV的作用機(jī)制，可為中藥聯(lián)合抗菌藥物防治生物膜感染的研究提供參考。

本文基于體外和半體內(nèi)兩個(gè)層次對(duì)LEV聯(lián)合QGYD對(duì)銅綠假單胞菌生物膜和綠膿菌素的影響進(jìn)行研究，體外實(shí)驗(yàn)表明：LEV組和LEV+QGYD組藥液均能抑制銅綠假單胞菌（標(biāo)準(zhǔn)/耐藥）的生長(zhǎng)；LEV組、LEV+QGYD組藥液對(duì)銅綠假單胞菌（標(biāo)準(zhǔn)/耐藥）生物膜的形成、綠膿菌素分泌量均具有一定的抑制作用，LEV聯(lián)用QGYD后抑制作用增強(qiáng)。含藥血清實(shí)驗(yàn)表明：LEV組、LEV+QGYD組血清均能抑制銅綠假單胞菌（標(biāo)準(zhǔn)/耐藥）的生長(zhǎng)，LEV+QGYD后對(duì)銅綠假單胞菌（標(biāo)準(zhǔn)/耐藥）的抑制作用增強(qiáng)；LEV組、LEV+QGYD組均能抑制銅綠假單胞菌（標(biāo)準(zhǔn)/耐藥）生物膜的形成和綠膿菌素的分泌，LEV聯(lián)用QGYD后抑制作用增強(qiáng)。體外和含藥血清研究結(jié)果趨勢(shì)一致，互相支持。進(jìn)一步表明了聯(lián)合QGYD能增強(qiáng)LEV的抗菌活性，有效抑制銅綠假單胞菌生物膜的形成和綠膿菌素的分泌，為中藥與抗菌藥物聯(lián)用防治細(xì)菌生物膜耐藥提供可靠的科學(xué)依據(jù)。本論文采用 ELISA 分子生物學(xué)技術(shù)測(cè)定LEV單用及聯(lián)用QGYD時(shí)大鼠血清免疫因子的變化，結(jié)果表明QGYD增強(qiáng)LEV抗菌活性的作用可能與免疫因子相關(guān)。課題組前期研究證實(shí)，QGYD能通過下調(diào)TLR4/MyD88/NF-κB 信號(hào)通路關(guān)鍵基因和蛋白的表達(dá)，調(diào)控TNF-α、IL-6、IL-12等炎性因子的表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)紊亂，維持機(jī)體免疫平衡[12]，本實(shí)驗(yàn)與前期研究相一致。

本文基于藥效學(xué)研究探討中藥與抗菌藥物聯(lián)用防治細(xì)菌生物膜耐藥的作用，并進(jìn)行相關(guān)機(jī)制初探，后期會(huì)繼續(xù)探討中藥與抗菌藥物聯(lián)用防治細(xì)菌生物膜耐藥的作用機(jī)制，為臨床給藥方案的優(yōu)化提供支持。