基于UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)的脈絡(luò)寧注射液酯提廢渣大孔樹(shù)脂富集液的化學(xué)成分鑒定和含量測(cè)定

魯正熹，姚靜遠(yuǎn)，印敏，李林蔚，何曉東，劉群，李劍，陳雨*（.江蘇衛(wèi)生健康職業(yè)學(xué)院，南京 009；.江蘇省中國(guó)科學(xué)院植物研究所/江蘇省中藥材生態(tài)種植與高值化利用工程研究中心，南京 00；.南京金陵藥業(yè)股份有限公司，南京 0009；.河南金陵金銀花藥業(yè)有限公司，河南 新鄉(xiāng) 500）

脈絡(luò)寧注射液，為黃棕色至紅棕色的澄清液體，由金銀花、山銀花、牛膝、玄參、石斛等組成，有清熱養(yǎng)陰、活血化瘀的功效，臨床上用于治療血栓閉塞性脈管炎[1]、急性缺血性腦血管病[2]、急性腦梗死[3]、靜脈血栓形成[4]、動(dòng)脈硬化性閉塞癥[5]、腦血栓形成及后遺癥[6]。有研究表明，脈絡(luò)寧注射液在一定程度上對(duì)治療急性缺血性卒中[7]、腰椎間盤(pán)突出癥[8]、非酒精性脂肪肝[9]、急性肺損傷[10]，喉頭水腫[11]等也有效。

脈絡(luò)寧注射液采用水煎煮提取藥效物質(zhì)，經(jīng)乙醇沉淀、乙酸乙酯萃取、濃縮等精制而得[12]，導(dǎo)致在生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生了大量廢渣。中藥廢渣的處理一直是我國(guó)醫(yī)藥行業(yè)和環(huán)境行業(yè)所關(guān)注的問(wèn)題，通常采用填埋、焚燒、固定區(qū)域堆放等措施處理，但會(huì)對(duì)周?chē)乃|(zhì)、土壤和空氣造成嚴(yán)重的污染，影響環(huán)境質(zhì)量，且耗費(fèi)大量資金[13]，因此對(duì)中藥廢渣的資源再利用極其重要。到目前為止，有關(guān)脈絡(luò)寧注射液廢渣的資源再利用，主要是對(duì)水提和醇沉物的研究[12，14-16]。乙酸乙酯萃取后的母液廢渣，為生產(chǎn)脈絡(luò)寧注射液過(guò)程中的廢棄物之一，如不進(jìn)行資源化再次利用，不僅造成浪費(fèi)，而且作為廢渣排放還會(huì)造成二次污染。本研究運(yùn)用超高效液相-四極桿串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)（ultraperformance liquid chromatography quadrupole time-of-flight mass spectrometry，UPLC-Q-TOF-MS）對(duì)脈絡(luò)寧注射液酯提廢渣化學(xué)成分進(jìn)行鑒定，并對(duì)其中的酚酸類(lèi)成分（綠原酸、異綠原酸A和異綠原酸C）和三萜皂苷類(lèi)成分（灰氈毛忍冬皂苷甲和灰氈毛忍冬皂苷乙）進(jìn)行定量分析，以期為脈絡(luò)寧注射液酯提廢渣資源再利用提供科學(xué)參考，從而為后續(xù)中藥渣的回收利用和環(huán)境保護(hù)奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 1260 UPLC-DAD-6530 ESI-Q-TOF-MS液質(zhì)聯(lián)用儀（美國(guó)Agilent公司）；KQ-400KDE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；JY/YP型電子天平（上海良平儀器儀表有限公司）；SPING-S5i超純水儀（南京妙之儀電子科技有限公司）；OSB-2200型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（日本EYELA公司）；Q-TOF Quantitative Analysis定量軟件；Molecular Structure Correlator結(jié)構(gòu)鑒定軟件。

1.2 試藥

甲醇（色譜純，美國(guó)TEDIA公司）；無(wú)水乙醇（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；甲酸（色譜純，美國(guó)ROE SCIENTIFIC INC公司）；蒸餾水（屈臣氏）；ASD-7大孔吸附樹(shù)脂（鄭州和成新材料科技有限公司）；硅膠（青島海洋化工廠(chǎng)）；綠原酸（批號(hào)：0753-9607）、異綠原酸A（批號(hào)：111782-201807）、異綠原酸C（批號(hào)：111894-202104）（中國(guó)食品藥品檢定研究院）；灰氈毛忍冬皂苷甲、灰氈毛忍冬皂苷乙來(lái)自本課題組分離，所有對(duì)照品純度均大于95%。

本研究所用脈絡(luò)寧注射液酯提廢渣來(lái)自金陵藥業(yè)股份有限公司，共8個(gè)批次，分別為20210228、20210301、20210302、20210303、20210312、201210313、20210314、20210315。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 供試品溶液的制備 稱(chēng)取一定質(zhì)量的脈絡(luò)寧注射液酯提廢渣，廢渣-水為1∶10稀釋?zhuān)♂屢航?jīng)ASD-7大孔樹(shù)脂柱梯度洗脫，洗脫劑為0%、10%、90%、100%乙醇水溶液，取90%乙醇水溶液洗脫部位500 μL，氮吹至干，1 mL甲醇溶解，甲醇稀釋10倍，過(guò)0.45 μm微孔濾膜，即得。其中90%乙醇水溶液部位大孔樹(shù)脂得率為43.31%～60.77%，8批脈絡(luò)寧注射液酯提浸膏過(guò)大孔樹(shù)脂后90%乙醇水溶液部分干燥質(zhì)量分別為11.5、12.0、12.1、12.4、18.5、17.9、22.4、28.5 mg。

2.1.2 對(duì)照品儲(chǔ)備溶液的制備 精密稱(chēng)定綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C、灰氈毛忍冬皂苷甲和灰氈毛忍冬皂苷乙，制成33.33、16.67、33.33、16.67、66.67 μg·mL-1的對(duì)照品儲(chǔ)備溶液，冷藏備用。

2.2 色譜條件

色譜柱Agilent Poroshell 120 SB-AQ C18（3.0 mm×100 mm，2.7 μm）；柱溫0～20 min，20℃；20～75 min，40℃；流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液（A）-甲醇（B），梯度洗脫（0～20 min，20%～25%B；20～25 min，25%～35%B；25～40 min，35%～50%B；40～75 min，50%～70%B）；流速為0.3 mL·min-1；進(jìn)樣量為5 μL。

2.3 質(zhì)譜條件

采用ESI離子源，離子化模式為負(fù)離子模式，毛細(xì)管電壓為3.5 kV，干燥氣溫度350℃，裂解電壓為：酚酸、黃酮和環(huán)烯醚萜90 V，三萜皂苷210 V，碰撞能量為195 V，霧化氣體為N2，離子掃描范圍為m/z100～1700，霧化氣壓力50 psi，干燥氣流速10.0 L·min-1，Skimmer電壓65 V。

2.4 UPLC-Q-TOF-MS定量方法學(xué)考察

2.4.1 專(zhuān)屬性試驗(yàn) 精密吸取混合對(duì)照品溶液和供試品溶液適量，進(jìn)樣分析，各成分出峰位置無(wú)干擾組分，表明本法專(zhuān)屬性良好，符合液質(zhì)定量分析要求，典型色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 混合對(duì)照品（A）和脈絡(luò)寧注射液酯提廢渣（B）UPLC-Q-TOF-MS圖Fig 1 UPLC-Q-TOF-MS of mixed control（A）and Mailuoning injection ester extraction residue（B）

2.4.2 線(xiàn)性關(guān)系、檢測(cè)限和定量限 分別精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液適量于5 mL具塞棕色量瓶中，以甲醇逐步稀釋配成系列混合對(duì)照品溶液，進(jìn)樣測(cè)定峰面積，以峰面積（Y）對(duì)對(duì)照品質(zhì)量濃度（X）進(jìn)行線(xiàn)性回歸，計(jì)算5種分析物的回歸方程，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 5種分析物的線(xiàn)性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢測(cè)限和定量限Tab 1 Linear ranges，calibration curves，coefficients，limit of quantitation and detection of 5 analytes

2.4.3 精密度試驗(yàn) 取供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，分別計(jì)算5種分析物峰面積的RSD，結(jié)果峰面積的日內(nèi)精密度RSD在2.3%～4.5%，表明儀器精密度良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液，分別于0、4、8、12、24 h進(jìn)樣分析，分別計(jì)算5種分析物峰面積的RSD，結(jié)果峰面積的RSD分別在0.60%～4.6%，表明測(cè)定成分在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取平行制備的6份供試品溶液（批號(hào)：20210303），進(jìn)樣測(cè)定峰面積，計(jì)算得綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C、灰氈毛忍冬皂苷甲和灰氈毛忍冬皂苷乙的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為10.98、3.92、8.06、36.90、3.87 mg·g-1，峰面積的RSD分別為0.80%、1.7%、1.6%、0.60%、1.0%，表明方法重復(fù)性良好。

2.4.6 加樣回收試驗(yàn) 取已知含量的脈絡(luò)寧注射液酯提廢渣處理液9份（批號(hào)：20210314），分別加入低、中、高3個(gè)濃度的混合對(duì)照品溶液，進(jìn)行含量測(cè)定，計(jì)算得5個(gè)成分的加樣回收率為95.38%～103.06%，RSD為0.76%～1.8%，表明本方法準(zhǔn)確性良好。

2.5 UPLC-Q-TOF-MS定性分析脈絡(luò)寧注射液酯提廢渣

經(jīng)過(guò)色譜條件優(yōu)化，供試品溶液在負(fù)離子模式下的色譜圖得到了良好的分離效果及離子化效率，其TIC圖見(jiàn)圖2。

圖2 負(fù)離子模式下的脈絡(luò)寧注射液酯提廢渣TIC圖Fig 2 Total ion chromatogram of Mailuoning injection ester extract ion residues at the negative ion mode

樣品經(jīng)UPLC-Q-TOF-MS進(jìn)行一級(jí)及二級(jí)質(zhì)譜采集，獲得提取液中各色譜峰的保留時(shí)間、準(zhǔn)分子離子峰及MS/MS碎片離子的精確相對(duì)分子質(zhì)量信息。若目標(biāo)成分與其對(duì)照品（無(wú)對(duì)照品的與參考文獻(xiàn)數(shù)據(jù)比對(duì)[17-18]）的保留時(shí)間、準(zhǔn)分子離子峰和二級(jí)特征離子吻合，以及Agilent定性軟件推斷碎片離子破碎規(guī)律，據(jù)此鑒定色譜峰。推斷出脈絡(luò)寧注射液酯提廢渣中42個(gè)化合物的結(jié)構(gòu)，包括9個(gè)酚酸類(lèi)化合物、9個(gè)黃酮類(lèi)化合物、10個(gè)環(huán)烯醚萜類(lèi)化合物、8個(gè)三萜皂苷類(lèi)成分化合物、5個(gè)苯丙素類(lèi)化合物和1個(gè)聯(lián)芐類(lèi)化合物，結(jié)果見(jiàn)表2。

續(xù)表2

2.6 各類(lèi)化合物結(jié)構(gòu)解析規(guī)律

2.6.1 酚酸類(lèi)化合物的結(jié)構(gòu)鑒定 本文從脈絡(luò)寧注射液酯提廢渣中鑒定了9個(gè)綠原酸類(lèi)化合物。通過(guò)MS1圖譜確定化合物5的準(zhǔn)分子離子峰為m/z353.0866 [M-H]-，預(yù)測(cè)分子式為C16H18O9。MS2圖譜中主要的碎片離子為m/z191.0551、179.0321、173.0448、161.0225、127.0384、93.0327，分別計(jì)算其元素組成為C7H11O6-、C9H7O4-、C7H9O5-、、C6H7O3-和C6H5O-。綠原酸準(zhǔn)分子離子峰m/z353.0866脫去一分子咖啡?；纬蒻/z191.0511或者脫去一分子奎寧?；纬蒻/z179.0321，m/z179.0321再脫去一分子H2O形成m/z161.0225，m/z191.0511再脫去一分子H2O形成m/z173.0448，再脫去一分子HCOOH形成m/z127.0384或者脫去兩分子H2O和一分子CO2形成m/z93.0327，與對(duì)照品比對(duì)后推斷為綠原酸。其 MS2質(zhì)譜和具體的質(zhì)譜裂解行為見(jiàn)圖3。

圖3 綠原酸的二級(jí)質(zhì)譜圖和質(zhì)譜裂解途徑推斷Fig 3 MS/MS spectra and MS fragmentation pathway deduction of chlorogenic acid

雙取代酚酸類(lèi)化合物，通過(guò)MS1圖譜確定化合物13的準(zhǔn)分子離子峰為m/z515.1165 [MH]-，預(yù)測(cè)分子式為C25H24O12。MS2圖譜中主要的碎片離子為m/z353.0827、335.0734、191.0540、179.0323、173.0427、135.0426，分別計(jì)算其元素組成為C16H17O9-、C16H15O8-、C7H11O6-、、C7H9O5-、C8H7O2-。其中碎片離子m/z353.0827是由準(zhǔn)分子離子峰m/z515.1165脫去一分子咖啡?；–9H6O3）形成，m/z335.0734是由碎片離子m/z353.0827脫去一分子H2O形成，m/z191.0540是由碎片離子m/z353.0827脫去一分子咖啡?；–9H6O3）形成的奎寧酸負(fù)離子，m/z179.0323是碎片離子m/z353.0827脫去一分子奎寧?；–7H10O5）形成的咖啡酸負(fù)離子，m/z173.0448是m/z191.0540脫去一分子H2O形成，m/z135.0426是由碎片離子m/z179.0323脫去一分子CO2形成，與對(duì)照品比對(duì)后推斷為異綠原酸A。其MS2質(zhì)譜和具體的質(zhì)譜裂解行為見(jiàn)圖4。

圖4 異綠原酸A的二級(jí)質(zhì)譜圖和質(zhì)譜裂解途徑推斷Fig 4 MS/MS spectra and MS fragmentation pathway deduction of isochlorogenic acid A

2.6.2 黃酮類(lèi)化合物的結(jié)構(gòu)鑒定 本文從脈絡(luò)寧注射液酯提廢渣中鑒定了9個(gè)黃酮類(lèi)化合物。通過(guò)MS1圖譜確定化合物19的準(zhǔn)分子離子峰為m/z447.0908 [M-H]-，預(yù)測(cè)分子式為C21H20O11。MS2圖譜中，主要的碎片離子為m/z285.0381，是由木犀草苷的準(zhǔn)分子離子峰447.0908脫去一分子葡萄糖（C6H10O5）形成。與對(duì)照品比對(duì)后推斷為木犀草苷。其MS2質(zhì)譜和具體的質(zhì)譜裂解行為見(jiàn)圖5。

圖5 木犀草苷的二級(jí)質(zhì)譜圖和質(zhì)譜裂解途徑推斷Fig 5 MS/MS spectra and MS fragmentation pathway deduction of cynaroside

2.6.3 環(huán)烯醚萜苷類(lèi)化合物的結(jié)構(gòu)鑒定 本文從脈絡(luò)寧注射液酯提廢渣中鑒定了10個(gè)環(huán)烯醚萜苷類(lèi)化合物。通過(guò)MS1圖譜確定化合物8的準(zhǔn)分子離子峰為m/z403.1249 [M-H]-，預(yù)測(cè)分子式為C17H24O11。MS2圖譜中主要的碎片離子為m/z371.0926、223.0582、179.0660、165.0534、121.0270，分別計(jì)算其元素組成為C16H19O10-、C11H11O5-、C6H11O6-、C9H12O3-、C7H10O2-，其中碎片離子m/z371.0926是由準(zhǔn)分子離子峰m/z403.1249脫去一分子CH3OH形成，碎片離子m/z223.0582是由準(zhǔn)分子離子峰m/z403.1249脫去一分子葡萄糖（C6H12O6）形成，碎片離子m/z179.0660是脫去一分子葡萄糖形成的碎片離子，碎片離子m/z165.0534是由碎片離子m/z223.0582脫去COOCH2形成，碎片離子m/z165.0534脫去一分子CO2形成碎片離子m/z121.0270。與對(duì)照品比對(duì)后推斷為斷氧化馬錢(qián)子苷。其MS2質(zhì)譜和具體的質(zhì)譜裂解行為見(jiàn)圖6。

圖6 斷氧化馬錢(qián)子苷的二級(jí)質(zhì)譜圖和質(zhì)譜裂解途徑推斷Fig 6 MS/MS spectra and MS fragmentation pathway deduction of secoxyloganin

2.6.4 三萜皂苷類(lèi)化合物的結(jié)構(gòu)鑒定 本文從脈絡(luò)寧注射液酯提廢渣中鑒定了8個(gè)三萜皂苷類(lèi)化合物。通過(guò)MS1圖譜確定化合物35的準(zhǔn)分子離子峰為m/z1397.6427 [M-H]-，預(yù)測(cè)分子式為C65H106O32。MS2圖譜中主要的碎片離子為m/z1073.5338、911.4834，分別計(jì)算其元素組成為C53H85O22-、C47H75O17-，其中相對(duì)豐度最高的碎片離子m/z1073.5338是由準(zhǔn)分子離子峰m/z1397.6427脫去兩分子葡萄糖（C12H20O10）形成，m/z1073.5338脫去一分子鼠李糖形成碎片離子m/z911.4834。與對(duì)照品比對(duì)后推斷為灰氈毛忍冬皂苷乙。其MS2質(zhì)譜和具體的質(zhì)譜裂解行為見(jiàn)圖7。

圖7 灰氈毛忍冬皂苷乙的二級(jí)質(zhì)譜圖和質(zhì)譜裂解途徑推斷Fig 7 MS/MS spectra and MS fragmentation pathway deduction of macranthoidin B

2.6.5 苯丙素類(lèi)化合物的結(jié)構(gòu)鑒定 本文從脈絡(luò)寧注射液酯提廢渣中鑒定了5個(gè)苯丙素類(lèi)化合物。通過(guò)MS1圖譜確定化合物23的準(zhǔn)分子離子峰為m/z783.2668 [M-H]-。MS2圖譜中主要的碎片離子為m/z607.2151、461.1614、329.1203、175.0393，分別計(jì)算其元素組成為C26H39O16-、C20H29O12-、C15H21O8-、C10H7O3-。其中碎片離子m/z607.2151是分子離子峰脫去阿魏?；–10H8O3）所形成，m/z607.2151 脫去一分子鼠李糖基（C6H10O4）形成碎片離子m/z461.1614，碎片離子m/z329.1203是碎片離子m/z461.1614脫去C5H8O4形成，碎片離子m/z175.0393是碎片離子m/z329.1203脫去C5H14O5形成，其MS2質(zhì)譜和具體的質(zhì)譜裂解行為見(jiàn)圖8。

圖8 安格洛苷C的二級(jí)質(zhì)譜圖和質(zhì)譜裂解途徑推斷Fig 8 MS/MS spectra and MS fragmentation pathway deduction of angoroside C

2.6.6 聯(lián)芐類(lèi)化合物的結(jié)構(gòu)鑒定 本文從脈絡(luò)寧注射液酯提廢渣中鑒定了1個(gè)聯(lián)芐類(lèi)化合物。通過(guò)MS1圖譜確定化合物34的準(zhǔn)分子離子峰為m/z303.1239 [M-H]-。MS2圖譜中主要的碎片離子為m/z221.1564，分別計(jì)算其元素組成為C13H17O3-。其中碎片離子m/z221.1564是碎片離子m/z303.1239脫去C4H3O2形成，其MS2質(zhì)譜和具體的質(zhì)譜裂解行為見(jiàn)圖9。

圖9 杓唇石斛素的二級(jí)質(zhì)譜圖和質(zhì)譜裂解途徑推斷Fig 9 MS/MS spectra and MS fragmentation pathway deduction of moscatilin

2.7 樣品含量測(cè)定

取8批脈絡(luò)寧注射液酯提廢渣制備供試品溶液，對(duì)8 批脈絡(luò)寧注射液酯提廢渣大孔樹(shù)脂富集液的5種有效成分進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表3。

3 討論

本試驗(yàn)對(duì)大孔樹(shù)脂富集（0%→10%→100%乙醇水溶液洗脫）脈絡(luò)寧注射液酯提廢渣化學(xué)成分的程度進(jìn)行了考察，洗脫劑分別為0%→10%→50%→100%乙醇水溶液；0%→ 20%→50%→100%乙醇水溶液和0%→ 10%→ 60%/70%/80%/90%乙醇水溶液；經(jīng)液相色譜結(jié)果分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)洗脫劑為0%→10%→90%乙醇水溶液梯度洗脫時(shí)，90%乙醇部位主要化學(xué)成分富集程度最大。

由脈絡(luò)寧注射液酯提廢渣鑒定結(jié)果表明，其中環(huán)烯醚萜苷類(lèi)成分最多，推測(cè)脈絡(luò)寧酯提廢渣中可能含有較多的金銀花和山銀花原藥材成分；含量測(cè)定結(jié)果顯示，脈絡(luò)寧注射液酯提廢渣大孔樹(shù)脂富集液中三萜皂苷類(lèi)成分（灰氈毛忍冬皂苷甲和灰氈毛忍冬皂苷乙）的含量最高，其次為酚酸類(lèi)成分（綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C），表明廢渣中含有豐富的原藥材活性成分，尤其是酚酸類(lèi)和三萜皂苷類(lèi)成分含量較高。

以往的中藥廢棄物的主要用途是作為有機(jī)肥料[19]、微生物發(fā)酵產(chǎn)物[20]、燃料和飼料添加劑，以及開(kāi)發(fā)高附加值的資源產(chǎn)品[21]。該研究采用ASD-7大孔樹(shù)脂柱富集方法和UHPLC-Q-TOFMS技術(shù)建立了脈絡(luò)寧注射液酯提廢渣大孔樹(shù)脂富集液中化學(xué)成分的鑒定以及5種有效成分的含量測(cè)定方法，通過(guò)液相色譜的分離和質(zhì)譜的檢測(cè)，推斷了脈絡(luò)寧注射液酯提廢渣的主要化學(xué)成分組成，并對(duì)其中酚酸類(lèi)和三萜皂苷類(lèi)成分進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果明確了多種中藥材活性成分在廢渣中的含量，首次實(shí)現(xiàn)了脈絡(luò)寧注射液酯提廢渣化學(xué)成分的鑒定和有效成分的含量測(cè)定，為脈絡(luò)寧注射液酯提廢渣后續(xù)再利用提供了科學(xué)依據(jù)。