基于UPLC-Q-TOF HRMS技術(shù)建立逍遙丸指紋圖譜及化學(xué)成分鑒定

王雅靜，周思倩，，馮敏，潘呂婷，趙洪慶，吳娟，，邵樂，龍紅萍*（.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，長沙 4008；.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，長沙 40007）

逍遙丸出自《太平惠民和劑局方》，由柴胡、當(dāng)歸、白芍、白術(shù)、茯苓等8味中藥組成，有疏肝健脾、養(yǎng)血調(diào)經(jīng)之功效，常用于治療神經(jīng)疾病、免疫疾病和婦科疾病，是主治“肝郁脾虛”證候的經(jīng)典名方[1-3]。目前，對(duì)于逍遙丸的研究主要集中在對(duì)抑郁、婦科疾病、免疫疾病等患者臨床療效的探討以及作用機(jī)制的研究[4-5]，而關(guān)于其質(zhì)量控制方面的文獻(xiàn)報(bào)道較少，且逍遙丸在《中國藥典》2020年版中僅以芍藥苷作為指標(biāo)性成分，其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中指控成分單一，缺乏能表征其化學(xué)輪廓特征的指紋圖譜相關(guān)研究，不足以全面反映逍遙丸制劑的整體質(zhì)量。中藥指紋圖譜將中藥與中藥制劑主要成分、組成特征進(jìn)行系統(tǒng)展示，是中藥質(zhì)量控制的重要手段，已廣泛應(yīng)用于中藥多組分復(fù)雜體系的質(zhì)量評(píng)價(jià)研究[6-9]。基于此，本研究通過建立逍遙丸的指紋圖譜，同時(shí)應(yīng)用超高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間高分辨質(zhì)譜（UPLC-Q-TOFHRMS）對(duì)逍遙丸指紋圖譜中共有峰的化學(xué)成分進(jìn)行全面表征，以期為其質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 1290UPLC-6540 Q-TOF色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國安捷倫Agilent科技公司，配置MassHunter質(zhì)譜工作站和Mass analysis質(zhì)譜數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)），超聲儀（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司），S-23高速臺(tái)式離心機(jī)（湖南湘儀儀器有限公司），AUW120D電子分析天平（日本SHIMADZU公司）。

1.2 試藥

對(duì)照品腺苷（上海同田生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：3080-29-3），芍藥苷（批號(hào)：107D021）、芍藥內(nèi)酯苷（批號(hào)：20200419）、阿魏酸（批號(hào)：1135-24-6）、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ（批號(hào)：73069-13-3）、Z-藁本內(nèi)酯（批號(hào)：903C021）（北京索萊寶科技有限公司）；柴胡皂苷a（批號(hào)：A20736-09-8）、綠原酸（批號(hào)：327-97-9）、甘草苷（批號(hào)：551-15-5）（中國食品藥品檢定研究院），苯甲酰芍藥苷（北京亞希爾科技有限公司，批號(hào)：38642-49-8）、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ（上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：73069-14-4），所有對(duì)照品質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于98.0%。

逍遙丸（仲景宛西制藥股份有限公司，批號(hào)為200423、200511、200530、200714、201031、201104、210308、210322、210415、210529、210722、210914，分別編號(hào)為S1～S12）；色譜甲醇、質(zhì)譜乙腈（德國Merck Millipore公司）；蒸餾水（深圳屈臣氏蒸餾水有限公司）；甲酸（質(zhì)譜級(jí)，美國Fisher公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱 Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18（3.0 mm×100 mm，1.8 μm），流動(dòng)相由乙腈（A）和水（含0.05 mmol·L-1甲酸）（B），梯度洗脫：0～10 min，5%～15%A；10～20 min，15%～35%A；20～30 min，35%～55%A；30～40 min，35%～85%A；40～50 min，85%～95%A）；流速：0.4 mL·min-1，進(jìn)樣量：2 μL。

2.2 質(zhì)譜條件

采用正離子分析模式，離子化方式為電噴霧離子化（ESI），進(jìn)樣分析前采用安捷倫標(biāo)準(zhǔn)調(diào)諧液ESI-L Low Concentration Tuning Mix（G1969-85000）進(jìn)行準(zhǔn)確質(zhì)量數(shù)的校正。一級(jí)質(zhì)譜掃描檢測范圍：m/z100～1700，采用氮?dú)鉃楦稍餁怏w，溫度為325℃，流速為6.8 L·min-1；鞘氣溫度為350℃；毛細(xì)管電壓為4.0 kV，F(xiàn)ragment電壓為30、20、10 eV。

2.3 逍遙丸溶液的制備

2.3.1 供試品溶液的制備 精密稱取12批逍遙丸粉末各3.0 g，置于50 mL的具塞錐形瓶中，精密加入30 mL的甲醇溶液，稱重，超聲處理30 min，放冷，加甲醇補(bǔ)足失重，8000 r·min-1離心5 min，吸取樣品上清液，用0.22 μm微孔濾膜過濾，即得逍遙丸供試品溶液。

2.3.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取對(duì)照品腺苷、芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、綠原酸、阿魏酸、甘草苷、Z-藁本內(nèi)酯、苯甲酰芍藥苷、柴胡皂苷a、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ 11個(gè)對(duì)照品各10 mg，置于25 mL量瓶中，加入甲醇25 mL，超聲溶解，靜置后定容至刻度，即得質(zhì)量濃度為0.4 mg·mL-1對(duì)照品溶液儲(chǔ)備液。分別從各量瓶中取50 μL對(duì)照品溶液混勻，即得混合對(duì)照品溶液。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗(yàn) 取同一供試品溶液（S1），連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄色譜圖。選擇 6號(hào)峰（芍藥內(nèi)酯苷）為參照峰，計(jì)算12個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），結(jié)果分別為RSD＜0.2%和RSD＜4.5%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取S1號(hào)樣品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。選擇6號(hào)峰（芍藥內(nèi)酯苷）保留時(shí)間和相對(duì)峰面積為參考，12個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD＜1.2%和相對(duì)峰面積的RSD＜4.7%，表明供試品溶液在 24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取樣品S1粉末適量，精密稱定3份，按“2.3.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。以6號(hào)峰（芍藥內(nèi)酯苷）保留時(shí)間和相對(duì)峰面積為參考，計(jì)算12個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD，分別為0.02%～0.68%和2.6%～5.0%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.5 指紋圖譜的建立

2.5.1 共有峰標(biāo)記 按“2.3.1”項(xiàng)下方法制備的12批逍遙丸供試品溶液（樣品 S1～S12），進(jìn)樣測定，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入2012版“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)” 軟件進(jìn)行分析，對(duì)照?qǐng)D譜采用“中位數(shù)”法生成，使用多點(diǎn)校正對(duì)色譜峰進(jìn)行匹配。12批逍遙丸供試品溶液的指紋圖譜見圖1，11個(gè)混合對(duì)照品溶液色譜圖見圖2。

圖1 12批逍遙丸的指紋圖譜（S1～S12）及其對(duì)照?qǐng)D譜（R）Fig 1 Fingerprint map（S1～S12）and reference map（R）of Xiaoyao pills

圖2 11個(gè)對(duì)照品總離子流圖Fig 2 Total ion flow diagram of 11 reference substance

2.5.2 相似度評(píng)價(jià)及共有峰歸屬 選擇樣品S1的譜圖作為參照譜圖，時(shí)間窗寬度設(shè)為0.1 min，選取多個(gè)特征峰進(jìn)行多點(diǎn)校正，自動(dòng)峰匹配，共標(biāo)定35個(gè)共有峰。對(duì)12批逍遙丸供試品溶液色譜圖和對(duì)照譜圖進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，S1～S12 相似度均大于0.982，表明12批次逍遙丸樣品制備工藝較為穩(wěn)定，結(jié)果見表1。對(duì)逍遙丸指紋圖譜中的35個(gè)特征峰進(jìn)行歸屬，并與混合對(duì)照品溶液比對(duì)，確定了其中11個(gè)成分，其中2（腺苷）、25（柴胡皂苷a）號(hào)峰來源于柴胡；5（綠原酸）、8（阿魏酸）、32（Z-藁本內(nèi)酯）號(hào)峰來源于當(dāng)歸；6（芍藥內(nèi)酯苷）、7（芍藥內(nèi)酯苷）、18（苯甲酰芍藥苷）號(hào)峰來源于白芍；12（甘草苷）號(hào)峰來源于甘草；31（白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ）、33（白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ）號(hào)峰來源于白術(shù)。

表1 12批樣品峰及其對(duì)照峰的相似度表Tab 1 Similarity of 12 batches sample peaks and their reference peaks

2.6 UPLC-Q-TOF HRMS對(duì)共有峰化學(xué)成分定性分析

通過使用Agilent TCM-DATA中藥成分?jǐn)?shù)據(jù)庫生成分子式、依照誤差小于5×10-6的原則進(jìn)行篩選，同時(shí)檢索中國知網(wǎng)（CNKI），PubMed、Massbank等數(shù)據(jù)庫，建立逍遙丸藥材的化學(xué)成分信息庫。根據(jù)化合物的精確相對(duì)分子質(zhì)量、保留時(shí)間及二級(jí)質(zhì)譜信息，以及比對(duì)自建中藥成分化合物庫，并結(jié)合文獻(xiàn)數(shù)據(jù)在逍遙丸溶液中共確定35個(gè)化學(xué)成分，其中包括萜類9個(gè)、黃酮類7個(gè)、皂苷類5個(gè)、苯丙素類3個(gè)、苯酞類2個(gè)、核苷類1個(gè)、酚類1個(gè)、其他類化合物7個(gè)，結(jié)果見表2。

3 討論

3.1 色譜條件的考察

在指紋圖譜的研究中，色譜條件考察了乙腈-甲酸水溶液、甲醇-甲酸水溶液、甲醇-乙酸水溶液等流動(dòng)相系統(tǒng)，結(jié)果流動(dòng)相為乙腈-甲酸水溶液的梯度洗脫基線平穩(wěn)，色譜峰分離效果最佳。在色譜柱考察中，分別對(duì)比了3個(gè)不同生產(chǎn)廠家的色譜柱Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18、Waters BEH C18和Diamonsil C18，發(fā)現(xiàn)Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱分離效果最好。另外，檢測波長考察了254 nm和300 nm，結(jié)果在254 nm波長處各成分色譜峰分離較好，且基線峰平穩(wěn)，故選擇其作為檢測波長。

3.2 逍遙丸指紋圖譜共有峰的鑒定

在UPLC-Q-TOF HRMS定性分析研究中，對(duì)于質(zhì)譜條件進(jìn)行了優(yōu)化，由于中成藥中成分較為復(fù)雜，課題組前期采用正、負(fù)離子模式對(duì)逍遙丸的化學(xué)成分進(jìn)行系統(tǒng)分析，發(fā)現(xiàn)逍遙丸中的化學(xué)成分在正離子模式下質(zhì)譜有響應(yīng)且信號(hào)較好，因此，本文的指紋圖譜和化合物鑒定均采用正離子模式。本研究采用UPLC-Q-TOF HRMS技術(shù)共鑒定出逍遙丸指紋圖譜中35個(gè)化學(xué)成分，柴胡中以皂苷類成分為主，當(dāng)歸中的成分以單萜類和苯丙素類為主，甘草中的成分多為黃酮類化合物，白術(shù)中的成分以倍半萜類為主，白芍中以單萜類為主?，F(xiàn)代研究表明逍遙丸中的君藥柴胡中柴胡皂苷a和柴胡皂苷d能顯著下調(diào)白細(xì)胞介素表達(dá)水平，減輕HPA軸功能障礙的作用[19]；臣藥白芍中的芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷能調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)釋放、可顯著抑制腦內(nèi)單胺氧化酶的活性，當(dāng)歸中的Z-藁本內(nèi)酯發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，同時(shí)對(duì)單胺氧化酶具有一定的抑制作用[20]，白術(shù)、茯苓、甘草、薄荷佐藥中薄荷酮能抑制HPA 軸過度活化，甘草苷、異甘草苷、茯苓多糖能調(diào)節(jié)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)[21]。中藥復(fù)方發(fā)揮藥效作用是多個(gè)成分共同起效的結(jié)果，本研究通過采用UPLC-Q-TOF HRMS技術(shù)，對(duì)其指紋圖譜共有峰進(jìn)行精準(zhǔn)指認(rèn)，為后續(xù)逍遙丸指標(biāo)成分的選擇提供參考依據(jù)。

本研究建立了12批逍遙丸指紋圖譜，發(fā)現(xiàn)了35個(gè)共有峰，同時(shí)結(jié)合UPLC-Q-TOF HRMS技術(shù)快速、準(zhǔn)確地分析其化學(xué)成分，進(jìn)一步闡明了逍遙丸的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，為建立逍遙丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供方法和參考依據(jù)。