基于芳香烴受體探討青黛及其主要成分緩解潰瘍性結(jié)腸炎的作用機(jī)制

高陽(yáng) ，顧思臻 ，薛艷 ，劉曉雯 ，竇丹波

1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院，上海 201203； 2.同濟(jì)大學(xué)附屬養(yǎng)志康復(fù)醫(yī)院，上海 201619

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種局限于黏膜及黏膜下層的非特異性腸道炎癥性疾病，具有慢性、難治性、復(fù)發(fā)性的特點(diǎn)，臨床表現(xiàn)為腹痛、腹瀉、黏液膿血便、里急后重及不同程度的全身癥狀[1]。UC全球發(fā)病率有逐年升高趨勢(shì)[2]。目前其發(fā)病機(jī)制尚未明確，主要與遺傳、環(huán)境、感染、免疫等因素有關(guān)?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療UC存在療效不穩(wěn)定、不良反應(yīng)較多等問題[3]。

研究顯示，口服青黛治療活動(dòng)期UC臨床療效顯著[4]，基礎(chǔ)研究表明，青黛發(fā)揮作用可能與激活A(yù)HR/CYP1A1通路有關(guān)[5]。課題組前期通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析篩選出青黛治療UC的9個(gè)主要成分，包括靛藍(lán)、靛玉紅和色胺酮等，并通過分子對(duì)接發(fā)現(xiàn)靛藍(lán)、靛玉紅和色胺酮均為芳香烴受體（AHR）的配體[6]。因此，本研究以AHR及其下游關(guān)鍵分子為切入點(diǎn)，采用葡聚糖硫酸鈉（DSS）誘導(dǎo)C57BL/6小鼠UC模型，明確青黛及其主要成分靛藍(lán)、靛玉紅和色胺酮對(duì)UC的影響及作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性C57BL/6小鼠42只，體質(zhì)量18～25 g，上海吉輝實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（滬）2022-0009。飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，溫度22～25 ℃，濕度50%，自由攝食飲水。每日清潔飼養(yǎng)籠，隔日更換墊料，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)審批（PZSHUTCM200821015）。

1.2 藥物及制備

建青黛[7]，為爵床科植物馬藍(lán)Baphicacanthus cusia（Nees）Bremek.的葉或莖葉經(jīng)加工制成的干燥粉末，購(gòu)于福建省德龍藥業(yè)，批號(hào)FJ20180005，中國(guó)GMP藥品證書FJ20180005；靛藍(lán)，北京索萊寶公司，貨號(hào)SI8050，純度≥98%；靛玉紅，北京索萊寶公司，貨號(hào)SI8060，純度≥98%；色胺酮，上海源葉公司，貨號(hào)S31557，純度≥98%。以上藥物分別用0.5%羧甲基纖維素鈉溶解，制成建青黛、靛藍(lán)、靛玉紅、色胺酮濃度分別為0.06、0.03、0.001、0.03 g/mL溶液。

1.3 主要試劑與儀器

羧甲基纖維素鈉，北京索萊寶公司，貨號(hào)c8621；多聚甲醛固定液，北京索萊寶公司，貨號(hào)p1110；細(xì)胞色素P4501A1（CYP1A1）抗體，美國(guó)Proteintech，貨號(hào)13241-1-AP；AHR 抗體，美國(guó)CST 公司，貨號(hào)83200S；白細(xì)胞介素（IL）-10抗體，美國(guó)Proteintech公 司， 貨 號(hào)20850-1-AP； IL-22 抗 體， 美 國(guó)Proteintech，貨號(hào)13462-1-AP；TB Green qPCR 試劑盒，日本TAKARA，貨號(hào)RR420A。

蛋白電泳儀（上海天能，型號(hào)VE-180），蛋白轉(zhuǎn)膜儀（上海天能，型號(hào)VE-186），5417R臺(tái)式冷凍高速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司，型號(hào)5417R），電熱恒溫水浴鍋（上海精宏，型號(hào)DK-S26），分光光度計(jì)（美國(guó)Thermo，型號(hào)NanoDrop 2000），PCR儀（德國(guó)Analytik Jena公司，型號(hào)SL96），qPCR儀（美國(guó)ABI公司，型號(hào)Stepone plus），凝膠成像系統(tǒng)（上海天能，型號(hào)GIS2009）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組及造模

按隨機(jī)區(qū)組法將42只小鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、青黛組、靛藍(lán)組、靛玉紅組和色胺酮組，每組7只?？瞻捉M正常飲水，其余各組飲用4%DSS溶液（將DSS用純水溶解，現(xiàn)配現(xiàn)用）制備急性UC模型，連續(xù)10 d。

2.2 給藥

造模第4日開始，青黛組予青黛溶液600 mg/kg灌胃，靛藍(lán)組予靛藍(lán)溶液300 mg/kg灌胃[8]，靛玉紅組予靛玉紅溶液10 mg/kg灌胃[9]，色胺酮組予色胺酮溶液300 mg/kg灌胃[10-11]，均相當(dāng)于臨床成人等效劑量。空白組和模型組予等體積生理鹽水灌胃，連續(xù)7 d。

2.3 取材

末次給藥后小鼠禁食24 h，2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉小鼠，75%乙醇消毒腹部，沿腹部中線剪開，充分暴露腹膜和腹腔，用鑷子分離結(jié)腸和回腸，將結(jié)腸置于冰上，PBS沖洗結(jié)腸組織，剝離多余脂肪，用標(biāo)尺測(cè)量結(jié)腸長(zhǎng)度。縱剖結(jié)腸，取出結(jié)腸內(nèi)容物，PBS沖洗，濾紙吸去多余水分，用剪刀剪取病變最明顯處結(jié)腸組織，置于4%多聚甲醛中固定。其余結(jié)腸組織放于EP管內(nèi)，置于-80 ℃冰箱保存。

2.4 一般狀況觀察

造模及給藥期間，每日記錄各組小鼠體質(zhì)量、精神活動(dòng)狀態(tài)、毛發(fā)色澤、進(jìn)食量和飲水量、大便性狀及存活情況。

2.5 結(jié)腸組織病理觀察

結(jié)腸組織置于多聚甲醛溶液中固定24 h，石蠟包埋，制成5 μm切片，常規(guī)HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)腸組織形態(tài)變化。

2.6 Western blot檢測(cè)

取結(jié)腸組織，加入適量RIPA 裂解液（含1%PMSF）提取總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，10%電泳分離90 min，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜（300 mA、60 min），用5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，滴加CYP1A1 一抗（1∶1 000）、AHR一抗（1∶1 000）、IL-10一抗（1∶1 000）、IL-22一抗（1∶2 000），4 ℃孵育過夜。PBST洗膜4次，每次8 min，加二抗（1∶5 000），室溫孵育1 h。PBST洗膜4次，超敏ECL液顯影。以GAPDH為內(nèi)參，采用Image J軟件分析目的蛋白相對(duì)灰度值。

2.7 RT-PCR檢測(cè)

參照總RNA提取試劑盒提取結(jié)腸組織總RNA，測(cè)定RNA濃度后將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)。反應(yīng)條件：95 ℃、30 s，95 ℃、5 s，60 ℃、34 s，共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 各基因PCR引物序列

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以±s表示，符合正態(tài)分布且方差齊組間比較用方差分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 青黛及其主要成分對(duì)模型小鼠一般狀況的影響

空白組小鼠毛色光澤，活動(dòng)靈敏，飲食量、飲水量及糞便情況正常。模型組小鼠毛發(fā)粗糙，活動(dòng)量減少，體質(zhì)量下降，飲食量減少，出現(xiàn)肉眼可見的肛周血便、稀便；青黛組、靛藍(lán)組、靛玉紅組和色胺酮組小鼠毛色、體質(zhì)量、精神狀態(tài)和血便等情況較模型組有不同程度改善。與空白組比較，模型組小鼠體質(zhì)量明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，青黛組、靛藍(lán)組、靛玉紅組和色胺酮組小鼠體質(zhì)量明顯升高（P＜0.01）。見表2。

表2 各組小鼠體質(zhì)量比較（±s，g）

表2 各組小鼠體質(zhì)量比較（±s，g）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01

體質(zhì)量22.37±0.67 15.16±0.63**19.99±0.23##20.09±1.15##20.04±0.63##20.06±0.62##組別空白組模型組青黛組靛玉紅組靛藍(lán)組色胺酮組只數(shù)7 7 7 7 7 7

4.2 青黛及其主要成分對(duì)模型小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度及結(jié)腸形態(tài)的影響

與空白組比較，模型組小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度明顯縮短（P＜0.01）；與模型組比較，青黛組、靛玉紅組和色胺酮組小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度明顯增加（P＜0.01，P＜0.05）。見表3。

表3 各組小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度比較（±s，cm）

表3 各組小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度比較（±s，cm）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

結(jié)腸長(zhǎng)度6.91±0.24 4.76±0.59**5.70±0.54##6.11±0.32##5.11±0.40 5.30±0.44#組別空白組模型組青黛組靛玉紅組靛藍(lán)組色胺酮組只數(shù)7 7 7 7 7 7

HE染色顯示，空白組小鼠結(jié)腸黏膜、腺體完整，隱窩正常，無(wú)水腫及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組小鼠結(jié)腸黏膜缺損，腺體不完整，隱窩縮短或消失，杯狀細(xì)胞減少，出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及黏膜下層水腫等變化；青黛組、靛藍(lán)組、靛玉紅組和色胺酮組小鼠結(jié)腸組織潰瘍及黏膜損傷程度明顯減輕，水腫和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)有不同程度改善。見圖1。

圖1 各組小鼠結(jié)腸組織形態(tài)（HE染色，×200）

4.3 青黛及其主要成分對(duì)模型小鼠結(jié)腸組織芳香烴受體、細(xì)胞色素P4501A1、白細(xì)胞介素-10、白細(xì)胞介素-22蛋白表達(dá)的影響

與空白組比較，模型組小鼠結(jié)腸組織CYP1A1、IL-10、IL-22蛋白表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組小鼠結(jié)腸組織AHR、CYP1A1、IL-10、IL-22蛋白表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見圖2、圖3。

圖2 各組小鼠結(jié)腸組織AHR、CYP1A1、IL-10、IL-22蛋白免疫印跡

圖3 各組小鼠結(jié)腸組織AHR、CYP1A1、IL-10、IL-22蛋白表達(dá)比較（±s，每組7只）

4.4 青黛及其主要成分對(duì)模型小鼠結(jié)腸組織芳香烴受體、細(xì)胞色素P501A1、白細(xì)胞介素-10、白細(xì)胞介素-22 mRNA表達(dá)的影響

與空白組比較，模型組小鼠結(jié)腸組織AHR、IL-10、IL-22 mRNA 表 達(dá) 明 顯 降 低（P＜0.01），CYP1A1 mRNA表達(dá)有降低趨勢(shì)（P＞0.05）；與模型組比較，靛玉紅組和色胺酮組小鼠結(jié)腸組織AHR、CYP1A1、IL-10、IL-22 mRNA表達(dá)明顯升高（P＜0.01），靛藍(lán)組小鼠結(jié)腸組織AHR、CYP1A1、IL-22 mRNA表達(dá)明顯升高（P＜0.01），青黛組小鼠結(jié)腸組織AHR、IL-10 mRNA表達(dá)明顯升高（P＜0.01）。見表4。

表4 各組小鼠結(jié)腸組織AHR、CYP1A1、IL-10、IL-22 mRNA表達(dá)比較（±s）

表4 各組小鼠結(jié)腸組織AHR、CYP1A1、IL-10、IL-22 mRNA表達(dá)比較（±s）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01

組別空白組模型組青黛組靛藍(lán)組靛玉紅組色胺酮組IL-22 73.12±19.76 3.56± 2.27**19.97± 6.94 34.56± 3.18##143.46± 8.62##207.05±13.02##只數(shù)7 7 7 7 7 7 AHR 3.31±0.25 0.46±0.06**2.14±0.64##1.78±0.18##3.42±1.01##5.59±0.53##CYP1A1 69.18±15.36 22.89± 3.30 36.20± 4.78 166.96±85.04##117.42±17.09##259.51± 6.17##IL-10 53.59± 2.81 11.87± 1.58**69.53± 7.42##19.65± 0.71 85.28± 6.94##126.50±25.48##

5 討論

青黛有清熱解毒、涼血消斑、瀉火定驚等功效。口服青黛方藥多用于治療血證，包括血熱吐衄、胸痛咳血、溫毒發(fā)斑等，如《端效方》青金散治吐血不止，“青黛二錢，新水調(diào)下”；《本經(jīng)逢原》謂其能“散郁火，治溫毒發(fā)斑及產(chǎn)后熱痢下重”；《本草求真》言：“青黛，大瀉肝經(jīng)實(shí)火及散肝經(jīng)火郁……痢血等癥。”UC發(fā)作以便膿血為主，鏡下表現(xiàn)為腸黏膜潰瘍、糜爛、出血等，屬中醫(yī)學(xué)“久痢”“血證”等范疇。臨床研究顯示，口服青黛對(duì)UC患者有良好的治療效果[12]，對(duì)于中度UC活動(dòng)期患者病情緩解效果顯著[4]，不同劑量青黛聯(lián)合西藥治療后，其臨床有效率、緩解率和黏膜愈合率均顯著高于安慰劑組[13]。實(shí)驗(yàn)研究表明，青黛能下調(diào)UC模型小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞表達(dá)[14]，抑制小鼠炎癥反應(yīng)并促進(jìn)黏膜修復(fù)[15]，升高短鏈脂肪酸受體GPR41、GPR43表達(dá)，調(diào)節(jié)Treg/Th17平衡，發(fā)揮治療UC作用[16]；體外實(shí)驗(yàn)顯示，青黛能通過降低炎癥因子IL-6表達(dá)發(fā)揮抗炎效果[17]。以上結(jié)果均提示青黛具有治療UC潛能，但相關(guān)機(jī)制仍需進(jìn)一步探索。

AHR是由805個(gè)氨基酸組成的胞質(zhì)轉(zhuǎn)錄因子[18]，非活性狀態(tài)的AHR可被其配體激活，活化的AHR從復(fù)合態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x態(tài)，進(jìn)一步與細(xì)胞核內(nèi)AHR核轉(zhuǎn)位蛋白結(jié)合為二聚體，從而促進(jìn)下游基因轉(zhuǎn)錄[19]。AHR可以調(diào)節(jié)細(xì)胞分化和細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抗炎作用[20]。研究顯示，UC患者AHR mRNA表達(dá)明顯低于對(duì)照組[21]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，使用AHR拮抗劑后，UC小鼠結(jié)腸炎癥程度進(jìn)一步加重；AHR基因敲除UC小鼠出現(xiàn)不同程度的結(jié)腸組織損害、隱窩結(jié)構(gòu)變形、上皮細(xì)胞壞死水腫及中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)[22]，提示上調(diào)AHR表達(dá)能緩解結(jié)腸炎癥狀態(tài)。AHR與配體結(jié)合后能上調(diào)CYP1A1 表達(dá)，CYP1A1 表達(dá)升高是AHR 活化的標(biāo)志[5]，激活A(yù)HR/CYP1A1信號(hào)通路可能是抑制UC炎癥的作用機(jī)制。IL-10作為一種抗炎因子，其表達(dá)水平與UC疾病進(jìn)展有關(guān)。AHR/CYP1A1信號(hào)通路活化后能促進(jìn)IL-10表達(dá)和分泌，進(jìn)而誘導(dǎo)腸上皮細(xì)胞IL-10受體（IL-10R1）表達(dá)[23]。IL-10 與IL-10R1 結(jié)合后，介導(dǎo)信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）磷酸化，p-STAT3通過上調(diào)抗凋亡和增殖相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄促進(jìn)腸黏膜愈合。臨床研究發(fā)現(xiàn)，中重度UC 患者結(jié)腸黏膜IL-10表達(dá)明顯低于輕度UC患者及正常組[24]，而IL-10基因敲除小鼠可出現(xiàn)自發(fā)性腸炎[25]。IL-22在UC發(fā)病中起重要作用，可通過誘導(dǎo)產(chǎn)生多種抗菌肽保護(hù)腸道上皮細(xì)胞屏障功能。IL-22由多種細(xì)胞產(chǎn)生，包括自然殺傷細(xì)胞、活化T細(xì)胞、輔助性T細(xì)胞17等。腸道中IL-22主要由維甲酸相關(guān)孤兒受體γt 相關(guān)的固有淋巴細(xì)胞ILC3產(chǎn)生[26]。此外，腸道微生物能通過激活A(yù)HR影響IL-22表達(dá)。

本研究通過DSS自由飲用建立UC小鼠模型，并分別予青黛、靛藍(lán)、靛玉紅及色胺酮進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果表明，模型小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度縮短和體質(zhì)量下降有所恢復(fù)，同時(shí)結(jié)腸組織病理變化明顯減輕，黏膜損傷、水腫、潰瘍情況好轉(zhuǎn)，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少。進(jìn)一步采用Western blot檢測(cè)AHR/CYP1A1信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)，青黛組、靛藍(lán)組、靛玉紅組和色胺酮組小鼠結(jié)腸組織AHR、CYP1A1、IL-10、IL-22 蛋白表達(dá)顯著上調(diào)。PCR結(jié)果顯示，靛玉紅組和色胺酮組小鼠結(jié)腸組織AHR、CYP1A1、IL-10、IL-22 mRNA表達(dá)顯著升高。提示青黛及其主要成分靛藍(lán)、靛玉紅、色胺酮可能通過激活A(yù)HR/CYP1A1通路上調(diào)抗炎因子IL-10和IL-22表達(dá)，進(jìn)而改善UC。其中以靛玉紅和色胺酮改善各項(xiàng)指標(biāo)作用最明顯。本研究對(duì)青黛及其主要成分治療UC的作用機(jī)制進(jìn)行探討，可為中醫(yī)藥治療UC提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。