高強(qiáng)度間歇運(yùn)動(dòng)通過miR-124-3p/ERN1軸抑制吸煙相關(guān)的老年慢性阻塞性肺疾病炎癥反應(yīng)的機(jī)制

劉盼盼,曾海珠,張美蘭,章華麗,高宏昌,王雨濛,陳果,趙蕾

1. 上海浦東新區(qū)公利醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科,上海 200135; 2. 上海浦東新區(qū)公利醫(yī)院急診科,上海 200135

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是全球前三大死因之一[1],我國60歲以上人群中的患病率已超過27%[2],老年COPD患者往往合并高血壓、心功能不全、糖尿病及肌少癥等多系統(tǒng)疾病,盡管現(xiàn)有治療取得了一定進(jìn)展,但在提高生活質(zhì)量、降低死亡率方面仍沒有突破,運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可改善運(yùn)動(dòng)耐力、調(diào)劑免疫功能[3],在老年COPD中開展運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可協(xié)同改善機(jī)體多系統(tǒng)病變[4]。

運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練作為一種炎癥反應(yīng)的應(yīng)激因子,可以增強(qiáng)機(jī)體的抗炎能力,增加抗炎癥因子表達(dá)[5-6]。利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)對老年COPD患者運(yùn)動(dòng)前后的差異基因進(jìn)行富集分析發(fā)現(xiàn),這些基因主要富集在炎癥反應(yīng)相關(guān)通路中,且有多種微小RNA (microRNA, miRNA)被證明參與肺部炎癥反應(yīng)[7-9]。其中miR-124-3p,被發(fā)現(xiàn)在COPD合并肺動(dòng)脈高壓的患者中表達(dá)水平上調(diào)且與肺部炎癥反應(yīng)相關(guān)[10-11]。然而, miR-124-3p在COPD運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練治療中的作用和潛在機(jī)制尚不清楚。通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)ERN1(Endoplasmic Reticulum To Nucleus Signaling 1, ERN1)與miR-124-3p之間存在相互關(guān)系。因此,本研究通過分析COPD患者運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練前后miR-124-3p, ERN1以及其他分子標(biāo)志物的表達(dá)水平改變及兩者之間的靶向關(guān)系,確定miR-124-3p/ERN1軸對COPD的調(diào)節(jié)機(jī)制,旨在為運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練改善老年COPD患者預(yù)后的作用機(jī)制提供可靠的試驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1一般資料選擇2020年11月15日—2021年11月30日于浦東新區(qū)公利醫(yī)院呼吸科診治的150例患者作為研究對象,分為非吸煙組(非吸煙且肺功能正常者,n=50)和吸煙非COPD組(吸煙且肺功能正常者,n=50)、 COPD組(COPD患者,n=50)。所有研究對象納入標(biāo)準(zhǔn):年齡≥60歲;意識清楚,能夠執(zhí)行治療指令;完成肺功能檢測,根據(jù)GOLD(慢性阻塞性肺病全球倡議),若FEV1/FVC>70%,則根據(jù)吸煙史分別納入非吸煙組和吸煙組(各50例);而吸入支氣管舒張劑后, FEV1/FVC<70%,排除其他肺部疾患則納入COPD組(50例)。排除標(biāo)準(zhǔn):患有不穩(wěn)定型心絞痛、藥物未控制的充血性心力衰竭和高血壓病、近期心肌梗塞、重度肺動(dòng)脈高壓、既往有運(yùn)動(dòng)后暈厥史、影響運(yùn)動(dòng)的骨關(guān)節(jié)病、肝腎衰竭晚期、認(rèn)知功能障礙。

所有入組者均在清晨8點(diǎn)空腹采集5 mL靜脈血,其中COPD患者分別于運(yùn)動(dòng)前和運(yùn)動(dòng)12周后抽取。血樣用乙二胺四乙酸(EDTA)抽真空管進(jìn)行存儲,用梯度離心法分離出外周血白細(xì)胞及血清,儲存在-80 ℃的條件下備用。所有受試者均簽署知情同意書,本研究經(jīng)上海市浦東新區(qū)公利醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)(倫理批號[2020]臨審第014號)。

1.2高強(qiáng)度間歇運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練功率及方案實(shí)施按照COPD患者的心肺運(yùn)動(dòng)功能,制定適合該個(gè)體的高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)(即△50%功率),△50%功率=(無氧閾測定功率+極限運(yùn)動(dòng)測定功率)/2-功率遞增速率×0.75±10。運(yùn)動(dòng)方案[12]:每天1 h(分2～3次完成),每周5次,共12周。運(yùn)動(dòng)期間無法維持轉(zhuǎn)速 (55～65 r·min-1)或肺部出現(xiàn)明顯哮鳴音或Borg疲勞評分大于14則需暫停運(yùn)動(dòng),等待下一個(gè)開始指令。

1.3香煙顆粒制備及細(xì)胞培養(yǎng)用恒速真空泵將卷煙煙霧抽吸到10 mL RPMI1640介質(zhì)中,通過0.22μm過濾器進(jìn)行滅菌。獲得的CSE溶液在1 h內(nèi)用于試驗(yàn)。氣道上皮細(xì)胞(16HBE)購自中科院上海細(xì)胞研究所,使用添加10%牛血清和1%青霉素/鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基,在37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染。

1.4細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染氣道上皮細(xì)胞(16HBE)購自中科院上海細(xì)胞研究所,使用添加10%牛血清和1%青霉素/鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基,在37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。利用pcDNA, pcDNA-ERN1及miR-124-3p模擬物, miR-124-3p抑制劑分別調(diào)節(jié)ERN1或miR-124-3p的表達(dá)水平,在細(xì)胞對數(shù)生長期轉(zhuǎn)染到16HBE細(xì)胞中。該序列購自GenePharma (Shanghai, China)。轉(zhuǎn)染試劑為lipofectamine 3 000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA),按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.5qRT-PCR檢測提取總RNA,利用逆反應(yīng)試劑盒合成cDNA后在7500實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)上使用SYBR green I Mater Mix試劑盒(Invitrog)進(jìn)行qRT-PCR。通過相對定量(2-△△Ct法)計(jì)算倍數(shù)變化。PCR引物描述如下: miR-124-3p:正向5′-ATGTTCACAGCGGACCTTGAT-3′和反向5′-TTCACCGCGTGCCTTAATTG-3′; ERN1:正向5′-GAGATGTGGCCCTGAAACCT-3′和反向5′-AGCAAGCTCATCCGGTGAAA-3′; β-actin:正向5′-GCCAACCGTGAAAAGAT-3′和反向5′-AGAGCATAGCCCTCGTAGAT-3′; U6:正向5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′和反向5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.6酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)通過測定細(xì)胞培養(yǎng)上清中促炎細(xì)胞因子的水平來分析細(xì)胞模型的炎癥反應(yīng)。ELISA試劑盒(博斯特生物技術(shù)公司,中國武漢)用于檢測白細(xì)胞介素(IL)-1β、 IL-6、 IL-8和腫瘤壞死因子(TNF)-α的水平,按照參照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.7細(xì)胞活性及凋亡測定將對數(shù)生長期的16HBE細(xì)胞接種于96孔板中,每孔2×103培養(yǎng)48 h后,加入10 μLCCK-8試劑(上海Beyotime),避光孵育2 h后使用Bio-Rad酶標(biāo)儀測定吸光度值(波長490 nm)。使用FITC-AnnexinV凋亡檢測試劑盒(BD)測定細(xì)胞凋亡,按照說明書步驟將不同處理后的細(xì)胞收集離心,用PBS沖洗后在室溫下用膜聯(lián)蛋白V(AnnexinV)和碘化丙啶(PI)在室溫下避光孵育10 min,用FACS Calibur流式細(xì)胞儀(BD)檢測細(xì)胞凋亡率。

2 結(jié)果

2.13組人口學(xué)特點(diǎn)比較非吸煙組、吸煙組、 COPD組年齡、性別構(gòu)成、 BMI及吸煙史等差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);組間兩兩比較, FEV1/預(yù)計(jì)值、 FEV1/FVC差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001); COPD組肺功能1級3例, 2級27例, 3級20例。

2.2COPD患者血清miR-124-3p及相關(guān)炎癥因子表達(dá)水平比較與非吸煙組比較,吸煙組患者血清miR-124-3p表達(dá)水平降低,而COPD組則更低(P<0.001,圖1A)。肺功能3級患者血清miR-124-3p的表達(dá)較1～2級患者明顯降低(P<0.001,圖1B),但是miR-124-3p的表達(dá)水平與肺功能無明顯相關(guān)性(r=-0.1148,P>0.05)。COPD患者血清TNF-α、 IL-6表達(dá)水平高于吸煙組及非吸煙組(P<0.05),提示運(yùn)動(dòng)可下調(diào)TNF-α、 IL-6表達(dá)水平(圖1C)。

注: (A) 吸煙非COPD組與非吸煙組比較, miR124-3p低表達(dá),與非吸煙組比較, COPD組的miR124-3P表達(dá)水平更低。(B)肺功能3級COPD患者的血清miR124-3p低于1～2級的患者。(C) 與非吸煙組相比, COPD組外周血中的TNF-α表達(dá)增高,而吸煙組, COPD運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與吸煙組比較, COPD患者的TNF-α表達(dá)水平增高,運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后降低(###P<0.001)。COPD:慢阻肺患者; COPD+Exercise: COPD患者運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后; Non-smokers:非吸煙的肺功能正常者; Smokers:吸煙的肺功能正常者。與非吸煙組比較,**P<0.001;與肺功能1-2級組比較,***P<0.001;與吸煙組比較,##P<0.001;與COPD組比較,###P<0.001。

2.3miR-124-3p過表達(dá)可減輕香煙煙霧誘導(dǎo)的16HBE細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)隨著CSE濃度的增加,細(xì)胞內(nèi)及培養(yǎng)基中miR-124-3p水平逐漸降低,濃度為2%和4%時(shí)miR-124-3p水平被顯著抑制(圖2A-B),后續(xù)細(xì)胞試驗(yàn)采用2% CSE處理24 h。轉(zhuǎn)染miR-124-3p模擬物后,細(xì)胞及培養(yǎng)液中miR-124-3p水平顯著升高,而轉(zhuǎn)染抑制劑后,細(xì)胞miR-124-3p水平則相反(P<0.01,圖2C)。miR-124-3p過表達(dá)顯著促進(jìn)細(xì)胞活力,抑制煙霧誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡(P<0.001,圖2D～E, G～L)。CSE促進(jìn)16HBE細(xì)胞釋放IL-6、 IL-8、 IL-1β和TNF-α,而miR-124-3p過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了以上趨勢(P<0.001,圖F)。這說明miR-124-3p過表達(dá)可抑制CSE誘導(dǎo)的16HBE細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)。

注: (A-B)細(xì)胞中及培養(yǎng)液中miR124-3P水平隨CSE濃度降低。(C) miR124-3P模擬物轉(zhuǎn)染細(xì)胞后,細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞培養(yǎng)液中其表達(dá)水平均顯著上調(diào)。(D)和(E) miR124-3P過表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞活力,抑制煙霧誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。(F) 煙霧可促進(jìn)16HBE細(xì)胞釋放IL-6、 IL-8、 IL-1β和TNF-α,而miR124-3P過表達(dá)可逆轉(zhuǎn)這種作用。(G-L)煙霧刺激誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡增多, miR124-3P過表達(dá)可逆轉(zhuǎn)這種作用。與對照組比較, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, #P<0.05;與CSE組比較, ###P<0.001。

2.4ERN1是miR-124-3p的下游靶點(diǎn),可通ceRNA網(wǎng)絡(luò)調(diào)控發(fā)揮作用miR-124-3p與ERN1 3’UTR之間存在互補(bǔ)序列(圖3A)。熒光素酶報(bào)告表明,轉(zhuǎn)染miR-124-3p模擬物顯著促進(jìn)了與ERN1-Wt共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的熒光素酶活性,而轉(zhuǎn)染miR-124-3p抑制劑則具有相反的效果(圖3B), ERN1-Mut細(xì)胞的熒光素酶活性不受miR-124-3p表達(dá)水平的影響(圖3B)。在CSE處理的16HBE細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-124-3p模擬物后ERN1顯著下調(diào),而轉(zhuǎn)染miR-124-3p抑制劑后其表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.001,圖3C)。與非吸煙者相比, ERN1在吸煙者中表達(dá)較高, COPD中ERN1的表達(dá)較吸煙者更高(圖3D)。而運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后COPD中ERN1水平降低,且與miR-124-3p水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.644,P<0.001)。

注: (A)miR-124-3p與ERN1的3 ’-UTR互補(bǔ)序列。(B)野生型和突變型的細(xì)胞中熒光素酶活性的差異。(C)不同處理?xiàng)l件下的ERN1 mRNA表達(dá)水平。(D-E)不同血清樣本中ERN1 mRNA水平以及miR-124-3p的表達(dá)水平。與對照組和非吸煙組比較, ***P<0.001;與吸煙組比較, ##P<0.05;與COPD組比較, ###P<0.001。

3 討論

老年COPD患者存在多系統(tǒng)共病,導(dǎo)致其生活質(zhì)量降低,而規(guī)律的中高等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)可減輕機(jī)體抗炎反應(yīng)、調(diào)節(jié)免疫代謝狀態(tài),在老年COPD患者中推廣運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練是減輕醫(yī)療負(fù)擔(dān)改善預(yù)后的重要措施,但運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練的作用機(jī)制不明。因此明確運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練是否通過ceRNA網(wǎng)絡(luò)發(fā)揮作用將為COPD康復(fù)治療提供理論基礎(chǔ)。miR-124-3p產(chǎn)生于多種細(xì)胞,其可調(diào)節(jié)肺血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和炎癥[13]。CSE處理的16HBE細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)液中miR-124-3P水平均降低和炎癥因子增高,說明miR-124-3p參與了吸煙相關(guān)的COPD發(fā)展。過表達(dá)miR-124-3p降低ERN1及相關(guān)炎癥因子的水平,而miR-124-3p下調(diào)則反之,結(jié)合熒光素酶試驗(yàn)證實(shí)ERN1作為miR-124-3p的下游靶點(diǎn)通過ceRNA網(wǎng)絡(luò)發(fā)揮作用。同時(shí),與非吸煙者相比, ERN1在吸煙者中表達(dá)較高, miR-124水平減少;而COPD又較吸煙組更明顯,這與CSE處理的16HBE細(xì)胞中觀察到的結(jié)果一致(圖2E),而運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練則可逆轉(zhuǎn)miR-124的下調(diào)及ERN1的升高趨勢,這說明運(yùn)動(dòng)可能通過靶向miR-124-3p抑制ERN1表達(dá),減輕吸煙相關(guān)COPD氣道炎癥。

此研究探索了在老年COPD患者中實(shí)施高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練前后外周血中miR-124-3p, ERN1及炎癥因子的表達(dá)水平變化,通過體外試驗(yàn)驗(yàn)證miR-124-3p與ERN1的靶向關(guān)系,及其參與運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)COPD機(jī)體炎癥的作用機(jī)制。但本研究僅在細(xì)胞水平進(jìn)行機(jī)制探討,因此存在以下局限:首先本研究僅以煙霧刺激的角度探討了miR-124-3p對機(jī)體炎癥的調(diào)控,還需進(jìn)一步小鼠模型驗(yàn)證;其次僅驗(yàn)證了調(diào)節(jié)miR-124-3p對炎癥因子的影響,未驗(yàn)證ERN1是否可直接調(diào)節(jié)炎癥因子表達(dá),仍需要進(jìn)一步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及組織表達(dá)水平檢測對此結(jié)果行進(jìn)一步驗(yàn)證。