基于兩樣本孟德爾隨機(jī)化研究探究ω-3脂肪酸與年齡相關(guān)性黃斑變性之間的因果關(guān)系

朱露,蔣洪湖,朱靜吟

復(fù)旦大學(xué)附屬華東醫(yī)院眼科,上海 200040

年齡相關(guān)性黃斑變性(age-related macular degeneration, AMD)是老年人視力障礙和視力喪失的主要原因。據(jù)統(tǒng)計(jì),當(dāng)前我國(guó)70歲及以上人群AMD的患病率為20.2%[1]。隨著我國(guó)人口老齡化程度加劇, AMD的患者數(shù)也在持續(xù)上升。臨床上常根據(jù)是否有新生血管將AMD分為干性AMD和濕性AMD[2]。目前,靶向血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)治療濕性AMD已取得重大突破,但對(duì)視力喪失的晚期AMD患者暫無有效的防治手段[3]。ω-3脂肪酸是生命活動(dòng)所必需的多不飽和脂肪酸,包括二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid, EPA)和二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid, DHA)等。由于人體內(nèi)ω-3的轉(zhuǎn)化能力十分有限[4],因此經(jīng)由飲食攝入豐富的EPA和DHA(如魚類和海產(chǎn)品)是獲得足夠ω-3脂肪酸的重要途徑。研究顯示,飲食中富含ω-3與較低風(fēng)險(xiǎn)的AMD相關(guān)[5]。然而,年齡相關(guān)性眼病研究2(Age-Related Eye Disease Study 2, AREDS2)[6]和營(yíng)養(yǎng)性AMD治療2(Nutritional AMD Treatment-2, NAT-2)[7]發(fā)現(xiàn),補(bǔ)充ω-3并不能防止AMD進(jìn)展。孟德爾隨機(jī)化研究(Mendelian randomization study, MR)利用與暴露因素強(qiáng)相關(guān)的遺傳變異作為工具變量,評(píng)估暴露因素與結(jié)局之間的關(guān)系[8]。雖然ω-3會(huì)對(duì)AMD的發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生影響,但是各項(xiàng)研究結(jié)果間存在很大的異質(zhì)性。因此本研究采用兩樣本MR設(shè)計(jì),將ω-3相關(guān)的遺傳變異作為工具變量,通過MR來研究ω-3與AMD是否存在關(guān)聯(lián),以期為防治AMD發(fā)生發(fā)展提供循證依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料本研究設(shè)定ω-3為暴露因素,以AMD和干性AMD為結(jié)局,使用兩樣本MR評(píng)估ω-3與AMD的因果效應(yīng)。其中, ω-3數(shù)據(jù)來自IEU Open全基因關(guān)聯(lián)研究(genome-wide association, GWAS)數(shù)據(jù)庫(kù)(https://gwas.mrcieu.ac.uk/datasets/met-d-Omega_3/)。包括114 999例歐洲個(gè)體,單核苷酸多態(tài)性(single-nucleotide polymorphism, SNP)數(shù)量為12 321 875個(gè)。AMD數(shù)據(jù)來自FinnGene研究(https://gwas.mrcieu.ac.uk/datasets/finn-b-H7_AMD/)。截至2021年該數(shù)據(jù)包括3 763例AMD病例和205 359例對(duì)照, SNP數(shù)量為16 380 424個(gè),人群年齡中位數(shù)為76.58歲(其中男性76.51歲,女性76.64歲)。干性AMD數(shù)據(jù)(https://gwas.mrcieu.ac.uk/datasets/finn-b-DRY_AMD/)包括2 469例干性AMD病例和206 221例對(duì)照, SNP數(shù)量為16 380 423個(gè),人群年齡中位數(shù)為76.19歲(其中男性75.95歲,女性76.42歲)。見表1。

表1 兩樣本MR研究中GWAS數(shù)據(jù)庫(kù)

1.2工具變量SNP篩選從ω-3的GWAS數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出P<5×10-8的SNP。設(shè)置連鎖不平衡參數(shù)(R2=0.001,區(qū)域?qū)挾?0 Mb),確保選定的SNP之間相互獨(dú)立。從AMD的GWAS數(shù)據(jù)庫(kù)中提取與ω-3密切相關(guān)的SNP,將2組SNP數(shù)據(jù)集合并,同時(shí)移除與AMD直接相關(guān)(P<5×10-8)的SNP,去除存在回文變異的SNP?；匚淖儺惗x為相同的等位基因出現(xiàn)在正鏈和負(fù)鏈。本研究通過F=beta2/se2計(jì)算統(tǒng)計(jì)強(qiáng)度,避免出現(xiàn)弱工具偏倚,F>10定義為無弱工具偏倚,去除F<10的SNP[9]。

1.3兩樣本MR分析因果效應(yīng)的主要估計(jì)方法為逆方差加權(quán)法(inverse-variance weighted, IVW),在無異質(zhì)性和水平多效性存在的情況下,這種方法可以提供最準(zhǔn)確的分析結(jié)果[10]。水平多效性定義為SNP通過與暴露無關(guān)的途徑影響結(jié)局。異質(zhì)性定義為SNP之間的差異[11]。此外,本研究還使用了MR-Egger回歸和加權(quán)中位值(weighted median, WME)作為IVW結(jié)果的補(bǔ)充證據(jù)。當(dāng)水平多效性和異質(zhì)性存在的情況下,這2種方法可以提供相對(duì)準(zhǔn)確的估計(jì),本研究中更關(guān)注其方向和效應(yīng)大小[12]。

1.4敏感性分析使用敏感性分析評(píng)估潛在的異質(zhì)性和水平多效性是否對(duì)結(jié)果有顯著影響。Cochran’s Q檢驗(yàn)評(píng)估SNP之間的差異,差異越小提示異質(zhì)性越小,P<0.05表示具有異質(zhì)性。通過MR-Egger回歸中SNP的截距評(píng)估潛在的水平多效性,若截距與0相隔較遠(yuǎn),則存在水平多效性,反之則無,P<0.05表示存在水平多效性。通過MR多效性殘差和離群值(MR pleiotropy residual sum and outlier, MR-PRESSO)檢驗(yàn)中的全局測(cè)試檢測(cè)SNP中水平多效性和異常值的存在(P<0.05)。留一法逐一剔除SNP,并計(jì)算其余SNP的合并效應(yīng),以此評(píng)估每1個(gè)SNP對(duì)結(jié)局的效應(yīng)[13]。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有統(tǒng)計(jì)學(xué)分析均在R版本4.2.2中進(jìn)行,比值比(odds ratio,OR)和95%置信區(qū)間(confidence interval,CI)用以估計(jì)由暴露存在引起的相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)[13]。P<0.05 認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1工具變量共有49個(gè)SNP納入本研究,所有SNP與ω-3密切相關(guān)(P<5×10-8),F統(tǒng)計(jì)量均>10,提示49個(gè)SNP均為有效工具變量,而由弱工具變量所造成的偏倚不會(huì)對(duì)MR分析的因果推斷產(chǎn)生影響。

2.2兩樣本MR分析結(jié)局為AMD的兩樣本MR分析, IVM結(jié)果顯示遺傳預(yù)測(cè)的ω-3水平與AMD風(fēng)險(xiǎn)降低相關(guān)(OR=0.837, 95%CI: 0.747～0.937,P=0.002)。結(jié)局為干性AMD的兩樣本MR分析, IVM結(jié)果顯示遺傳預(yù)測(cè)的ω-3水平與干性AMD風(fēng)險(xiǎn)降低相關(guān)(OR=0.837, 95%CI: 0.735～0.953,P=0.007)。MR-Egger回歸和WME結(jié)果顯示OR<1,提示因果效應(yīng)方向一致。見表2。

表2 ω-3與AMD風(fēng)險(xiǎn)之間的關(guān)聯(lián)

2.3敏感性分析Cochran’s Q檢驗(yàn)結(jié)果顯示, SNP之間無異質(zhì)性(PAMD=0.295,P干性AMD=0.473)。漏斗圖顯示納入的SNP基本對(duì)稱,提示因果關(guān)聯(lián)受到潛在偏倚的影響較小。MR-Egger回歸的截距顯示不存在水平多效性(PAMD=0.515,P干性AMD=0.785),說明SNP只能通過ω-3影響AMD。MR-PRESSO檢驗(yàn)未檢測(cè)到異常的SNP,且不存在水平多效性(PAMD=0.234,P干性AMD=0.437)。逐個(gè)剔除SNP后IVW分析結(jié)果與全部SNP的分析結(jié)果相似,提示不存在對(duì)因果效應(yīng)影響較大的SNP。見表3。

表3 ω-3與AMD風(fēng)險(xiǎn)之間關(guān)聯(lián)的敏感性分析

3 討論

本次研究結(jié)果顯示, ω-3水平與AMD風(fēng)險(xiǎn)降低相關(guān)(OR=0.837, 95%CI: 0.747～0.937,P=0.002); ω-3水平與干性AMD風(fēng)險(xiǎn)降低相關(guān)(OR=0.837, 95%CI: 0.735～0.953,P=0.007)。與傳統(tǒng)的觀察性研究和隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)相比, MR是一種兼具靈活性和穩(wěn)健性的統(tǒng)計(jì)方法,通過使用遺傳變異作為工具變量,從而減少觀察性研究中的混雜、反向因果關(guān)系和回歸稀釋偏倚。該研究中的ω-3數(shù)據(jù)來自IEU Open GWAS數(shù)據(jù)集, AMD數(shù)據(jù)來自FinnGene研究,以上數(shù)據(jù)人群分層相對(duì)集中,且病例群體主要為76歲左右的老年人,上述因素可以最大限度減少人群分層偏差的可能性,這種相似性提升了兩樣本MR假設(shè)的可行性,即遺傳關(guān)聯(lián)結(jié)果是從相同或可比人群的樣本中獲得的[14]。此外,通過MR-Egger回歸分析和MR-PRESSO檢驗(yàn)來估計(jì)效果,為驗(yàn)證研究結(jié)果的非水平多效性提供了依據(jù)。MR-Egger回歸截距顯示不存在水平多效性(PAMD=0.515,P干性AMD=0.785), MR-PRESSO檢驗(yàn)顯示未檢測(cè)到異常SNP且不存在水平多效性(PAMD=0.234,P干性AMD=0.437),以上結(jié)果提示所篩選的49個(gè)SNP只能通過ω-3影響AMD及干性AMD。

ω-3對(duì)視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)的保護(hù)具有重要作用[15], DHA在光感受器的膜上富集達(dá)到最高濃度,對(duì)光感受器的分化和存活以及視網(wǎng)膜功能具有重要影響。而炎癥因子也是AMD的發(fā)病因素之一[16], EPA和DHA的抗炎特性[17]對(duì)AMD有益。ω-3可能會(huì)增加黃斑色素密度,這種色素可以過濾藍(lán)光,并具有局部抗氧化和抗炎活性[18],對(duì)黃斑區(qū)視網(wǎng)膜有保護(hù)作用。而在AREDS2[6]和NAT-2[7]中發(fā)現(xiàn),單純補(bǔ)充ω-3并不能直接預(yù)防AMD進(jìn)展?？紤]AREDS2中的樣本量是基于AREDS的預(yù)期進(jìn)展率所獲得,研究將試驗(yàn)組相較于安慰劑組進(jìn)展為晚期AMD的發(fā)生率減少25%定義為有意義,如補(bǔ)充ω-3的有益效能低于AREDS的預(yù)期進(jìn)展率,則AREDS2顯示結(jié)果無意義[19]。此外, AREDS2中超過60%的受試者受過本科及以上教育,日常飲食營(yíng)養(yǎng)豐富;而對(duì)照組中超過11.1%的受試者自行服用ω-3,違反了協(xié)議指導(dǎo)方針,這些受試者并未按照干預(yù)組管理細(xì)則進(jìn)行進(jìn)一步分類,這種錯(cuò)誤分類可能導(dǎo)致主要結(jié)果無效[20]。事實(shí)上, AREDS2受試者的一些關(guān)鍵基線營(yíng)養(yǎng)參數(shù)(包括血清葉黃素、玉米黃質(zhì)、 DHA和EPA)高于一般人群,以上干擾因素并未在AREDS2研究中排除[6]。而在NAT-2中假設(shè)DHA組和安慰劑組3年內(nèi)發(fā)生脈絡(luò)膜新生血管形成(choroidal neovascularization, CNV)的風(fēng)險(xiǎn)分別為19.8%和33.0%,檢驗(yàn)效能為80.0%,計(jì)算樣本量。DHA組3年以上CNV發(fā)生率(28.4%)高于預(yù)期,安慰劑組3年以上CNV發(fā)生率(25.6%)低于預(yù)期,其樣本量估算的參數(shù)設(shè)置不合理,不符合臨床實(shí)際情況,這可能導(dǎo)致主要結(jié)果無效[7]。此外, NAT-2補(bǔ)充分析發(fā)現(xiàn)DHA對(duì)CFH Y402H非風(fēng)險(xiǎn)等位基因純合的患者有顯著保護(hù)作用(HR=0.14, 95%CI: 0.03～0.59,P=0.008),但DHA對(duì)純合子(HR=2.33, 95%CI: 0.98～5.55,P=0.06)或雜合子風(fēng)險(xiǎn)等位基因(HR=1.19, 95%CI: 0.56～2.51,P=0.65)均無顯著影響[21]?？梢娧a(bǔ)充DHA和CNV之間的聯(lián)系可能受到遺傳易感性的影響,特別是與CFH Y402H變異有關(guān), CFH Y402H所賦予的AMD遺傳易感性可能限制DHA補(bǔ)充劑所提供的益處。膳食補(bǔ)充劑ω-3配伍的不同也可影響人體的生物利用度,例如AREDS2中DHA與EPA的比例為1∶2,而NAT-2中DHA與EPA的比例3∶1。

AMD是導(dǎo)致老年人失明的主要原因,55歲以上人群的發(fā)病率與年齡呈正相關(guān)[22]。中國(guó)約有500多萬AMD患者,隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)、醫(yī)療水平和平均預(yù)期壽命的提高, AMD的患病率一直在上升[2]。AMD嚴(yán)重影響患者視力功能,致使其閱讀和駕駛等重要活動(dòng)減少,抑郁和情緒障礙等疾病發(fā)生率增加[22]。治療AMD的首要目標(biāo)是提高視功能,最大限度減少患者視力喪失或延緩病情進(jìn)展。AMD的主要非遺傳危險(xiǎn)因素是年齡、高血壓、高膽固醇血癥、吸煙、缺乏運(yùn)動(dòng)、肥胖和飲食中抗氧化劑的低攝入[22]。AMD相關(guān)的主要遺傳變異是補(bǔ)體因子H(complement factor H, CFH)和補(bǔ)體因子I,補(bǔ)體成分C2、 C3以及年齡相關(guān)性黃斑病變易感基因2[23]。根據(jù)眼底表現(xiàn), AMD分為濕性AMD和干性AMD,濕性AMD約占AMD的10%,可通過玻璃體注射抗VEGF藥物治療,然而對(duì)于更常見的干性AMD尚無有效的藥物[24]。針對(duì)危險(xiǎn)因素中抗氧化劑的低攝入,研究者選用類胡蘿卜素、姜黃素、鋅、ω-3等營(yíng)養(yǎng)素作為膳食補(bǔ)充劑,結(jié)果證實(shí)類胡蘿卜素(即葉黃素和玉米黃質(zhì))與ω-3的膳食補(bǔ)充組合對(duì)延緩或改善早/中期AMD患者進(jìn)展的效果最好[25]。此外,有證據(jù)表明攜帶AMD不同風(fēng)險(xiǎn)等位基因的患者可能受益于個(gè)性化營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充[23]。然而目前對(duì)遺傳表型和不同營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑對(duì)AMD的進(jìn)展影響了解仍十分有限。高分辨率視網(wǎng)膜成像技術(shù)的進(jìn)步使AMD在體內(nèi)可以精確表型,結(jié)合臨床病理和遺傳相關(guān)性,強(qiáng)調(diào)了AMD的異質(zhì)性。目前眾多學(xué)者認(rèn)為AMD代表一種由不同表型和不同發(fā)病機(jī)制組成的疾病譜[3]。綜上,針對(duì)特定的表型和階段量身定制營(yíng)養(yǎng)支持方法,可能是未來預(yù)防AMD發(fā)生發(fā)展的有效措施,但需更多臨床研究數(shù)據(jù)來驗(yàn)證。

本研究通過兩樣本MR探討ω-3是否對(duì)AMD有影響,結(jié)果與ω-3對(duì)黃斑區(qū)視網(wǎng)膜的保護(hù)作用一致,提示AMD患者可能缺乏ω-3的保護(hù),而通過補(bǔ)充劑或飲食富集提供ω-3,可能有助于延緩AMD的發(fā)生發(fā)展。然而本研究仍有局限性:(1)研究無法精準(zhǔn)評(píng)估EPA、 DHA等ω-3脂肪酸與AMD之間的因果關(guān)聯(lián); (2)ω-3的GWAS效應(yīng)大小是基于血漿濃度計(jì)算的,無法準(zhǔn)確反映細(xì)胞膜的ω-3濃度,這些膜濃度可能會(huì)直接影響AMD的風(fēng)險(xiǎn)[7]; (3)鑒于難以直接確定飲食對(duì)AMD的因果關(guān)系,需要更多高水平研究來驗(yàn)證ω-3對(duì)各類AMD亞型的具體影響。鑒于現(xiàn)有研究的局限性和結(jié)果的多樣性,亟待確定ω-3補(bǔ)充需要的劑量和維持時(shí)間等對(duì)各類型AMD患者的影響,進(jìn)而為改善AMD患者生活質(zhì)量提供臨床診療思路。