miRNA-223在老年人非酒精性脂肪肝患者中的表達(dá)變化及診斷價(jià)值

張穎,童依麗,劉雪靜,潘逸茹,保志軍, 2

1. 復(fù)旦大學(xué)附屬華東醫(yī)院消化科,上海 200040; 2. 上海市老年醫(yī)學(xué)臨床重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 200040; 3. 復(fù)旦大學(xué)附屬華東醫(yī)院檢驗(yàn)科,上海 200040

非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)是一類與胰島素抵抗(insulin resistance, IR)密切相關(guān)的代謝應(yīng)激性肝損傷性疾病[1],可進(jìn)一步發(fā)展為非酒精性脂肪性肝硬化以及原發(fā)性肝癌。NAFLD的發(fā)病具有顯著的年齡相關(guān)性,流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示,我國(guó)NAFLD患病率為20.09%, 60歲以上的老年人群患病率高達(dá)44.43%[2]。然而對(duì)老年NAFLD的認(rèn)識(shí)及其危害性并沒有得到足夠重視,尋找一個(gè)簡(jiǎn)便有效的診斷方法進(jìn)行早期干預(yù)治療尤為重要。

微小RNA(microRNA, miRNA)作為一種重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子,在肝臟脂質(zhì)代謝、胰島素抵抗以及衰老等生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮特有的調(diào)控作用[3]。高通量測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)并證實(shí), miR-223在衰老NAFLD大鼠肝組織中的表達(dá)顯著上調(diào)[4]。但是關(guān)于miR-223在胰島素抵抗中的應(yīng)用研究報(bào)道較少。本研究基于前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果,探討分析血清miR-223在老年NAFLD患者中的表達(dá)變化及其潛在的臨床意義和診斷價(jià)值,為老年人NAFLD的早期診斷和早期預(yù)防提供理論依據(jù)。

1 資料和方法

1.1研究對(duì)象2019年5月—2020年10月復(fù)旦大學(xué)附屬華東醫(yī)院消化科和老年科具備完整病史資料的非酒精性脂肪肝門診和住院病例(NAFLD組),年齡≥65歲,共80例,診斷標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn)參照《非酒精性脂肪性肝病診療指南(2018年更新版)》[1]。選擇我院同期體檢的非脂肪肝老年人80例為對(duì)照組。所有受試者均經(jīng)B超檢查,并測(cè)量身高、體重,計(jì)算體質(zhì)量指數(shù)(BMI)(BMI=體重/身高2)。其中NAFLD組男57例(71.3%),女23例(28.7%),年齡65～89歲,平均(76.3±5.4歲);對(duì)照組男60例(75.0%),女20例(25.0%),年齡65～88歲,平均(75.5±6.0歲)。2組性別、年齡無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),具有可比性(表1)。本研究經(jīng)復(fù)旦大學(xué)附屬華東醫(yī)院倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)(20170078),入組人群均知情同意。

表1 2組一般資料比較(n=80)

1.2標(biāo)本采集及常規(guī)生化檢測(cè)清晨空腹采血, 3500rpm離心10min,取上清液,全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)肝功能(ALT、 GGT)、血糖(FPG)、血脂(TG、 Ch、 LDL、 HDL)。剩余血清-80 ℃保存以備用。

1.3瞬時(shí)彈性成像技術(shù)(Fibroscan)檢測(cè)受試者取仰臥位,右手抱頭, Fibroscan-520機(jī)型檢測(cè)儀(Echosens公司,法國(guó))測(cè)定受控衰減參數(shù)(controlled attenuation parameters, CAP)。由同一名經(jīng)驗(yàn)豐富的臨床醫(yī)師使用M型探頭在患者右側(cè)腋中線第7～9肋間進(jìn)行測(cè)量,連續(xù)有效檢測(cè)10次,取中位數(shù)為最終測(cè)定結(jié)果。

1.4實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)血清miR-223表達(dá)水平按血清RNA抽提試劑盒(TIANGEN公司,北京)操作說(shuō)明書提取總RNA, NanoDrop超微量分光光度計(jì)(Thermo公司,美國(guó))檢測(cè)RNA濃度,吸光度(OD260/OD280)比值在1.8～2.0時(shí),說(shuō)明提取的RNA純度高,無(wú)蛋白質(zhì)殘余。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa公司,日本)說(shuō)明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄, cDNA保存于-20℃。引物由上海生工生物工程有限公司合成。引物序列為:F: 5′-ACACTCCAGCTGGGTGTCAGTTTGTCAAAT-3′, R: 5′-CTCAAGTGTCGTGGAGTCGGCAA-3′, GADPH為內(nèi)參。將逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物稀釋至2倍作為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè),反應(yīng)體系為20 μl。反應(yīng)條件:50 ℃預(yù)變性30 s, 95 ℃ 15 s, 60 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s,共40個(gè)循環(huán)。實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果以Ct值(Cycle threshold)表示, miR-223相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCT法計(jì)算。每個(gè)樣本重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1一般資料比較表1可見老年NAFLD組合并高血壓、糖尿病者高于健康對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2血清生化指標(biāo)比較與健康對(duì)照組相比, NAFLD組BMI、 ALT、 GGT、 TG、 Ch、 FBG增高(P<0.05), HDL降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 2組各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)比較

2.3Fibroscan檢測(cè)結(jié)果比較NAFLD組CAP值高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=11.895,P=0.001)。見表2。

ALT丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶, GGT γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶, TG甘油三酯, Ch膽固醇, LDL低密度脂蛋白, HDL高密度脂蛋白, FBG空腹血糖。

2.4miR-223在2組患者血清中的表達(dá)變化實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示, NAFLD組患者血清miRNA-223表達(dá)水平高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(0.92±0.60) vs (0.40±0.29),t=3.175,P=0.003)見圖1。

圖1 miR-223在老年NAFLD患者血清中的表達(dá)

2.5miR-223與各指標(biāo)的相關(guān)性分析Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示, miRNA-223與TG(r=0.387), LDL(r=0.363), HDL(r=0.394)呈正相關(guān)(P<0.05),而與年齡(r=0.121), BMI(r=-0.151), ALT(r=-0.109), GGT(r=-0.157), Ch(r=-0.108), FBG(r=-0.280), CAP(r=0.109)無(wú)相關(guān)性(P>0.05),見表3。

表3 miR-223與各指標(biāo)的相關(guān)性分析

2.6血清miR-223對(duì)老年人NAFLD的診斷價(jià)值ROC曲線分析結(jié)果顯示, AUC為0.809(95%CI: 0.675～0.943,P=0.001),見圖2。

圖2 ROC曲線圖

3 討論

miRNAs是一類大小為21～23nt (nucleotide)的單鏈小分子RNA,與靶基因mRNA 3′端非翻譯區(qū)(3′UTR)完全或不完全互補(bǔ)結(jié)合,在轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)mRNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄抑制或促使其降解,影響目標(biāo)mRNA的穩(wěn)定性及翻譯,從而達(dá)到調(diào)控靶基因表達(dá)的目的[3]。已有報(bào)道證實(shí), miR-34a、 miR-155、 miR-122在人類NAFLD肝組織中表達(dá)異常,這些miRNAs可能通過(guò)打破胰島素代謝以及調(diào)節(jié)膽固醇和脂肪酸之間的平衡,參與了NAFLD的發(fā)生與發(fā)展[3,5,6]。但是這些研究樣本量少,缺乏對(duì)老年NAFLD患者的獨(dú)立研究以及長(zhǎng)期隨訪追蹤,存在一定程度的局限性。

本課題組在前期的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并證實(shí)[4], miR-223在衰老大鼠脂肪肝組織中表達(dá)明顯上調(diào)。miR-223定位于X染色體,最早在造血系統(tǒng)得到確認(rèn),在促進(jìn)造血干細(xì)胞的增殖分化中起了重要的調(diào)控作用[5]。后續(xù)研究陸續(xù)報(bào)道, miR-223在胃癌、肝癌、卵巢癌等腫瘤組織,以及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎等免疫炎癥性疾病等多種疾病中同樣起著重要的調(diào)控作用[7-8]。然而關(guān)于miR-223在NAFLD以及胰島素抵抗中的作用報(bào)道甚少,僅有幾篇文章提示miR-223在人類和肥胖小鼠中有異常表達(dá)[9-10]。

本組課題研究結(jié)果表明,老年NAFLD組患者BMI、 CAP值以及血清ALT、 GGT、 TG、 Ch、 FBG水平高于對(duì)照組(P<0.05),提示老年NAFLD患者存在明顯的胰島素抵抗。血清miRNA-223在NAFLD患者中呈現(xiàn)高表達(dá)水平(P=0.003),提示miRNA-223與老年人胰島素抵抗密切相關(guān),可能參與了老年人NAFLD的發(fā)生發(fā)展,這與我們前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的結(jié)果相符[4,11]。進(jìn)一步所做的直線相關(guān)性分析表明,血清miRNA-223的表達(dá)與老年NAFLD組TG、 LDL以及HDL水平呈顯著正相關(guān)(P<0.05),提示老年NAFLD患者血脂水平的異?？赡苁艿搅搜錷iR-223的調(diào)控,血清miRNA-223或可成為老年NAFLD患者更為敏感的檢測(cè)指標(biāo),為老年人脂肪肝的無(wú)創(chuàng)性篩查提供了新的手段。CAP值作為評(píng)估肝臟脂肪變的重要參數(shù),在評(píng)估包括NAFLD在內(nèi)的各種慢性肝臟疾病的脂肪變方面已得到廣泛認(rèn)可[12],但是本組研究結(jié)果并未發(fā)現(xiàn)miR-223的表達(dá)與CAP值有顯著相關(guān)性(r=0.109,P>0.05)。ROC曲線分析結(jié)果顯示AUC為0.809 (P=0.001),進(jìn)一步證實(shí)血清miR-223對(duì)老年NAFLD患者有診斷意義。

綜上所述, miR-223在老年NAFLD患者血清中表達(dá)顯著升高,并與TG、 LDL、 HDL呈正相關(guān)性。miR-223在循環(huán)血液中穩(wěn)定性表達(dá)的特點(diǎn)預(yù)示著其可能成為診斷老年人非酒精性脂肪肝的潛在標(biāo)志物,為老年人早期診斷和早期預(yù)防NAFLD提供理論依據(jù)。本課題組尚未對(duì)患者進(jìn)行長(zhǎng)期追蹤隨訪,后續(xù)研究需要更多的樣本量來(lái)進(jìn)行綜合有效地評(píng)估,并進(jìn)一步積極探索miR-223在調(diào)控衰老機(jī)體脂肪肝變中的發(fā)生發(fā)展機(jī)制。