Box-Behnken設(shè)計(jì)—響應(yīng)面法優(yōu)化地參總?cè)扑峒兓に?/h1>
2023-11-02 16:01:07李金金葉明燕姚歡吳應(yīng)梅周濃
南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào) 2023年6期
李金金 葉明燕 姚歡 吳應(yīng)梅 周濃
DOI：10.3969/j.issn.2095-1191.2023.06.011
摘要：【目的】建立響應(yīng)面模型優(yōu)化合適樹脂下地參總?cè)扑岬募兓に?，為研究地參總?cè)扑峄钚蕴峁┘夹g(shù)參考。【方法】運(yùn)用Box-Behnken設(shè)計(jì)方法，采用大孔樹脂吸附純化地參總?cè)扑?，以吸附率和解吸率為指?biāo)，測定5種大孔樹脂（AB-8、D101、HPD600、DA201和S-8型）對地參總?cè)扑岬募兓Ч?。以上樣濃度、上樣流速、洗脫濃度和洗脫流速為自變量，回收率為因變量，運(yùn)用響應(yīng)面法優(yōu)化地參總?cè)扑峒兓に噮?shù)?！窘Y(jié)果】最佳顯色條件：顯色溫度60℃，5%香草醛—冰乙酸0.2 mL，高氯酸0.4 mL，檢測波長545 nm。AB-8型樹脂對地參總?cè)扑岬奈胶徒馕Ч罴眩馕蕿?8.61%，吸附率為70.54%。上樣體積在40 mL，80%乙醇100 mL為最佳洗脫體積。建立的回歸方程：Y=0.6887+0.0196A-0.0085B-0.0287C+0.0052D+0.0299AB-0.0107AC-0.0122AD+0.0128BC+0.0211BD+0.026A2-0.0765B2-0.0877C2-0.0932D2（A為上樣濃度，B為上樣流速，C為洗脫濃度，D為洗脫流速，Y為總?cè)扑峄厥章剩?。由Box-Behnken方差分析結(jié)果可得，上樣濃度和洗脫濃度2個(gè)因素，以及上樣濃度與上樣流速的交互作用、洗脫濃度與洗脫流速的交互作用對地參總?cè)扑峄厥章视绊憳O顯著（P<0.01），上樣流速與洗脫流速的交互作用對總?cè)扑峄厥章视绊戯@著（P<0.05），4個(gè)因素對地參總?cè)扑峄厥章视绊戫樞驗(yàn)橄疵摑舛?gt;上樣濃度>上樣流速>洗脫流速。優(yōu)化后的地參總?cè)扑峒兓に嚕荷蠘訚舛?.66 mg/mL、上樣流速2 BV/h、洗脫濃度80%、洗脫流速2 BV/h，在此條件下，總?cè)扑崞骄厥章蕿?7.37%?！窘Y(jié)論】建立的回歸模型可用于地參總?cè)扑峒兓に嚨念A(yù)測；AB-8型大孔樹脂對地參總?cè)扑岬姆蛛x純化效果較好，適用于總?cè)扑嵛镔|(zhì)的純化。
關(guān)鍵詞：地參；總?cè)扑幔淮罂讟渲?；純化工藝；響?yīng)面法
中圖分類號：S567.239? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：2095-1191（2023）06-1697-14
Purification process of total triterpenic acids from Lycopus lucidus Turcz. by Box-Behnken design-response surface methodology
LI Jin-jin1，2， YE Ming-yan1，2， YAO Huan1，2， WU Ying-mei1， ZHOU Nong1，2*
（1College of Biological and Food Engineering，Chongqing Three Gorges University，Chongqing? 404120，China；
2Chongqing Engineering Laboratory for Green Planting and Deep Processing of Genuine Medicinal Materials in
Three Gorges Reservoir Area，Chongqing 404120，China）
Abstract：【Objective】A response surface model was established to optimize the purification process of total triterpenic acids from Lycopus lucidus Turcz. with suitable resin，so as to provide technical reference for further study on the activity of total triterpenic acids from L. lucidus. 【Method】Using the Box-Behnken design method， the total triterpenic acids of L. lucidus was purified by macroporous resin adsorption. The purification effects of macroporous resins （AB-8 type， D101 type， HPD600 type， DA201 type and S-8 type） on total triterpenic acids of L. lucidus were determined by using the adsorption rate and desorption rate as indexes. The sample concentration，sample loading speed， eluent concentration and eluentvelocity were the independent variables， and recovery rate was the dependent variable. The purification process parameters of total triterpenic acids from L. lucidus were optimized by response surface methodology. 【Result】Optimum color development conditions were： color development temperature of 60 ℃， 5% vanillin-glacial acetic acid of 0.2 mL， perchloric acid of 0.4 mL， and detection wavelength of 545 nm. The results showed that AB-8 type macroporous resin had the best adsorption and desorption effectsontotal triterpenic acids of L. lucidus， withthe desorption rate of 88.61% and the adsorption rate of 70.54%. The loading volume was 40 mL， and 80% ethanol 100 mL was the best eluent volume. A regression equation was set up：Y=0.6887+0.0196A-0.0085B-0.0287C+0.0052D+0.0299AB-0.0107AC-0.0122AD+0.0128BC+0.0211BD+0.026A2-0.0765B2-0.0877C2-0.0932D2（A：sample concentration，B：sample loading speed，C：eluent concentration，D：eluent velocity，Y：recovery rate of total triterpenic acids）. According to Box-Behnken variance analysis，sample concentration， eluent concentration，the interaction between sample concentration and sample loading speed，and the interac-tion between eluent concentration and eluent velocity had extremely significant effects on the recovery rate of total triterpenic acids from L. lucidus（P<0.01）， while the interaction between sample loading speed and eluent velocity had significant effects on the recovery rate of total triterpenic acids from L. lucidus（P<0.05）. The four single factors affected the recovery rate of total triterpenic acids of L. lucidus in the order of eluent concentration>sample concentration>sample loading speed>eluent velocity from L. lucidus. The optimized purification process for total triterpenic acids of L. lucidus was： sample concentration of 0.66 mg/mL， sample loading speed of 2 BV/h， eluent concentration of 80% and from L. lucidus of 2 BV/h. Under these conditions， the average recovery rate of total triterpenic acids was 67.37%. 【Conclusion】The established regression model can be used to predict the purification process of total triterpenic acids from L. lucidus； the AB-8 type macroporous resin has a relatively good effect on the separation and purification of total triterpenic acids from L. lucidus， which is suitable for the purification of total triterpenic acids.
Key words： Lycopus lucidus Turcz.； total triterpenic acids； macroporous resin； purification process； response surface methodology
Foundation items：Chongqing Natural Science Foundation（cstc2019jcyj-msxmX0770）；Science and Technology Research Project of Chongqing Education Commission（KJQN202201231， KJQN202002712）
0 引言
【研究意義】地參（Lycopus lucidus Turcz.）又名澤蘭，是一年生草本唇形科植物，以地下部分入藥，多分布于我國東北、西北及西南地區(qū)。其野生資源環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)，不僅生命力頑強(qiáng)，蟲害也極易防治，栽種資源豐富（羅孟禹和董開居，2006）。總?cè)扑嵋蚓哂锌鼓[瘤、抗炎、調(diào)節(jié)血糖血脂和提高免疫力等功效而受到大眾的關(guān)注（Fukushima et al.，2006；Zhu et al.，2016；Biswas and Dwivedi，2019），但總?cè)扑犷愇镔|(zhì)在動植物體內(nèi)含量較少，且存在形態(tài)復(fù)雜，對植物資源中總?cè)扑徇M(jìn)行提取分離純化是使其發(fā)揮更好功效的必要前提。采用醇提法對地參總?cè)扑岢醪教崛?，所得總?cè)扑岢煞譃榇痔嵛铩Ｓ捎诖痔嵛镏锌側(cè)扑峒兌容^低，地參中成分復(fù)雜，其中含有總?cè)扑?、多糖、多酚和黃酮等生物活性成分，且提取液中多糖成分較多，不易儲存（許泳吉等，2003；Lu et al.，2015），因而純化地參粗提液尤為重要?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前純化三萜酸最常見的方法是大孔樹脂吸附法（姚干等，2007；劉娜，2016），不同極性的樹脂對不同種類化合物的選擇性有所不同。杜暉和王春雨（2007）研究表明X-5型樹脂能有效富集純化夏枯草中2種五環(huán)三萜酸成分，產(chǎn)品中目標(biāo)組分的純度和回收率較高，工藝流程簡單易行；袁懷波等（2007，2008）采用大孔樹脂對山楂和木瓜提取液進(jìn)行分離純化，在上樣pH為6、洗脫液70%的條件下洗脫出山楂和木瓜總?cè)扑峒兓?，產(chǎn)品的純度遠(yuǎn)高于粗提液；樊君等（2008）利用大孔吸附樹脂對棗渣中三萜酸進(jìn)行分離純化，其回收率在65%以上，純度也達(dá)80%以上；桑詠梅和丁振鐸（2011）通過D101型樹脂檢測中藥復(fù)方金匱腎氣丸中總?cè)祁惓煞郑謩e對總?cè)扑釂误w及總?cè)扑岬奈叫阅芎拖疵搮?shù)進(jìn)行優(yōu)化，進(jìn)而證明樹脂能有效吸附和解吸總?cè)扑釂误w和總?cè)扑?；梁卓然?021）對女貞果實(shí)中齊墩果酸進(jìn)行提取，采用HPD300型樹脂純化后，其齊墩果酸含量可達(dá)86.53%，經(jīng)高效液相色譜（HPLC）檢測，分離純化后齊墩果酸能與雜質(zhì)有效分離。研究報(bào)道，非極性或弱性的樹脂可用于分離總?cè)扑?，AB-8型樹脂適用于黃酮、生物堿和多糖類等物質(zhì)的提取分離和純化（諶江城等，2014；閔玉濤等，2015）。蒙瑞波等（2012）利用AB-8型樹脂對白花蛇舌草中總?cè)扑徇M(jìn)行提取純化，其純化參數(shù)為上樣流速2 BV/h、洗脫流速2 BV/h、洗脫乙醇體積分?jǐn)?shù)80%，在該條件下，總?cè)扑岬募兌瓤商嵘?倍，說明AB-8型樹脂對總?cè)扑崽崛⌒Ч麡O大提高；王苗苗等（2020）采用AB-8型樹脂富集羅漢果莖中三萜酸，經(jīng)大孔樹脂富集后三萜酸含量明顯增加；柯春山等（2021）篩選出AB-8型樹脂為純化裸花紫珠的最適樹脂，純化后溶液由渾濁變?yōu)槌吻??！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】大孔吸附樹脂用于中藥材有效成分的篩選也有明顯效果（黃燕秋等，2018）。劉娜（2016）對比多種型號樹脂對澤蘭地上部分分離純化的效果，其中AB-8型樹脂對澤蘭地上部分純化的吸附量、解吸率和吸附率分別為11.82 mg/g、81.82%和55.47%。但目前針對澤蘭地下部分中總?cè)扑岢煞旨兓难芯繄?bào)道少有，尤其是利用大孔吸附樹脂進(jìn)行純化?！緮M解決的關(guān)鍵問題】對地參總?cè)扑犸@色條件及純化工藝進(jìn)行優(yōu)化，篩選出最佳顯色條件及最優(yōu)樹脂，再以最優(yōu)大孔樹脂對地參總?cè)扑岽痔嵛镞M(jìn)行純化，以回收率為考察指標(biāo)，運(yùn)用響應(yīng)面模型優(yōu)化純化工藝參數(shù)，為研究地參總?cè)扑峄钚蕴峁┘夹g(shù)參考。
1 材料與方法
1. 1 試驗(yàn)材料
地參產(chǎn)自重慶市萬州區(qū)（人工栽培），由重慶三峽學(xué)院生物與食品工程學(xué)院周濃教授鑒定為地參，在自然條件下烘干，粉碎后過100目篩備用。熊果酸對照品（批號DST180606-019，HPLC≥98%）購自成都德思特生物技術(shù)有限公司；無水乙醇（AR）購自重慶川東化工（集團(tuán)）有限公司；香草醛（香蘭素）（AR）、冰乙酸（AR）和高氯酸（AR）購自成都市科隆化學(xué)品有限公司；S-8型樹脂購自上海吉至生化科技有限公司；AB-8型樹脂購自上海麥克林生化科技股份有限公司；D101型、HPD600型和DA201型樹脂購自鄭州和成新材料科技有限公司。主要儀器設(shè)備：高速多功能粉碎機(jī)（浙江省永康市金穗機(jī)械制造廠）、玻璃砂芯層析柱（三維實(shí)驗(yàn)室玻璃儀器公司）、A2004型電子天平（上海津平科學(xué)儀器有限公司）、精密天平（METTLER YOLEDO集團(tuán)）、HSY-26型數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司）、BUCHI R-300旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（北京海富達(dá)科技有限公司）和V-1100D型可見分光光度計(jì)（上海美譜達(dá)儀器有限公司）。
1. 2 試驗(yàn)方法
1. 2. 1 樣品溶液制備 稱取地參1.000±0.002 g置于錐形瓶中，平行3次，醇提法提取，過濾，濃縮，以乙醇溶液定容至5 mL，移取0.1 mL稀釋至50 mL，搖勻后測定吸光值，重復(fù)3次取平均值。
1. 2. 2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 稱取減壓干燥至恒重的對照品適量，加乙醇溶解并制成濃度為0.0985 g/mL的對照品溶液。取對照品溶液1.0 mL，用乙醇定容至500 mL，逐級稀釋；再分別精密吸取對照品溶液0.1、0.3、0.5、0.7和0.9 mL，測定其吸光值。以對照品溶液濃度為橫坐標(biāo)、吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
1. 3 檢測波長測定及顯色條件優(yōu)化
1. 3. 1 檢測波長確定 精密移取對照品溶液和供試品溶液，置于試管中揮干水分，加入配制的5%香草醛—冰乙酸0.4 mL和高氯酸0.5 mL，置于水浴鍋中恒溫加熱15 min，冷卻后加入冰乙酸3.0 mL，搖勻，待測。以空白及無水乙醇為對照組，采用紫外分光光度計(jì)在200～800 nm處全波長掃描，對照品及樣品溶液均在545 nm處有最大吸收，因此在檢測波長545 nm處測定總?cè)扑峥偭俊?/p>
1. 3. 2 5%香草醛—冰乙酸用量 移取已配制對照品溶液0.5 mL，平行5份，依次加入5%香草醛—冰乙酸溶液0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mL，加入高氯酸溶液0.4 mL，然后加入3.0 mL冰乙酸，按1.3.1方法測定其吸光值。
1. 3. 3 高氯酸用量 移取已配制對照品溶液0.5 mL，平行5份，加入5%香草醛—冰乙酸溶液0.4 mL，依次加入高氯酸0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mL，然后加入3.0 mL冰乙酸，按1.3.1方法測定其吸光值。
1. 3. 4 顯色溫度 顯色劑：移取5%香草醛—冰乙酸溶液0.2 mL，高氯酸0.4 mL，依次置于40、50、60、70和80 ℃水浴鍋中恒溫加熱15 min，然后加入冰乙酸3.0 mL，按1.3.1方法測定其吸光值。顯色劑+對照品：移取已配制對照品溶液0.5 mL，加入5%香草醛—冰乙酸溶液0.2 mL，高氯酸0.4 mL，依次置于40、50、60、70和80 ℃水浴鍋中恒溫加熱15 min，然后加入冰乙酸3.0 mL，按1.3.1方法測定其吸光值。
1. 4 方法學(xué)考察
1. 4. 1 精密度試驗(yàn) 取對照品溶液0.5 mL，平行6份，按1.3.1方法測定吸光值，并計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。
1. 4. 2 重復(fù)性試驗(yàn) 取樣品溶液6份，按1.3.1方法測定吸光值，并計(jì)算RSD。
1. 4. 3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取樣品溶液0.5 mL，每隔10 min測定一次吸光值，按1.3.1方法測定吸光值，并計(jì)算RSD。
1. 4. 4 加樣回收試驗(yàn) 精密移取重復(fù)性考察中供試品溶液6份，每份溶液0.2 mL，再加入0.2 mL已知含量的對照品溶液，按1.3.1方法測定吸光值，并計(jì)算加樣回收率及其RSD。
1. 5 大孔樹脂純化工藝
1. 5. 1 大孔樹脂預(yù)處理 稱量一定質(zhì)量的樹脂，取96%乙醇浸泡24 h，去除樹脂的雜質(zhì)和不完整碎片，使樹脂充分溶脹，采用濕法裝柱，用96%乙醇反復(fù)沖洗至流出液不產(chǎn)生渾濁，再用蒸餾水洗至無醇味以平衡柱子，柱子中樹脂排列均勻、無氣泡，即預(yù)處理完成，備用。
1. 5. 2 大孔樹脂篩選 測定吸附率和解吸率，以篩選大孔樹脂。靜態(tài)飽和吸附率測定：分別選擇預(yù)處理過的AB-8、D101、HPD600、DA201和S-8型樹脂適量（相當(dāng)于干重2 g）置于錐形瓶中，加入精密移取的10.0 mL地參總?cè)扑釢饪s液（0.7282 mg/mL），在搖床中150 r/min常溫振蕩24 h，至吸附平衡，過濾，所得濾液測定其吸光值A(chǔ)1，計(jì)算可得總?cè)扑釢舛群蜆渲柡臀铰省?/p>
解吸率測定：將充分吸附飽和的樹脂吸干表面水分，置于錐形瓶中，加入無水乙醇在搖床中150 r/min常溫振蕩24 h，測定其吸光值A(chǔ)2，計(jì)算可得解吸液中總?cè)扑釢舛群拖疵撘航馕省?/p>
吸附量=（C0-C1）V/M
吸附率（%）=（C0-C1）/C0×100
解吸率（%）=C2/（C0-C1）×100
回收率（%）=C2/C0×100
式中，M為樹脂質(zhì)量（mg），V為吸附液體積（mg/L），C0為吸附液中總?cè)扑釢舛龋╩g/mL），C1為吸附后溶液總?cè)扑釢舛龋╩g/mL），C2為解吸液中總?cè)扑釢舛龋╩g/mL）。
1. 6 大孔樹脂靜態(tài)吸附動力學(xué)研究
1. 6. 1 靜態(tài)吸附動力學(xué)研究 對大孔樹脂的靜態(tài)吸附能力進(jìn)行考察，以吸附時(shí)間為橫坐標(biāo)、吸附量為縱坐標(biāo)，繪制靜態(tài)吸附曲線。在室溫條件下，稱量預(yù)處理的AB-8型大孔樹脂適量，置于100 mL錐形瓶中，精密移取地參總?cè)扑崽崛∫海?.7282 mg/mL），置于150 r/min搖床中，振蕩以測定大孔樹脂的靜態(tài)吸附能力。以接觸零時(shí)刻開始，每隔60 min取出樣液測定1次總?cè)扑岷浚?jì)算樹脂吸附量，繪制靜態(tài)吸附曲線。采用準(zhǔn)一級速率方程和準(zhǔn)二級速率方程2個(gè)動力學(xué)模型模擬吸附過程，進(jìn)一步分析AB-8型樹脂對地參總?cè)扑岬奈剿俾是闆r。
準(zhǔn)一級速率方程：ln（Qe-Qt）=lnQe+K1t
準(zhǔn)二級速率方程：t/Qt=1/K2Qe+t/Qe
式中，t為吸附時(shí)間（min），Qt為t時(shí)刻樹脂吸附量（mg/g），Qe為平衡時(shí)樹脂吸附量（mg/g），K1和K2分別為準(zhǔn)一級速率方程速率常數(shù)和準(zhǔn)二級速率方程速率常數(shù)（min-1）。
1. 6. 2 吸附等溫線測定 配制不同濃度的總?cè)扑崽崛∫?，在室溫條件下，150 r/min搖床振蕩24 h后測定樣液中總?cè)扑釢舛龋?jì)算不同濃度樣液的吸附量。以樣液濃度為橫坐標(biāo)、吸附量為縱坐標(biāo)，繪制樹脂吸附地參總?cè)扑岬牡葴厍€。等溫線的擬合能進(jìn)一步了解樹脂對地參總?cè)扑岬奈椒绞?，因而選擇Langmuir和Freundlich 2種等溫吸附方程線性擬合等溫線模型。
Ce/Qe=Ce/Qm+1/KLQm
lnQe=lnKF+1/nlnCe
式中，Ce為溶液平衡時(shí)的濃度（mg/mL），Qe為平衡吸附量（mg/g），Qm為飽和吸附量（mg/g），KL為Langmuir方程常數(shù)（L/mg），n和KF為Freundlich方程常數(shù)，其中KF的單位為L/mg。
1. 7 大孔樹脂動態(tài)吸附—解吸性能試驗(yàn)
1. 7. 1 大孔樹脂上樣液泄露曲線 量取預(yù)處理的AB-8型樹脂適量進(jìn)行動態(tài)吸附，濕法裝柱，用已知濃度的地參總?cè)扑崛芤海?.7282 mg/mL）上柱，流速1 BV/h，分段收集流出液，每份5 mL，收集30份流出液。以收集管吸附液編號為橫坐標(biāo)、總?cè)扑岷繛榭v坐標(biāo)，繪制總?cè)扑嵘蠘右盒孤肚€。
1. 7. 2 上樣濃度選擇 取已測濃度的地參總?cè)扑崛芤?，分別加水稀釋成0.50、0.55、0.60、0.65和0.70 mg/mL不同濃度梯度進(jìn)行上柱，靜止1 h，依次用80%乙醇進(jìn)行洗脫，控制流速為1 BV/h，收集洗脫液，測定總?cè)扑嵛庵?，確定最佳上樣濃度。
1. 7. 3 上樣流速選擇 取已測濃度的地參總?cè)扑崛芤?，分別以1、2、3、4和5 BV/h流速上柱，靜止1 h，依次用80%乙醇進(jìn)行洗脫，控制流速為1 BV/h，收集洗脫液，測定總?cè)扑岷?，確定最佳上樣流速。
1. 7. 4 大孔樹脂洗脫曲線 量取預(yù)處理的AB-8型樹脂適量進(jìn)行動態(tài)洗脫，濕法裝柱，以已測濃度的地參總?cè)扑崛芤荷现?，流速? BV/h進(jìn)行動態(tài)吸附，待樹脂吸附平衡后，用80%乙醇進(jìn)行洗脫，分段收集洗脫液，每份5 mL，收集30份流出液。以收集管洗脫液編號為橫坐標(biāo)、總?cè)扑岷繛榭v坐標(biāo)，繪制洗脫曲線。
1. 7. 5 洗脫濃度選擇 取已測濃度的地參總?cè)扑崛芤簼穹ㄑb柱，用蒸餾水洗滌平衡，待樹脂吸附至平衡后，用50%、60%、70%、80%和90%乙醇進(jìn)行洗脫，控制洗脫流速為1 BV/h，測定總?cè)扑岷?，確定最佳洗脫濃度。
1. 7. 6 洗脫流速選擇 取已測濃度的地參總?cè)扑崛芤荷现? BV/h流速通過后，用80%乙醇以1、2、3、4和5 BV/h進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，測定總?cè)扑岷?，確定最佳洗脫流速。
1. 8 響應(yīng)面設(shè)計(jì)
根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)一步設(shè)計(jì)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。選取總?cè)扑峒兓崛⌒Ч詈玫囊蛩厮?，以上樣濃度、上樣流速、洗脫濃度和洗脫流速為自變量，總?cè)扑峒兓厥章蕿轫憫?yīng)值，采用4因素3水平設(shè)計(jì)Box-Behnken Design試驗(yàn)，響應(yīng)面因素水平見表1。
1. 9 統(tǒng)計(jì)分析
采用Excel 2019、Origin 2018和SPSS 26.0處理數(shù)據(jù)及繪圖，以Design-Expert 12作響應(yīng)面設(shè)計(jì)及試驗(yàn)分析。
2 結(jié)果與分析
2. 1 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系考察結(jié)果
于545 nm處測定吸光值，以標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度為橫坐標(biāo)（x）、吸光值為縱坐標(biāo)（y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示。所得回歸方程：y=4.41878x+0.0152（R2=0.9996），繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線在0.00197～0.01773 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。
2. 2 方法學(xué)考察結(jié)果
2. 2. 1 精密度試驗(yàn)結(jié)果 計(jì)算所得總?cè)扑崞骄鵕SD為1.75%，小于10%，表明儀器精密度良好。
2. 2. 2 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果 地參總?cè)扑崞骄鵕SD為2.19%，小于10%，表明醇提法提取地參總?cè)扑岬脑囼?yàn)方法重復(fù)性較好。
2. 2. 3 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果 由表2可知，吸光值在20～40 min內(nèi)較穩(wěn)定，40 min穩(wěn)定性開始下降，RSD為1.12%，表明地參樣液適合在20～40 min內(nèi)測定吸光值。
2. 2. 4 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果 由表3可知，回收率為96.59%～106.65%，在90%～110%范圍內(nèi)，表明醇提法提取地參總?cè)扑岬姆椒煽俊?/p>
2. 3 顯色條件優(yōu)化結(jié)果
由表4可知，5%香草醛—冰乙酸用量越多，吸光值最低，影響樣品的顯色效果，因而用量在0.2 mL時(shí)最合適；高氯酸隨著加入量的增加，對樣品的顯色效果影響相對較小，當(dāng)高氯酸加至0.4 mL時(shí)，顯色效果最佳，故選擇高氯酸用量為0.4 mL。加入顯色劑和顯色劑+對照品2組對比（表5）發(fā)現(xiàn)，顯色劑組吸光值隨溫度的升高而不斷增加，在60 ℃升至70 ℃時(shí)，吸光值增加明顯，說明顯色劑對顯色效果的影響較大，綜合考慮，選取60 ℃為顯色溫度。
2. 4 不同樹脂的吸附率與解吸率
由表6可知，AB-8、D101和HPD600型樹脂均為非極性樹脂，萜類成分與非極性樹脂極性類似，3種型號樹脂的解吸率和吸附率均較高，其中AB-8型樹脂最高，解吸率和吸附率分別為88.61%和70.54%。綜合考慮吸附量、解吸率和吸附率指標(biāo)，選擇AB-8型樹脂作下一步研究。
2. 5 大孔樹脂靜態(tài)吸附動力學(xué)試驗(yàn)結(jié)果
2. 5. 1 靜態(tài)吸附動力學(xué) 由圖2可知，隨著吸附時(shí)間的延長，AB-8型樹脂對總?cè)扑岬奈搅坎粩嘣黾樱?～3 h吸附量快速增加，在3～6 h吸附量增速有所減緩，6 h之后的吸附量（3.0098 mg/g）增速進(jìn)一步減緩并接近平衡，表明地參總?cè)扑嵩? h基本吸附完全。動力學(xué)方程（表7）顯示，準(zhǔn)二級速率方程特征系數(shù)更高（R2>0.9900），能描述AB-8型樹脂對地參總?cè)扑岬奈竭^程。
2. 5. 2 大孔樹脂吸附等溫線測定 地參總?cè)扑峤?jīng)AB-8型樹脂吸附的線性等溫線和吸附等溫曲線如圖3所示，Langmuir和Freundlich方程如表8所示。Langmuir和Freundlich吸附等溫曲線模型擬合回歸方程的R2均在0.9800以上，2種模型均能描述AB-8型樹脂對地參總?cè)扑岬奈阶饔?，且Freundlich方程的R2更高。KF和n分別為Freundlich方程的模型參數(shù)和特征常數(shù)，在方程中，n>1時(shí)表明該物質(zhì)易被吸附（Yildirim et al.，2001），本研究中n=3.1085>1，說明地參總?cè)扑嵋妆籄B-8型樹脂吸附。
2. 6 大孔樹脂動態(tài)吸附—解吸性能試驗(yàn)結(jié)果
2. 6. 1 大孔樹脂泄露曲線 由圖4可知，上樣液體積越大，流出的總?cè)扑釢舛戎饾u增加，當(dāng)上樣液體積小于55 mL時(shí)，總?cè)扑釢舛仍黾于厔菥徛笥?5 mL時(shí)，總?cè)扑釢舛仍黾于厔菝黠@。隨著上樣體積的繼續(xù)增加，AB-8型吸附逐漸趨于飽和，上樣體積大于85 mL流出的總?cè)扑釢舛冉咏诔跏紭右簼舛?。?dāng)上樣體積為45 mL時(shí)，流出液中的濃度達(dá)初始上樣液總?cè)扑釢舛鹊?0%，為大孔樹脂AB-8型的泄漏點(diǎn)，為保證樣品液不泄露，避免浪費(fèi)，上樣體積應(yīng)控制在40 mL最合適。
2. 6. 2 上樣濃度的選擇 由圖5可知，當(dāng)上樣濃度小于0.65 mg/mL時(shí)，地參總?cè)扑峒兓厥章食噬仙厔?，在上樣濃度?.65 mg/mL時(shí)總?cè)扑峒兓厥章蔬_(dá)最大值，上樣濃度超0.65 mg/mL后，回收率略有下降，說明濃度過高反而影響地參總?cè)扑岬募兓に?。因此，最佳上樣濃度?.65 mg/mL，選取0.60、0.65和0.70 mg/mL進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。
2. 6. 3 上樣流速的選擇 由圖6可知，上樣流速對地參總?cè)扑峒兓厥章视绊懨黠@，上樣流速過慢使得吸附時(shí)間長，從而影響總?cè)扑峒兓?，?dāng)上樣流速增至2 BV/h時(shí)吸附時(shí)間合適，對總?cè)扑岬募兓Ч罴?，地參總?cè)扑峒兓厥章蔬_(dá)最大值；隨著上樣流速的繼續(xù)增加，大孔樹脂層吸附萜類化合物時(shí)間短，吸附效果差。因此，最佳上樣流速為2 BV/h，選取1、2和3 BV/h進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。
2. 6. 4 洗脫濃度的選擇 由圖7可知，隨著洗脫濃度的增加，地參總?cè)扑峒兓厥章手饾u提高，在洗脫濃度為80%時(shí)總?cè)扑峄厥章蔬_(dá)最大值，顯著高于50%和60%的回收率（P<0.05，下同），當(dāng)洗脫濃度大于80%時(shí)，回收率呈下降趨勢，說明洗脫濃度越大對地參總?cè)扑岬募兓Ч胶?，但達(dá)一定濃度后效果下降。因此，選擇最佳洗脫濃度為80%，并選取70%、80%和90%進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。
2. 6. 5 洗脫流速的選擇 由圖8可知，洗脫流速對地參總?cè)扑峒兓厥章视忻黠@影響，當(dāng)洗脫流速為2 BV/h時(shí)，回收率達(dá)最大值；當(dāng)洗脫流速大于2 BV/h時(shí)，總?cè)扑峄厥章曙@著降低，說明流速過快對總?cè)扑岬南疵撔Ч絹碓讲?。因此，最佳洗脫流速? BV/h，選取1、2和3 BV/h進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。
2. 6. 6 大孔樹脂洗脫曲線 由圖9可知，隨著洗脫液體積增大，地參總?cè)扑釢舛炔粩嘣黾?，洗脫液體積對總?cè)扑岬南疵撔Ч忻黠@影響；當(dāng)洗脫液體積在65 mL時(shí)，總?cè)扑釢舛冗_(dá)最大值，當(dāng)洗脫液體積繼續(xù)增加，總?cè)扑釢舛瘸氏陆第厔?，直至洗脫液體積在100 mL時(shí)，總?cè)扑釢舛葹?.01 mg/mL，說明此時(shí)已將總?cè)扑岢煞窒疵撏戤?。因此，考慮洗脫液體積及總?cè)扑嵯疵撔Ч?，?0%乙醇100 mL可將地參總?cè)扑岢煞窒疵撏耆?/p>
2. 7 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果
2. 7. 1 響應(yīng)面模型的建立 單因素試驗(yàn)結(jié)果顯示，上樣濃度0.65 mg/mL、上樣流速2 BV/h、洗脫濃度80%和洗脫流速2 BV/h為最佳水平條件。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用4因素3水平、最佳水平條件為0水平的響應(yīng)面中心試驗(yàn)（表9），運(yùn)用Design-Expert 12進(jìn)行二次多項(xiàng)式擬合。以地參總?cè)扑峒兓厥章蕿轫憫?yīng)值（Y），由回歸模型可得回收率與4個(gè)變量（上樣濃度、上樣流速、洗脫濃度和洗脫流速）之間的線性關(guān)系，所得二次回歸方程：Y=0.6887+0.0196A-0.0085B-0.0287C+0.0052D+0.0299AB-0.0107AC-0.0122AD+0.0128BC+0.0211BD+0.026A2-0.0765B2-0.0877C2-0.0932D2。
2. 7. 2 顯著性檢驗(yàn) 由方差分析結(jié)果（表10）可知，模型F=33.10，P<0.01，為極顯著，失擬項(xiàng)F=1.22，P=0.4587>0.05，為不顯著，表明所選用的二次多項(xiàng)模型的擬合程度良好，模型成立。模型相關(guān)系數(shù)R2=0.9707，表明該回歸方程有很好的相關(guān)性，校正決定系數(shù)[R2Adj]=0.9414，表明有94.14%的響應(yīng)值變化。在影響地參總?cè)扑峒兓厥章实囊蛩刂?，A、C、AB、CD、A2、B2、C2和D2影響極顯著（P<0.01，下同），BD影響顯著，而B、D、AC、AD和BC影響不顯著（P>0.05，下同）。選取的4個(gè)因素對地參總?cè)扑峒兓厥章视绊戫樞驗(yàn)镃>A>B>D，即洗脫濃度對地參總?cè)扑峒兓厥章实挠绊懽畲?，洗脫流速的影響最小?/p>
2. 8 兩因素間交互作用分析結(jié)果
由圖10可知，當(dāng)上樣流速不變時(shí)，隨著上樣濃度的增加，地參總?cè)扑岬幕厥章手饾u增大，當(dāng)上樣濃度為0.65 mg/mL時(shí)，回收率達(dá)峰值；上樣濃度繼續(xù)增加，回收率逐漸減小。等高線的橢圓度較大，說明上樣流速與上樣濃度的交互作用對地參總?cè)扑峄厥章视绊憳O顯著，與方差分析結(jié)果（表10）一致。
由圖11可知，當(dāng)洗脫濃度不變時(shí)，隨著上樣濃度的增加，地參總?cè)扑岬幕厥章手饾u增大，當(dāng)上樣濃度為0.65 mg/mL時(shí)，回收率達(dá)最大值；之后繼續(xù)增加上樣濃度，回收率則逐漸減小。同時(shí)，當(dāng)上樣濃度不變時(shí)，隨著洗脫濃度的增加，地參總?cè)扑岬幕厥章手饾u增大，當(dāng)洗脫濃度為80%時(shí)，回收率達(dá)峰值；隨著洗脫濃度繼續(xù)增大，回收率逐漸減小。等高線趨近于圓形，說明洗脫濃度與上樣濃度的交互作用對地參總?cè)扑峄厥章实挠绊懖伙@著，與方差分析結(jié)果（表10）一致。
由圖12可知，當(dāng)洗脫流速不變時(shí)，隨著上樣濃度的增加，地參總?cè)扑岬幕厥章手饾u增大，當(dāng)上樣濃度為0.65 mg/mL時(shí)，回收率達(dá)峰值；隨著上樣濃度的不斷增加，回收率則逐漸減小。同時(shí)，當(dāng)上樣濃度不變時(shí)，隨著洗脫流速的增加，地參總?cè)扑岬幕厥章手饾u增大，當(dāng)洗脫流速為2 BV/h時(shí)，回收率達(dá)峰值；隨著洗脫流速的繼續(xù)增加，回收率逐漸減小。等高線趨近于圓形，說明洗脫流速與上樣濃度的交互作用對地參總?cè)扑峄厥章实挠绊懖伙@著，與方差分析結(jié)果（表10）一致。
由圖13可知，當(dāng)洗脫濃度不變時(shí)，隨著上樣流速的增加，地參總?cè)扑岬幕厥章手饾u增大，當(dāng)上樣流速為2 BV/h時(shí)，回收率達(dá)峰值；之后隨著上樣流速的繼續(xù)增加，回收率則逐漸減小。同時(shí)，當(dāng)上樣流速不變時(shí)，隨著洗脫濃度的增加，地參總?cè)扑岬幕厥章手饾u增大，當(dāng)洗脫濃度為80%時(shí)，回收率達(dá)峰值；隨著洗脫濃度的繼續(xù)增加，回收率則逐漸減小。等高線趨近于圓形，說明洗脫濃度與上樣流速的交互作用對地參總?cè)扑峄厥章实挠绊懖伙@著，與方差分析結(jié)果（表10）一致。
由圖14可知，當(dāng)洗脫流速不變時(shí)，隨著上樣流速的增加，地參總?cè)扑岬幕厥章手饾u增大，當(dāng)上樣流速為2 BV/h時(shí)，回收率達(dá)峰值；之后隨著上樣流速的不斷增加，回收率逐漸減小。同時(shí)，當(dāng)上樣流速不變時(shí)，隨著洗脫流速的增加，地參總?cè)扑岬幕厥章手饾u增大，當(dāng)洗脫流速為2 BV/h時(shí)，回收率達(dá)峰值；隨著洗脫流速的繼續(xù)增大，回收率則逐漸減小。等高線趨近于橢圓，說明洗脫流速與上樣流速的交互作用對地參總?cè)扑峄厥章实挠绊戯@著，與方差分析結(jié)果（表10）一致。
由圖15可知，當(dāng)洗脫流速不變時(shí)，隨著洗脫濃度的增加，地參總?cè)扑岬幕厥章手饾u增大，當(dāng)洗脫濃度為80%時(shí)，回收率達(dá)峰值；之后隨著洗脫濃度的繼續(xù)增加，回收率逐漸減小。同時(shí)，當(dāng)洗脫濃度不變時(shí)，隨著洗脫流速的增加，地參總?cè)扑岬幕厥章手饾u增大，當(dāng)洗脫流速為2 BV/h時(shí)，回收率達(dá)峰值；之后隨著洗脫流速的繼續(xù)增大，回收率則逐漸減小。等高線的橢圓度較大，說明洗脫流速與洗脫濃度的交互作用對地參總?cè)扑峄厥章实挠绊憳O顯著，與方差分析結(jié)果（表10）一致。
響應(yīng)面圖可直觀反映出兩因素對地參總?cè)扑峒兓厥章市Ч挠绊?。由圖10～圖15可知，圖10和圖15等高線中的橢圓度大，坡度較陡，說明兩因素間的交互作用明顯，達(dá)極顯著水平；圖14等高線中的橢圓程度較大，兩因素間交互作用相對較弱，達(dá)顯著水平。圖11～圖13中，固定一個(gè)因素，地參總?cè)扑峄厥章示S著另一個(gè)因素的增大而減小，等高線趨近于圓形，從而表明兩因素間交互作用不明顯，與方差分析結(jié)果（表10）一致。通過Design-Expert 12的模型模擬，預(yù)測選取的4因素最佳組合：上樣濃度0.66 mg/mL、上樣流速1.97 BV/h、洗脫濃度78.34%、洗脫流速1.99 BV/h，地參總?cè)扑岬幕厥章蕿?9.30%。
2. 9 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果
取地參總?cè)扑釢饪s液3份各10.0 mL，在模型擬合適宜試驗(yàn)操作的條件（上樣濃度0.66 mg/mL、上樣流速2 BV/h、洗脫濃度80%、洗脫流速2 BV/h）下，驗(yàn)證響應(yīng)面法所得最佳純化工藝可實(shí)施性，收集洗脫液，測得地參總?cè)扑峒兓幕厥章史謩e為66.94%、67.31%和67.85%，平均回收率為67.37%，RSD為0.67%，表明AB-8型樹脂純化地參總?cè)扑岬膬?yōu)化工藝可行。
3 討論
3. 1 顯色條件分析
紫外分光光度法是分析檢測常用的方法，常以香草醛—高氯酸分光光度法對總?cè)祁惡窟M(jìn)行測定（李崇陽，2016），影響該測定方法的因素較多，顯色條件的優(yōu)化能更好地測定不同物種資源的萜類成分含量。在強(qiáng)酸條件下，可將萜類化合物結(jié)構(gòu)成分氧化為羧基，形成共軛體系而顯色，進(jìn)而對萜類含量進(jìn)行分析測定。本研究中，地參總?cè)扑嵩?45 nm處有最大吸收峰，通過不同顯色條件的篩選，進(jìn)而可得5%香草醛—冰乙酸和高氯酸的最佳加入量及顯色溫度。根據(jù)方法學(xué)中穩(wěn)定性檢測結(jié)果可得比色法對地參總?cè)扑岬臋z測在40 min內(nèi)較穩(wěn)定，對地參總?cè)扑岬臏y定效果較好。由于比色法操作簡便，因而作為測定總?cè)扑岬某Ｓ梅椒?，但試劑用量、試?yàn)操作時(shí)的反應(yīng)時(shí)間及反應(yīng)溫度等因素均對總?cè)扑岬臏y定影響較顯著，因此在優(yōu)化顯色條件中，分別對5%香草醛—冰乙酸用量、高氯酸用量、顯色試劑和顯色溫度進(jìn)行優(yōu)化，得到5%香草醛—冰乙酸用量在0.2 mL時(shí)最合適，高氯酸用量為0.4 mL合適，5%香草醛—冰乙酸與高氯酸加入量比例為1∶2，與陶鋒等（2011）分離純化連錢草總?cè)扑嶂酗@色條件比例相同；60 ℃顯色溫度下總?cè)扑岬臏y定效果好，所得最優(yōu)顯色溫度與韓偉和劉曦（2014）在枇杷葉總?cè)扑岬拇罂讟渲蛛x純化工藝中顯色條件相同。由結(jié)果可知，地參總?cè)扑峥刹捎?%香草醛—高氯酸分光光度法進(jìn)行測定，該操作可行，可為地參總?cè)扑岬南嚓P(guān)研究提供質(zhì)量控制技術(shù)。
3. 2 大孔樹脂選擇分析
大孔樹脂現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于天然植物中活性成分的分離純化。根據(jù)不同樹脂極性性質(zhì)可分為非極性、中性和極性3類，不同樹脂型號的極性不同，吸附性能有明顯差異，因樹脂易再生、吸附富集效果好等優(yōu)點(diǎn)在萜類化合物的純化中應(yīng)用較多，且樹脂對生物活性成分純化可最大限度地提高目標(biāo)物的回收率（白奪龍和楊開華，2007；李廣林，2014；王曉婷等，2022）。樹脂吸附原理是靠化合物分子之間的化學(xué)作用力，為達(dá)到純化、分離等目的可通過合適的溶劑將目標(biāo)化合物洗脫出來。非極性或弱極性吸附樹脂表面的疏水性強(qiáng)，由不帶任何功能基團(tuán)的單體聚合而成，有助于極性溶劑中非極性物質(zhì)的吸附。本研究選取的AB-8、D101、HPD600、DA201和S-8型樹脂具有不同極性，以吸附量、吸附率和解吸率作為評價(jià)地參總?cè)扑峒兓Ч闹笜?biāo)，對5種樹脂進(jìn)行篩選。因萜類成分是非極性化合物，非極性或弱極性樹脂能很好地將地參總?cè)扑岢煞窒疵撓聛?。AB-8和D101型樹脂均為非極性樹脂，地參中的總?cè)扑崴械奈瀛h(huán)三萜類（白樺脂酸、熊果酸和齊墩果酸）分子量較大，AB-8型樹脂的孔徑在480～520 nm，大于D101型樹脂的孔徑，能較好地吸附總?cè)扑岢煞?，達(dá)到純化效果。本研究結(jié)果表明，AB-8型樹脂與D101型樹脂對地參中的總?cè)扑岢煞治叫Ч?，其中AB-8型綜合指標(biāo)更優(yōu)，與李廣林（2014）對樺褐孔菌三萜提取分離試驗(yàn)結(jié)果類似。此外，還考察樹脂的性能，包括樹脂的靜態(tài)吸附動力學(xué)和等溫曲線；根據(jù)動力學(xué)方程得出準(zhǔn)二級速率方程能更好地展示樹脂的吸附過程，由動力學(xué)曲線可知AB-8型樹脂在6 h已接近飽和的吸附狀態(tài)。蔡天嬌（2017）篩選所得D101型樹脂純化紅棗三萜酸效果優(yōu)于AB-8型樹脂，本研究與之對比，說明不同物種資源中同種生物活性成分的樹脂選擇及吸附能力均有一定差異；將等溫曲線進(jìn)行Freundlich方程擬合，得到特征常數(shù)n>1，說明地參總?cè)扑嵋妆籄B-8型樹脂吸附，吸附效果明顯。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果可得，AB-8型樹脂吸附地參總?cè)扑岬姆椒煽?，可為樹脂大批量純化地參總?cè)扑崽峁?shù)據(jù)支撐。
3. 3 純化工藝分析
藥食同源植物中生物活性成分的研究有助于功能性食品資源的開發(fā)利用。地參作為菜藥兼?zhèn)涞闹参镔Y源，不僅營養(yǎng)豐富，還含有多種藥理活性成分，其中總?cè)扑崾撬幚砘钚猿煞种?。由于地參中成分?fù)雜多樣，對目標(biāo)化合物的提取會受到其他化合物成分的影響，有效成分的分離純化可為后續(xù)該化合物的成分鑒定及體內(nèi)體外功能研究打下重要基礎(chǔ)。本研究利用響應(yīng)面模型優(yōu)化上樣濃度、上樣流速、洗脫濃度和洗脫流速4個(gè)因素的工藝條件，采用最佳工藝優(yōu)化出的因素參數(shù)對地參總?cè)扑徇M(jìn)行純化，回收率可達(dá)66.00%以上。陳建中等（2015）采用響應(yīng)面法純化茼蒿中總黃酮，通過D101型樹脂測得黃酮回收率為87.36%，其上樣濃度達(dá)0.86 mg/mL，濃度差異可能會影響目標(biāo)產(chǎn)物的回收率；純化工藝優(yōu)化參數(shù)中的洗脫流速與陳建中等（2015）對茼蒿總黃酮分離純化的洗脫流速類似，均在2 mL/min左右。劉娜（2017）對澤蘭地上部分的總?cè)扑岢煞诌M(jìn)行分離純化，得出X-5型樹脂的純化效果最佳，總?cè)扑岬募兌瓤蛇_(dá)74%；本研究對澤蘭地下部分（地參）進(jìn)行分離純化，因澤蘭地上部分總?cè)扑岷考s為地下部分的3倍，所得純化的效果均有一定差異，說明樹脂對萜類純化效果顯著，能極大提高目標(biāo)化合物的純度。鄧思節(jié)（2016）對屈曲花種子總黃酮純化工藝進(jìn)行優(yōu)化，并分析其抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)純化后的總黃酮抗氧化活性高于粗提總黃酮，說明純化物的抗氧化活性更強(qiáng)。不同物種資源的不同化合物采用大孔樹脂純化效果不盡相同，因而對地參總?cè)扑針渲M(jìn)行純化工藝優(yōu)化很有必要。地參總?cè)扑嵩谏蠘訚舛?.66 mg/mL、上樣流速2 BV/h、洗脫濃度80%、洗脫流速2 BV/h時(shí)純化效果最佳，與蒙瑞波等（2012）提取純化白花蛇舌草中總?cè)扑岬纳蠘恿魉?、洗脫流速及洗脫濃度?yōu)化條件結(jié)果相同，說明該優(yōu)化條件穩(wěn)定可行、重復(fù)性好。本研究僅對地參總?cè)扑峄钚猿煞诌M(jìn)行純化，所得的目標(biāo)產(chǎn)物為多種萜類成分共存，需進(jìn)一步分離以測定地參中總?cè)扑岬膯误w成分，從而能進(jìn)一步證明樹脂純化地參總?cè)扑岬男Ч?/p>
4 結(jié)論
建立的回歸模型可用于地參總?cè)扑峒兓に嚨念A(yù)測；AB-8型大孔樹脂對地參總?cè)扑岬姆蛛x純化效果較好，適用于總?cè)扑嵛镔|(zhì)的純化。
參考文獻(xiàn)：
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（責(zé)任編輯 羅 麗）
收稿日期：2022-09-09
基金項(xiàng)目：重慶市自然科學(xué)基金項(xiàng)目（cstc2019jcyj-msxmX0770）；重慶市教委科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（KJQN202201231，KJQN202002712）
通訊作者：周濃（1978-），https：//orcid.org/0000-0003-1236-8585，教授，主要從事中藥炮制與資源研究工作，E-mail：erhaizn@126.com
第一作者：李金金（1995-），https：//orcid.org/0000-0002-6663-4044，研究方向?yàn)樗幨惩粗参镔Y源開發(fā)及利用，E-mail：ljjlbh1995 @163.com
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李金金 葉明燕 姚歡 吳應(yīng)梅 周濃
DOI：10.3969/j.issn.2095-1191.2023.06.011
摘要：【目的】建立響應(yīng)面模型優(yōu)化合適樹脂下地參總?cè)扑岬募兓に?，為研究地參總?cè)扑峄钚蕴峁┘夹g(shù)參考。【方法】運(yùn)用Box-Behnken設(shè)計(jì)方法，采用大孔樹脂吸附純化地參總?cè)扑?，以吸附率和解吸率為指?biāo)，測定5種大孔樹脂（AB-8、D101、HPD600、DA201和S-8型）對地參總?cè)扑岬募兓Ч?。以上樣濃度、上樣流速、洗脫濃度和洗脫流速為自變量，回收率為因變量，運(yùn)用響應(yīng)面法優(yōu)化地參總?cè)扑峒兓に噮?shù)?！窘Y(jié)果】最佳顯色條件：顯色溫度60℃，5%香草醛—冰乙酸0.2 mL，高氯酸0.4 mL，檢測波長545 nm。AB-8型樹脂對地參總?cè)扑岬奈胶徒馕Ч罴眩馕蕿?8.61%，吸附率為70.54%。上樣體積在40 mL，80%乙醇100 mL為最佳洗脫體積。建立的回歸方程：Y=0.6887+0.0196A-0.0085B-0.0287C+0.0052D+0.0299AB-0.0107AC-0.0122AD+0.0128BC+0.0211BD+0.026A2-0.0765B2-0.0877C2-0.0932D2（A為上樣濃度，B為上樣流速，C為洗脫濃度，D為洗脫流速，Y為總?cè)扑峄厥章剩?。由Box-Behnken方差分析結(jié)果可得，上樣濃度和洗脫濃度2個(gè)因素，以及上樣濃度與上樣流速的交互作用、洗脫濃度與洗脫流速的交互作用對地參總?cè)扑峄厥章视绊憳O顯著（P<0.01），上樣流速與洗脫流速的交互作用對總?cè)扑峄厥章视绊戯@著（P<0.05），4個(gè)因素對地參總?cè)扑峄厥章视绊戫樞驗(yàn)橄疵摑舛?gt;上樣濃度>上樣流速>洗脫流速。優(yōu)化后的地參總?cè)扑峒兓に嚕荷蠘訚舛?.66 mg/mL、上樣流速2 BV/h、洗脫濃度80%、洗脫流速2 BV/h，在此條件下，總?cè)扑崞骄厥章蕿?7.37%?！窘Y(jié)論】建立的回歸模型可用于地參總?cè)扑峒兓に嚨念A(yù)測；AB-8型大孔樹脂對地參總?cè)扑岬姆蛛x純化效果較好，適用于總?cè)扑嵛镔|(zhì)的純化。
關(guān)鍵詞：地參；總?cè)扑幔淮罂讟渲?；純化工藝；響?yīng)面法
中圖分類號：S567.239? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：2095-1191（2023）06-1697-14
Purification process of total triterpenic acids from Lycopus lucidus Turcz. by Box-Behnken design-response surface methodology
LI Jin-jin1，2， YE Ming-yan1，2， YAO Huan1，2， WU Ying-mei1， ZHOU Nong1，2*
（1College of Biological and Food Engineering，Chongqing Three Gorges University，Chongqing? 404120，China；
2Chongqing Engineering Laboratory for Green Planting and Deep Processing of Genuine Medicinal Materials in
Three Gorges Reservoir Area，Chongqing 404120，China）
Abstract：【Objective】A response surface model was established to optimize the purification process of total triterpenic acids from Lycopus lucidus Turcz. with suitable resin，so as to provide technical reference for further study on the activity of total triterpenic acids from L. lucidus. 【Method】Using the Box-Behnken design method， the total triterpenic acids of L. lucidus was purified by macroporous resin adsorption. The purification effects of macroporous resins （AB-8 type， D101 type， HPD600 type， DA201 type and S-8 type） on total triterpenic acids of L. lucidus were determined by using the adsorption rate and desorption rate as indexes. The sample concentration，sample loading speed， eluent concentration and eluentvelocity were the independent variables， and recovery rate was the dependent variable. The purification process parameters of total triterpenic acids from L. lucidus were optimized by response surface methodology. 【Result】Optimum color development conditions were： color development temperature of 60 ℃， 5% vanillin-glacial acetic acid of 0.2 mL， perchloric acid of 0.4 mL， and detection wavelength of 545 nm. The results showed that AB-8 type macroporous resin had the best adsorption and desorption effectsontotal triterpenic acids of L. lucidus， withthe desorption rate of 88.61% and the adsorption rate of 70.54%. The loading volume was 40 mL， and 80% ethanol 100 mL was the best eluent volume. A regression equation was set up：Y=0.6887+0.0196A-0.0085B-0.0287C+0.0052D+0.0299AB-0.0107AC-0.0122AD+0.0128BC+0.0211BD+0.026A2-0.0765B2-0.0877C2-0.0932D2（A：sample concentration，B：sample loading speed，C：eluent concentration，D：eluent velocity，Y：recovery rate of total triterpenic acids）. According to Box-Behnken variance analysis，sample concentration， eluent concentration，the interaction between sample concentration and sample loading speed，and the interac-tion between eluent concentration and eluent velocity had extremely significant effects on the recovery rate of total triterpenic acids from L. lucidus（P<0.01）， while the interaction between sample loading speed and eluent velocity had significant effects on the recovery rate of total triterpenic acids from L. lucidus（P<0.05）. The four single factors affected the recovery rate of total triterpenic acids of L. lucidus in the order of eluent concentration>sample concentration>sample loading speed>eluent velocity from L. lucidus. The optimized purification process for total triterpenic acids of L. lucidus was： sample concentration of 0.66 mg/mL， sample loading speed of 2 BV/h， eluent concentration of 80% and from L. lucidus of 2 BV/h. Under these conditions， the average recovery rate of total triterpenic acids was 67.37%. 【Conclusion】The established regression model can be used to predict the purification process of total triterpenic acids from L. lucidus； the AB-8 type macroporous resin has a relatively good effect on the separation and purification of total triterpenic acids from L. lucidus， which is suitable for the purification of total triterpenic acids.
Key words： Lycopus lucidus Turcz.； total triterpenic acids； macroporous resin； purification process； response surface methodology
Foundation items：Chongqing Natural Science Foundation（cstc2019jcyj-msxmX0770）；Science and Technology Research Project of Chongqing Education Commission（KJQN202201231， KJQN202002712）
0 引言
【研究意義】地參（Lycopus lucidus Turcz.）又名澤蘭，是一年生草本唇形科植物，以地下部分入藥，多分布于我國東北、西北及西南地區(qū)。其野生資源環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)，不僅生命力頑強(qiáng)，蟲害也極易防治，栽種資源豐富（羅孟禹和董開居，2006）。總?cè)扑嵋蚓哂锌鼓[瘤、抗炎、調(diào)節(jié)血糖血脂和提高免疫力等功效而受到大眾的關(guān)注（Fukushima et al.，2006；Zhu et al.，2016；Biswas and Dwivedi，2019），但總?cè)扑犷愇镔|(zhì)在動植物體內(nèi)含量較少，且存在形態(tài)復(fù)雜，對植物資源中總?cè)扑徇M(jìn)行提取分離純化是使其發(fā)揮更好功效的必要前提。采用醇提法對地參總?cè)扑岢醪教崛?，所得總?cè)扑岢煞譃榇痔嵛铩Ｓ捎诖痔嵛镏锌側(cè)扑峒兌容^低，地參中成分復(fù)雜，其中含有總?cè)扑?、多糖、多酚和黃酮等生物活性成分，且提取液中多糖成分較多，不易儲存（許泳吉等，2003；Lu et al.，2015），因而純化地參粗提液尤為重要?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前純化三萜酸最常見的方法是大孔樹脂吸附法（姚干等，2007；劉娜，2016），不同極性的樹脂對不同種類化合物的選擇性有所不同。杜暉和王春雨（2007）研究表明X-5型樹脂能有效富集純化夏枯草中2種五環(huán)三萜酸成分，產(chǎn)品中目標(biāo)組分的純度和回收率較高，工藝流程簡單易行；袁懷波等（2007，2008）采用大孔樹脂對山楂和木瓜提取液進(jìn)行分離純化，在上樣pH為6、洗脫液70%的條件下洗脫出山楂和木瓜總?cè)扑峒兓?，產(chǎn)品的純度遠(yuǎn)高于粗提液；樊君等（2008）利用大孔吸附樹脂對棗渣中三萜酸進(jìn)行分離純化，其回收率在65%以上，純度也達(dá)80%以上；桑詠梅和丁振鐸（2011）通過D101型樹脂檢測中藥復(fù)方金匱腎氣丸中總?cè)祁惓煞郑謩e對總?cè)扑釂误w及總?cè)扑岬奈叫阅芎拖疵搮?shù)進(jìn)行優(yōu)化，進(jìn)而證明樹脂能有效吸附和解吸總?cè)扑釂误w和總?cè)扑?；梁卓然?021）對女貞果實(shí)中齊墩果酸進(jìn)行提取，采用HPD300型樹脂純化后，其齊墩果酸含量可達(dá)86.53%，經(jīng)高效液相色譜（HPLC）檢測，分離純化后齊墩果酸能與雜質(zhì)有效分離。研究報(bào)道，非極性或弱性的樹脂可用于分離總?cè)扑?，AB-8型樹脂適用于黃酮、生物堿和多糖類等物質(zhì)的提取分離和純化（諶江城等，2014；閔玉濤等，2015）。蒙瑞波等（2012）利用AB-8型樹脂對白花蛇舌草中總?cè)扑徇M(jìn)行提取純化，其純化參數(shù)為上樣流速2 BV/h、洗脫流速2 BV/h、洗脫乙醇體積分?jǐn)?shù)80%，在該條件下，總?cè)扑岬募兌瓤商嵘?倍，說明AB-8型樹脂對總?cè)扑崽崛⌒Ч麡O大提高；王苗苗等（2020）采用AB-8型樹脂富集羅漢果莖中三萜酸，經(jīng)大孔樹脂富集后三萜酸含量明顯增加；柯春山等（2021）篩選出AB-8型樹脂為純化裸花紫珠的最適樹脂，純化后溶液由渾濁變?yōu)槌吻??！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】大孔吸附樹脂用于中藥材有效成分的篩選也有明顯效果（黃燕秋等，2018）。劉娜（2016）對比多種型號樹脂對澤蘭地上部分分離純化的效果，其中AB-8型樹脂對澤蘭地上部分純化的吸附量、解吸率和吸附率分別為11.82 mg/g、81.82%和55.47%。但目前針對澤蘭地下部分中總?cè)扑岢煞旨兓难芯繄?bào)道少有，尤其是利用大孔吸附樹脂進(jìn)行純化?！緮M解決的關(guān)鍵問題】對地參總?cè)扑犸@色條件及純化工藝進(jìn)行優(yōu)化，篩選出最佳顯色條件及最優(yōu)樹脂，再以最優(yōu)大孔樹脂對地參總?cè)扑岽痔嵛镞M(jìn)行純化，以回收率為考察指標(biāo)，運(yùn)用響應(yīng)面模型優(yōu)化純化工藝參數(shù)，為研究地參總?cè)扑峄钚蕴峁┘夹g(shù)參考。
1 材料與方法
1. 1 試驗(yàn)材料
地參產(chǎn)自重慶市萬州區(qū)（人工栽培），由重慶三峽學(xué)院生物與食品工程學(xué)院周濃教授鑒定為地參，在自然條件下烘干，粉碎后過100目篩備用。熊果酸對照品（批號DST180606-019，HPLC≥98%）購自成都德思特生物技術(shù)有限公司；無水乙醇（AR）購自重慶川東化工（集團(tuán)）有限公司；香草醛（香蘭素）（AR）、冰乙酸（AR）和高氯酸（AR）購自成都市科隆化學(xué)品有限公司；S-8型樹脂購自上海吉至生化科技有限公司；AB-8型樹脂購自上海麥克林生化科技股份有限公司；D101型、HPD600型和DA201型樹脂購自鄭州和成新材料科技有限公司。主要儀器設(shè)備：高速多功能粉碎機(jī)（浙江省永康市金穗機(jī)械制造廠）、玻璃砂芯層析柱（三維實(shí)驗(yàn)室玻璃儀器公司）、A2004型電子天平（上海津平科學(xué)儀器有限公司）、精密天平（METTLER YOLEDO集團(tuán)）、HSY-26型數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司）、BUCHI R-300旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（北京海富達(dá)科技有限公司）和V-1100D型可見分光光度計(jì)（上海美譜達(dá)儀器有限公司）。
1. 2 試驗(yàn)方法
1. 2. 1 樣品溶液制備 稱取地參1.000±0.002 g置于錐形瓶中，平行3次，醇提法提取，過濾，濃縮，以乙醇溶液定容至5 mL，移取0.1 mL稀釋至50 mL，搖勻后測定吸光值，重復(fù)3次取平均值。
1. 2. 2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 稱取減壓干燥至恒重的對照品適量，加乙醇溶解并制成濃度為0.0985 g/mL的對照品溶液。取對照品溶液1.0 mL，用乙醇定容至500 mL，逐級稀釋；再分別精密吸取對照品溶液0.1、0.3、0.5、0.7和0.9 mL，測定其吸光值。以對照品溶液濃度為橫坐標(biāo)、吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
1. 3 檢測波長測定及顯色條件優(yōu)化
1. 3. 1 檢測波長確定 精密移取對照品溶液和供試品溶液，置于試管中揮干水分，加入配制的5%香草醛—冰乙酸0.4 mL和高氯酸0.5 mL，置于水浴鍋中恒溫加熱15 min，冷卻后加入冰乙酸3.0 mL，搖勻，待測。以空白及無水乙醇為對照組，采用紫外分光光度計(jì)在200～800 nm處全波長掃描，對照品及樣品溶液均在545 nm處有最大吸收，因此在檢測波長545 nm處測定總?cè)扑峥偭俊?/p>
1. 3. 2 5%香草醛—冰乙酸用量 移取已配制對照品溶液0.5 mL，平行5份，依次加入5%香草醛—冰乙酸溶液0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mL，加入高氯酸溶液0.4 mL，然后加入3.0 mL冰乙酸，按1.3.1方法測定其吸光值。
1. 3. 3 高氯酸用量 移取已配制對照品溶液0.5 mL，平行5份，加入5%香草醛—冰乙酸溶液0.4 mL，依次加入高氯酸0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mL，然后加入3.0 mL冰乙酸，按1.3.1方法測定其吸光值。
1. 3. 4 顯色溫度 顯色劑：移取5%香草醛—冰乙酸溶液0.2 mL，高氯酸0.4 mL，依次置于40、50、60、70和80 ℃水浴鍋中恒溫加熱15 min，然后加入冰乙酸3.0 mL，按1.3.1方法測定其吸光值。顯色劑+對照品：移取已配制對照品溶液0.5 mL，加入5%香草醛—冰乙酸溶液0.2 mL，高氯酸0.4 mL，依次置于40、50、60、70和80 ℃水浴鍋中恒溫加熱15 min，然后加入冰乙酸3.0 mL，按1.3.1方法測定其吸光值。
1. 4 方法學(xué)考察
1. 4. 1 精密度試驗(yàn) 取對照品溶液0.5 mL，平行6份，按1.3.1方法測定吸光值，并計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。
1. 4. 2 重復(fù)性試驗(yàn) 取樣品溶液6份，按1.3.1方法測定吸光值，并計(jì)算RSD。
1. 4. 3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取樣品溶液0.5 mL，每隔10 min測定一次吸光值，按1.3.1方法測定吸光值，并計(jì)算RSD。
1. 4. 4 加樣回收試驗(yàn) 精密移取重復(fù)性考察中供試品溶液6份，每份溶液0.2 mL，再加入0.2 mL已知含量的對照品溶液，按1.3.1方法測定吸光值，并計(jì)算加樣回收率及其RSD。
1. 5 大孔樹脂純化工藝
1. 5. 1 大孔樹脂預(yù)處理 稱量一定質(zhì)量的樹脂，取96%乙醇浸泡24 h，去除樹脂的雜質(zhì)和不完整碎片，使樹脂充分溶脹，采用濕法裝柱，用96%乙醇反復(fù)沖洗至流出液不產(chǎn)生渾濁，再用蒸餾水洗至無醇味以平衡柱子，柱子中樹脂排列均勻、無氣泡，即預(yù)處理完成，備用。
1. 5. 2 大孔樹脂篩選 測定吸附率和解吸率，以篩選大孔樹脂。靜態(tài)飽和吸附率測定：分別選擇預(yù)處理過的AB-8、D101、HPD600、DA201和S-8型樹脂適量（相當(dāng)于干重2 g）置于錐形瓶中，加入精密移取的10.0 mL地參總?cè)扑釢饪s液（0.7282 mg/mL），在搖床中150 r/min常溫振蕩24 h，至吸附平衡，過濾，所得濾液測定其吸光值A(chǔ)1，計(jì)算可得總?cè)扑釢舛群蜆渲柡臀铰省?/p>
解吸率測定：將充分吸附飽和的樹脂吸干表面水分，置于錐形瓶中，加入無水乙醇在搖床中150 r/min常溫振蕩24 h，測定其吸光值A(chǔ)2，計(jì)算可得解吸液中總?cè)扑釢舛群拖疵撘航馕省?/p>
吸附量=（C0-C1）V/M
吸附率（%）=（C0-C1）/C0×100
解吸率（%）=C2/（C0-C1）×100
回收率（%）=C2/C0×100
式中，M為樹脂質(zhì)量（mg），V為吸附液體積（mg/L），C0為吸附液中總?cè)扑釢舛龋╩g/mL），C1為吸附后溶液總?cè)扑釢舛龋╩g/mL），C2為解吸液中總?cè)扑釢舛龋╩g/mL）。
1. 6 大孔樹脂靜態(tài)吸附動力學(xué)研究
1. 6. 1 靜態(tài)吸附動力學(xué)研究 對大孔樹脂的靜態(tài)吸附能力進(jìn)行考察，以吸附時(shí)間為橫坐標(biāo)、吸附量為縱坐標(biāo)，繪制靜態(tài)吸附曲線。在室溫條件下，稱量預(yù)處理的AB-8型大孔樹脂適量，置于100 mL錐形瓶中，精密移取地參總?cè)扑崽崛∫海?.7282 mg/mL），置于150 r/min搖床中，振蕩以測定大孔樹脂的靜態(tài)吸附能力。以接觸零時(shí)刻開始，每隔60 min取出樣液測定1次總?cè)扑岷浚?jì)算樹脂吸附量，繪制靜態(tài)吸附曲線。采用準(zhǔn)一級速率方程和準(zhǔn)二級速率方程2個(gè)動力學(xué)模型模擬吸附過程，進(jìn)一步分析AB-8型樹脂對地參總?cè)扑岬奈剿俾是闆r。
準(zhǔn)一級速率方程：ln（Qe-Qt）=lnQe+K1t
準(zhǔn)二級速率方程：t/Qt=1/K2Qe+t/Qe
式中，t為吸附時(shí)間（min），Qt為t時(shí)刻樹脂吸附量（mg/g），Qe為平衡時(shí)樹脂吸附量（mg/g），K1和K2分別為準(zhǔn)一級速率方程速率常數(shù)和準(zhǔn)二級速率方程速率常數(shù)（min-1）。
1. 6. 2 吸附等溫線測定 配制不同濃度的總?cè)扑崽崛∫?，在室溫條件下，150 r/min搖床振蕩24 h后測定樣液中總?cè)扑釢舛龋?jì)算不同濃度樣液的吸附量。以樣液濃度為橫坐標(biāo)、吸附量為縱坐標(biāo)，繪制樹脂吸附地參總?cè)扑岬牡葴厍€。等溫線的擬合能進(jìn)一步了解樹脂對地參總?cè)扑岬奈椒绞?，因而選擇Langmuir和Freundlich 2種等溫吸附方程線性擬合等溫線模型。
Ce/Qe=Ce/Qm+1/KLQm
lnQe=lnKF+1/nlnCe
式中，Ce為溶液平衡時(shí)的濃度（mg/mL），Qe為平衡吸附量（mg/g），Qm為飽和吸附量（mg/g），KL為Langmuir方程常數(shù)（L/mg），n和KF為Freundlich方程常數(shù)，其中KF的單位為L/mg。
1. 7 大孔樹脂動態(tài)吸附—解吸性能試驗(yàn)
1. 7. 1 大孔樹脂上樣液泄露曲線 量取預(yù)處理的AB-8型樹脂適量進(jìn)行動態(tài)吸附，濕法裝柱，用已知濃度的地參總?cè)扑崛芤海?.7282 mg/mL）上柱，流速1 BV/h，分段收集流出液，每份5 mL，收集30份流出液。以收集管吸附液編號為橫坐標(biāo)、總?cè)扑岷繛榭v坐標(biāo)，繪制總?cè)扑嵘蠘右盒孤肚€。
1. 7. 2 上樣濃度選擇 取已測濃度的地參總?cè)扑崛芤?，分別加水稀釋成0.50、0.55、0.60、0.65和0.70 mg/mL不同濃度梯度進(jìn)行上柱，靜止1 h，依次用80%乙醇進(jìn)行洗脫，控制流速為1 BV/h，收集洗脫液，測定總?cè)扑嵛庵?，確定最佳上樣濃度。
1. 7. 3 上樣流速選擇 取已測濃度的地參總?cè)扑崛芤?，分別以1、2、3、4和5 BV/h流速上柱，靜止1 h，依次用80%乙醇進(jìn)行洗脫，控制流速為1 BV/h，收集洗脫液，測定總?cè)扑岷?，確定最佳上樣流速。
1. 7. 4 大孔樹脂洗脫曲線 量取預(yù)處理的AB-8型樹脂適量進(jìn)行動態(tài)洗脫，濕法裝柱，以已測濃度的地參總?cè)扑崛芤荷现?，流速? BV/h進(jìn)行動態(tài)吸附，待樹脂吸附平衡后，用80%乙醇進(jìn)行洗脫，分段收集洗脫液，每份5 mL，收集30份流出液。以收集管洗脫液編號為橫坐標(biāo)、總?cè)扑岷繛榭v坐標(biāo)，繪制洗脫曲線。
1. 7. 5 洗脫濃度選擇 取已測濃度的地參總?cè)扑崛芤簼穹ㄑb柱，用蒸餾水洗滌平衡，待樹脂吸附至平衡后，用50%、60%、70%、80%和90%乙醇進(jìn)行洗脫，控制洗脫流速為1 BV/h，測定總?cè)扑岷?，確定最佳洗脫濃度。
1. 7. 6 洗脫流速選擇 取已測濃度的地參總?cè)扑崛芤荷现? BV/h流速通過后，用80%乙醇以1、2、3、4和5 BV/h進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，測定總?cè)扑岷?，確定最佳洗脫流速。
1. 8 響應(yīng)面設(shè)計(jì)
根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)一步設(shè)計(jì)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。選取總?cè)扑峒兓崛⌒Ч詈玫囊蛩厮?，以上樣濃度、上樣流速、洗脫濃度和洗脫流速為自變量，總?cè)扑峒兓厥章蕿轫憫?yīng)值，采用4因素3水平設(shè)計(jì)Box-Behnken Design試驗(yàn)，響應(yīng)面因素水平見表1。
1. 9 統(tǒng)計(jì)分析
采用Excel 2019、Origin 2018和SPSS 26.0處理數(shù)據(jù)及繪圖，以Design-Expert 12作響應(yīng)面設(shè)計(jì)及試驗(yàn)分析。
2 結(jié)果與分析
2. 1 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系考察結(jié)果
于545 nm處測定吸光值，以標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度為橫坐標(biāo)（x）、吸光值為縱坐標(biāo)（y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示。所得回歸方程：y=4.41878x+0.0152（R2=0.9996），繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線在0.00197～0.01773 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。
2. 2 方法學(xué)考察結(jié)果
2. 2. 1 精密度試驗(yàn)結(jié)果 計(jì)算所得總?cè)扑崞骄鵕SD為1.75%，小于10%，表明儀器精密度良好。
2. 2. 2 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果 地參總?cè)扑崞骄鵕SD為2.19%，小于10%，表明醇提法提取地參總?cè)扑岬脑囼?yàn)方法重復(fù)性較好。
2. 2. 3 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果 由表2可知，吸光值在20～40 min內(nèi)較穩(wěn)定，40 min穩(wěn)定性開始下降，RSD為1.12%，表明地參樣液適合在20～40 min內(nèi)測定吸光值。
2. 2. 4 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果 由表3可知，回收率為96.59%～106.65%，在90%～110%范圍內(nèi)，表明醇提法提取地參總?cè)扑岬姆椒煽俊?/p>
2. 3 顯色條件優(yōu)化結(jié)果
由表4可知，5%香草醛—冰乙酸用量越多，吸光值最低，影響樣品的顯色效果，因而用量在0.2 mL時(shí)最合適；高氯酸隨著加入量的增加，對樣品的顯色效果影響相對較小，當(dāng)高氯酸加至0.4 mL時(shí)，顯色效果最佳，故選擇高氯酸用量為0.4 mL。加入顯色劑和顯色劑+對照品2組對比（表5）發(fā)現(xiàn)，顯色劑組吸光值隨溫度的升高而不斷增加，在60 ℃升至70 ℃時(shí)，吸光值增加明顯，說明顯色劑對顯色效果的影響較大，綜合考慮，選取60 ℃為顯色溫度。
2. 4 不同樹脂的吸附率與解吸率
由表6可知，AB-8、D101和HPD600型樹脂均為非極性樹脂，萜類成分與非極性樹脂極性類似，3種型號樹脂的解吸率和吸附率均較高，其中AB-8型樹脂最高，解吸率和吸附率分別為88.61%和70.54%。綜合考慮吸附量、解吸率和吸附率指標(biāo)，選擇AB-8型樹脂作下一步研究。
2. 5 大孔樹脂靜態(tài)吸附動力學(xué)試驗(yàn)結(jié)果
2. 5. 1 靜態(tài)吸附動力學(xué) 由圖2可知，隨著吸附時(shí)間的延長，AB-8型樹脂對總?cè)扑岬奈搅坎粩嘣黾樱?～3 h吸附量快速增加，在3～6 h吸附量增速有所減緩，6 h之后的吸附量（3.0098 mg/g）增速進(jìn)一步減緩并接近平衡，表明地參總?cè)扑嵩? h基本吸附完全。動力學(xué)方程（表7）顯示，準(zhǔn)二級速率方程特征系數(shù)更高（R2>0.9900），能描述AB-8型樹脂對地參總?cè)扑岬奈竭^程。
2. 5. 2 大孔樹脂吸附等溫線測定 地參總?cè)扑峤?jīng)AB-8型樹脂吸附的線性等溫線和吸附等溫曲線如圖3所示，Langmuir和Freundlich方程如表8所示。Langmuir和Freundlich吸附等溫曲線模型擬合回歸方程的R2均在0.9800以上，2種模型均能描述AB-8型樹脂對地參總?cè)扑岬奈阶饔?，且Freundlich方程的R2更高。KF和n分別為Freundlich方程的模型參數(shù)和特征常數(shù)，在方程中，n>1時(shí)表明該物質(zhì)易被吸附（Yildirim et al.，2001），本研究中n=3.1085>1，說明地參總?cè)扑嵋妆籄B-8型樹脂吸附。
2. 6 大孔樹脂動態(tài)吸附—解吸性能試驗(yàn)結(jié)果
2. 6. 1 大孔樹脂泄露曲線 由圖4可知，上樣液體積越大，流出的總?cè)扑釢舛戎饾u增加，當(dāng)上樣液體積小于55 mL時(shí)，總?cè)扑釢舛仍黾于厔菥徛笥?5 mL時(shí)，總?cè)扑釢舛仍黾于厔菝黠@。隨著上樣體積的繼續(xù)增加，AB-8型吸附逐漸趨于飽和，上樣體積大于85 mL流出的總?cè)扑釢舛冉咏诔跏紭右簼舛?。?dāng)上樣體積為45 mL時(shí)，流出液中的濃度達(dá)初始上樣液總?cè)扑釢舛鹊?0%，為大孔樹脂AB-8型的泄漏點(diǎn)，為保證樣品液不泄露，避免浪費(fèi)，上樣體積應(yīng)控制在40 mL最合適。
2. 6. 2 上樣濃度的選擇 由圖5可知，當(dāng)上樣濃度小于0.65 mg/mL時(shí)，地參總?cè)扑峒兓厥章食噬仙厔?，在上樣濃度?.65 mg/mL時(shí)總?cè)扑峒兓厥章蔬_(dá)最大值，上樣濃度超0.65 mg/mL后，回收率略有下降，說明濃度過高反而影響地參總?cè)扑岬募兓に?。因此，最佳上樣濃度?.65 mg/mL，選取0.60、0.65和0.70 mg/mL進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。
2. 6. 3 上樣流速的選擇 由圖6可知，上樣流速對地參總?cè)扑峒兓厥章视绊懨黠@，上樣流速過慢使得吸附時(shí)間長，從而影響總?cè)扑峒兓?，?dāng)上樣流速增至2 BV/h時(shí)吸附時(shí)間合適，對總?cè)扑岬募兓Ч罴?，地參總?cè)扑峒兓厥章蔬_(dá)最大值；隨著上樣流速的繼續(xù)增加，大孔樹脂層吸附萜類化合物時(shí)間短，吸附效果差。因此，最佳上樣流速為2 BV/h，選取1、2和3 BV/h進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。
2. 6. 4 洗脫濃度的選擇 由圖7可知，隨著洗脫濃度的增加，地參總?cè)扑峒兓厥章手饾u提高，在洗脫濃度為80%時(shí)總?cè)扑峄厥章蔬_(dá)最大值，顯著高于50%和60%的回收率（P<0.05，下同），當(dāng)洗脫濃度大于80%時(shí)，回收率呈下降趨勢，說明洗脫濃度越大對地參總?cè)扑岬募兓Ч胶?，但達(dá)一定濃度后效果下降。因此，選擇最佳洗脫濃度為80%，并選取70%、80%和90%進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。
2. 6. 5 洗脫流速的選擇 由圖8可知，洗脫流速對地參總?cè)扑峒兓厥章视忻黠@影響，當(dāng)洗脫流速為2 BV/h時(shí)，回收率達(dá)最大值；當(dāng)洗脫流速大于2 BV/h時(shí)，總?cè)扑峄厥章曙@著降低，說明流速過快對總?cè)扑岬南疵撔Ч絹碓讲?。因此，最佳洗脫流速? BV/h，選取1、2和3 BV/h進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。
2. 6. 6 大孔樹脂洗脫曲線 由圖9可知，隨著洗脫液體積增大，地參總?cè)扑釢舛炔粩嘣黾?，洗脫液體積對總?cè)扑岬南疵撔Ч忻黠@影響；當(dāng)洗脫液體積在65 mL時(shí)，總?cè)扑釢舛冗_(dá)最大值，當(dāng)洗脫液體積繼續(xù)增加，總?cè)扑釢舛瘸氏陆第厔?，直至洗脫液體積在100 mL時(shí)，總?cè)扑釢舛葹?.01 mg/mL，說明此時(shí)已將總?cè)扑岢煞窒疵撏戤?。因此，考慮洗脫液體積及總?cè)扑嵯疵撔Ч?，?0%乙醇100 mL可將地參總?cè)扑岢煞窒疵撏耆?/p>
2. 7 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果
2. 7. 1 響應(yīng)面模型的建立 單因素試驗(yàn)結(jié)果顯示，上樣濃度0.65 mg/mL、上樣流速2 BV/h、洗脫濃度80%和洗脫流速2 BV/h為最佳水平條件。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用4因素3水平、最佳水平條件為0水平的響應(yīng)面中心試驗(yàn)（表9），運(yùn)用Design-Expert 12進(jìn)行二次多項(xiàng)式擬合。以地參總?cè)扑峒兓厥章蕿轫憫?yīng)值（Y），由回歸模型可得回收率與4個(gè)變量（上樣濃度、上樣流速、洗脫濃度和洗脫流速）之間的線性關(guān)系，所得二次回歸方程：Y=0.6887+0.0196A-0.0085B-0.0287C+0.0052D+0.0299AB-0.0107AC-0.0122AD+0.0128BC+0.0211BD+0.026A2-0.0765B2-0.0877C2-0.0932D2。
2. 7. 2 顯著性檢驗(yàn) 由方差分析結(jié)果（表10）可知，模型F=33.10，P<0.01，為極顯著，失擬項(xiàng)F=1.22，P=0.4587>0.05，為不顯著，表明所選用的二次多項(xiàng)模型的擬合程度良好，模型成立。模型相關(guān)系數(shù)R2=0.9707，表明該回歸方程有很好的相關(guān)性，校正決定系數(shù)[R2Adj]=0.9414，表明有94.14%的響應(yīng)值變化。在影響地參總?cè)扑峒兓厥章实囊蛩刂?，A、C、AB、CD、A2、B2、C2和D2影響極顯著（P<0.01，下同），BD影響顯著，而B、D、AC、AD和BC影響不顯著（P>0.05，下同）。選取的4個(gè)因素對地參總?cè)扑峒兓厥章视绊戫樞驗(yàn)镃>A>B>D，即洗脫濃度對地參總?cè)扑峒兓厥章实挠绊懽畲?，洗脫流速的影響最小?/p>
2. 8 兩因素間交互作用分析結(jié)果
由圖10可知，當(dāng)上樣流速不變時(shí)，隨著上樣濃度的增加，地參總?cè)扑岬幕厥章手饾u增大，當(dāng)上樣濃度為0.65 mg/mL時(shí)，回收率達(dá)峰值；上樣濃度繼續(xù)增加，回收率逐漸減小。等高線的橢圓度較大，說明上樣流速與上樣濃度的交互作用對地參總?cè)扑峄厥章视绊憳O顯著，與方差分析結(jié)果（表10）一致。
由圖11可知，當(dāng)洗脫濃度不變時(shí)，隨著上樣濃度的增加，地參總?cè)扑岬幕厥章手饾u增大，當(dāng)上樣濃度為0.65 mg/mL時(shí)，回收率達(dá)最大值；之后繼續(xù)增加上樣濃度，回收率則逐漸減小。同時(shí)，當(dāng)上樣濃度不變時(shí)，隨著洗脫濃度的增加，地參總?cè)扑岬幕厥章手饾u增大，當(dāng)洗脫濃度為80%時(shí)，回收率達(dá)峰值；隨著洗脫濃度繼續(xù)增大，回收率逐漸減小。等高線趨近于圓形，說明洗脫濃度與上樣濃度的交互作用對地參總?cè)扑峄厥章实挠绊懖伙@著，與方差分析結(jié)果（表10）一致。
由圖12可知，當(dāng)洗脫流速不變時(shí)，隨著上樣濃度的增加，地參總?cè)扑岬幕厥章手饾u增大，當(dāng)上樣濃度為0.65 mg/mL時(shí)，回收率達(dá)峰值；隨著上樣濃度的不斷增加，回收率則逐漸減小。同時(shí)，當(dāng)上樣濃度不變時(shí)，隨著洗脫流速的增加，地參總?cè)扑岬幕厥章手饾u增大，當(dāng)洗脫流速為2 BV/h時(shí)，回收率達(dá)峰值；隨著洗脫流速的繼續(xù)增加，回收率逐漸減小。等高線趨近于圓形，說明洗脫流速與上樣濃度的交互作用對地參總?cè)扑峄厥章实挠绊懖伙@著，與方差分析結(jié)果（表10）一致。
由圖13可知，當(dāng)洗脫濃度不變時(shí)，隨著上樣流速的增加，地參總?cè)扑岬幕厥章手饾u增大，當(dāng)上樣流速為2 BV/h時(shí)，回收率達(dá)峰值；之后隨著上樣流速的繼續(xù)增加，回收率則逐漸減小。同時(shí)，當(dāng)上樣流速不變時(shí)，隨著洗脫濃度的增加，地參總?cè)扑岬幕厥章手饾u增大，當(dāng)洗脫濃度為80%時(shí)，回收率達(dá)峰值；隨著洗脫濃度的繼續(xù)增加，回收率則逐漸減小。等高線趨近于圓形，說明洗脫濃度與上樣流速的交互作用對地參總?cè)扑峄厥章实挠绊懖伙@著，與方差分析結(jié)果（表10）一致。
由圖14可知，當(dāng)洗脫流速不變時(shí)，隨著上樣流速的增加，地參總?cè)扑岬幕厥章手饾u增大，當(dāng)上樣流速為2 BV/h時(shí)，回收率達(dá)峰值；之后隨著上樣流速的不斷增加，回收率逐漸減小。同時(shí)，當(dāng)上樣流速不變時(shí)，隨著洗脫流速的增加，地參總?cè)扑岬幕厥章手饾u增大，當(dāng)洗脫流速為2 BV/h時(shí)，回收率達(dá)峰值；隨著洗脫流速的繼續(xù)增大，回收率則逐漸減小。等高線趨近于橢圓，說明洗脫流速與上樣流速的交互作用對地參總?cè)扑峄厥章实挠绊戯@著，與方差分析結(jié)果（表10）一致。
由圖15可知，當(dāng)洗脫流速不變時(shí)，隨著洗脫濃度的增加，地參總?cè)扑岬幕厥章手饾u增大，當(dāng)洗脫濃度為80%時(shí)，回收率達(dá)峰值；之后隨著洗脫濃度的繼續(xù)增加，回收率逐漸減小。同時(shí)，當(dāng)洗脫濃度不變時(shí)，隨著洗脫流速的增加，地參總?cè)扑岬幕厥章手饾u增大，當(dāng)洗脫流速為2 BV/h時(shí)，回收率達(dá)峰值；之后隨著洗脫流速的繼續(xù)增大，回收率則逐漸減小。等高線的橢圓度較大，說明洗脫流速與洗脫濃度的交互作用對地參總?cè)扑峄厥章实挠绊憳O顯著，與方差分析結(jié)果（表10）一致。
響應(yīng)面圖可直觀反映出兩因素對地參總?cè)扑峒兓厥章市Ч挠绊?。由圖10～圖15可知，圖10和圖15等高線中的橢圓度大，坡度較陡，說明兩因素間的交互作用明顯，達(dá)極顯著水平；圖14等高線中的橢圓程度較大，兩因素間交互作用相對較弱，達(dá)顯著水平。圖11～圖13中，固定一個(gè)因素，地參總?cè)扑峄厥章示S著另一個(gè)因素的增大而減小，等高線趨近于圓形，從而表明兩因素間交互作用不明顯，與方差分析結(jié)果（表10）一致。通過Design-Expert 12的模型模擬，預(yù)測選取的4因素最佳組合：上樣濃度0.66 mg/mL、上樣流速1.97 BV/h、洗脫濃度78.34%、洗脫流速1.99 BV/h，地參總?cè)扑岬幕厥章蕿?9.30%。
2. 9 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果
取地參總?cè)扑釢饪s液3份各10.0 mL，在模型擬合適宜試驗(yàn)操作的條件（上樣濃度0.66 mg/mL、上樣流速2 BV/h、洗脫濃度80%、洗脫流速2 BV/h）下，驗(yàn)證響應(yīng)面法所得最佳純化工藝可實(shí)施性，收集洗脫液，測得地參總?cè)扑峒兓幕厥章史謩e為66.94%、67.31%和67.85%，平均回收率為67.37%，RSD為0.67%，表明AB-8型樹脂純化地參總?cè)扑岬膬?yōu)化工藝可行。
3 討論
3. 1 顯色條件分析
紫外分光光度法是分析檢測常用的方法，常以香草醛—高氯酸分光光度法對總?cè)祁惡窟M(jìn)行測定（李崇陽，2016），影響該測定方法的因素較多，顯色條件的優(yōu)化能更好地測定不同物種資源的萜類成分含量。在強(qiáng)酸條件下，可將萜類化合物結(jié)構(gòu)成分氧化為羧基，形成共軛體系而顯色，進(jìn)而對萜類含量進(jìn)行分析測定。本研究中，地參總?cè)扑嵩?45 nm處有最大吸收峰，通過不同顯色條件的篩選，進(jìn)而可得5%香草醛—冰乙酸和高氯酸的最佳加入量及顯色溫度。根據(jù)方法學(xué)中穩(wěn)定性檢測結(jié)果可得比色法對地參總?cè)扑岬臋z測在40 min內(nèi)較穩(wěn)定，對地參總?cè)扑岬臏y定效果較好。由于比色法操作簡便，因而作為測定總?cè)扑岬某Ｓ梅椒?，但試劑用量、試?yàn)操作時(shí)的反應(yīng)時(shí)間及反應(yīng)溫度等因素均對總?cè)扑岬臏y定影響較顯著，因此在優(yōu)化顯色條件中，分別對5%香草醛—冰乙酸用量、高氯酸用量、顯色試劑和顯色溫度進(jìn)行優(yōu)化，得到5%香草醛—冰乙酸用量在0.2 mL時(shí)最合適，高氯酸用量為0.4 mL合適，5%香草醛—冰乙酸與高氯酸加入量比例為1∶2，與陶鋒等（2011）分離純化連錢草總?cè)扑嶂酗@色條件比例相同；60 ℃顯色溫度下總?cè)扑岬臏y定效果好，所得最優(yōu)顯色溫度與韓偉和劉曦（2014）在枇杷葉總?cè)扑岬拇罂讟渲蛛x純化工藝中顯色條件相同。由結(jié)果可知，地參總?cè)扑峥刹捎?%香草醛—高氯酸分光光度法進(jìn)行測定，該操作可行，可為地參總?cè)扑岬南嚓P(guān)研究提供質(zhì)量控制技術(shù)。
3. 2 大孔樹脂選擇分析
大孔樹脂現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于天然植物中活性成分的分離純化。根據(jù)不同樹脂極性性質(zhì)可分為非極性、中性和極性3類，不同樹脂型號的極性不同，吸附性能有明顯差異，因樹脂易再生、吸附富集效果好等優(yōu)點(diǎn)在萜類化合物的純化中應(yīng)用較多，且樹脂對生物活性成分純化可最大限度地提高目標(biāo)物的回收率（白奪龍和楊開華，2007；李廣林，2014；王曉婷等，2022）。樹脂吸附原理是靠化合物分子之間的化學(xué)作用力，為達(dá)到純化、分離等目的可通過合適的溶劑將目標(biāo)化合物洗脫出來。非極性或弱極性吸附樹脂表面的疏水性強(qiáng)，由不帶任何功能基團(tuán)的單體聚合而成，有助于極性溶劑中非極性物質(zhì)的吸附。本研究選取的AB-8、D101、HPD600、DA201和S-8型樹脂具有不同極性，以吸附量、吸附率和解吸率作為評價(jià)地參總?cè)扑峒兓Ч闹笜?biāo)，對5種樹脂進(jìn)行篩選。因萜類成分是非極性化合物，非極性或弱極性樹脂能很好地將地參總?cè)扑岢煞窒疵撓聛?。AB-8和D101型樹脂均為非極性樹脂，地參中的總?cè)扑崴械奈瀛h(huán)三萜類（白樺脂酸、熊果酸和齊墩果酸）分子量較大，AB-8型樹脂的孔徑在480～520 nm，大于D101型樹脂的孔徑，能較好地吸附總?cè)扑岢煞?，達(dá)到純化效果。本研究結(jié)果表明，AB-8型樹脂與D101型樹脂對地參中的總?cè)扑岢煞治叫Ч?，其中AB-8型綜合指標(biāo)更優(yōu)，與李廣林（2014）對樺褐孔菌三萜提取分離試驗(yàn)結(jié)果類似。此外，還考察樹脂的性能，包括樹脂的靜態(tài)吸附動力學(xué)和等溫曲線；根據(jù)動力學(xué)方程得出準(zhǔn)二級速率方程能更好地展示樹脂的吸附過程，由動力學(xué)曲線可知AB-8型樹脂在6 h已接近飽和的吸附狀態(tài)。蔡天嬌（2017）篩選所得D101型樹脂純化紅棗三萜酸效果優(yōu)于AB-8型樹脂，本研究與之對比，說明不同物種資源中同種生物活性成分的樹脂選擇及吸附能力均有一定差異；將等溫曲線進(jìn)行Freundlich方程擬合，得到特征常數(shù)n>1，說明地參總?cè)扑嵋妆籄B-8型樹脂吸附，吸附效果明顯。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果可得，AB-8型樹脂吸附地參總?cè)扑岬姆椒煽?，可為樹脂大批量純化地參總?cè)扑崽峁?shù)據(jù)支撐。
3. 3 純化工藝分析
藥食同源植物中生物活性成分的研究有助于功能性食品資源的開發(fā)利用。地參作為菜藥兼?zhèn)涞闹参镔Y源，不僅營養(yǎng)豐富，還含有多種藥理活性成分，其中總?cè)扑崾撬幚砘钚猿煞种?。由于地參中成分?fù)雜多樣，對目標(biāo)化合物的提取會受到其他化合物成分的影響，有效成分的分離純化可為后續(xù)該化合物的成分鑒定及體內(nèi)體外功能研究打下重要基礎(chǔ)。本研究利用響應(yīng)面模型優(yōu)化上樣濃度、上樣流速、洗脫濃度和洗脫流速4個(gè)因素的工藝條件，采用最佳工藝優(yōu)化出的因素參數(shù)對地參總?cè)扑徇M(jìn)行純化，回收率可達(dá)66.00%以上。陳建中等（2015）采用響應(yīng)面法純化茼蒿中總黃酮，通過D101型樹脂測得黃酮回收率為87.36%，其上樣濃度達(dá)0.86 mg/mL，濃度差異可能會影響目標(biāo)產(chǎn)物的回收率；純化工藝優(yōu)化參數(shù)中的洗脫流速與陳建中等（2015）對茼蒿總黃酮分離純化的洗脫流速類似，均在2 mL/min左右。劉娜（2017）對澤蘭地上部分的總?cè)扑岢煞诌M(jìn)行分離純化，得出X-5型樹脂的純化效果最佳，總?cè)扑岬募兌瓤蛇_(dá)74%；本研究對澤蘭地下部分（地參）進(jìn)行分離純化，因澤蘭地上部分總?cè)扑岷考s為地下部分的3倍，所得純化的效果均有一定差異，說明樹脂對萜類純化效果顯著，能極大提高目標(biāo)化合物的純度。鄧思節(jié)（2016）對屈曲花種子總黃酮純化工藝進(jìn)行優(yōu)化，并分析其抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)純化后的總黃酮抗氧化活性高于粗提總黃酮，說明純化物的抗氧化活性更強(qiáng)。不同物種資源的不同化合物采用大孔樹脂純化效果不盡相同，因而對地參總?cè)扑針渲M(jìn)行純化工藝優(yōu)化很有必要。地參總?cè)扑嵩谏蠘訚舛?.66 mg/mL、上樣流速2 BV/h、洗脫濃度80%、洗脫流速2 BV/h時(shí)純化效果最佳，與蒙瑞波等（2012）提取純化白花蛇舌草中總?cè)扑岬纳蠘恿魉?、洗脫流速及洗脫濃度?yōu)化條件結(jié)果相同，說明該優(yōu)化條件穩(wěn)定可行、重復(fù)性好。本研究僅對地參總?cè)扑峄钚猿煞诌M(jìn)行純化，所得的目標(biāo)產(chǎn)物為多種萜類成分共存，需進(jìn)一步分離以測定地參中總?cè)扑岬膯误w成分，從而能進(jìn)一步證明樹脂純化地參總?cè)扑岬男Ч?/p>
4 結(jié)論
建立的回歸模型可用于地參總?cè)扑峒兓に嚨念A(yù)測；AB-8型大孔樹脂對地參總?cè)扑岬姆蛛x純化效果較好，適用于總?cè)扑嵛镔|(zhì)的純化。
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（責(zé)任編輯 羅 麗）
收稿日期：2022-09-09
基金項(xiàng)目：重慶市自然科學(xué)基金項(xiàng)目（cstc2019jcyj-msxmX0770）；重慶市教委科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（KJQN202201231，KJQN202002712）
通訊作者：周濃（1978-），https：//orcid.org/0000-0003-1236-8585，教授，主要從事中藥炮制與資源研究工作，E-mail：erhaizn@126.com
第一作者：李金金（1995-），https：//orcid.org/0000-0002-6663-4044，研究方向?yàn)樗幨惩粗参镔Y源開發(fā)及利用，E-mail：ljjlbh1995 @163.com
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