不同貯藏溫度對(duì)雪膽塊莖褐變相關(guān)酶及底物的影響

陳庚 李思琪 高青青 李霞 段柯兆 張廣輝 楊生超 趙艷

DOI：10.3969/j.issn.2095-1191.2023.06.010

摘要：【目的】研究貯藏溫度對(duì)雪膽塊莖褐變相關(guān)酶、底物及有效成分的影響，為控制褐變、提高雪膽塊莖中藥材的穩(wěn)定性提供理論支持?！痉椒ā繉Ⅴr切雪膽塊莖放置在3個(gè)貯藏溫度（-20、4和25 ℃）下，分別于貯藏第0、2、4、8和10 d時(shí)取樣，測(cè)定其褐變度、過氧化物酶（POD）活性及丙二醛（MDA）、總酚、雪膽甲素和雪膽乙素含量等指標(biāo)，并進(jìn)行褐變度與其他測(cè)定指標(biāo)間的相關(guān)分析。【結(jié)果】隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，鮮切雪膽塊莖褐變度均上升，貯藏至第10 d時(shí)，25 ℃下貯藏的鮮切雪膽塊莖褐變度較-20和4 ℃顯著升高（P<0.05，下同）；3個(gè)貯藏溫度下的鮮切雪膽塊莖POD活性均呈先上升后下降的變化趨勢(shì)，整個(gè)貯藏期間25 ℃下的POD活性始終顯著高于-20和4 ℃；貯藏溫度越高，鮮切雪膽塊莖的MDA含量越大，貯藏4～10 d，25 ℃的MDA含量顯著高于-20和4 ℃，但-20與4 ℃的MDA含量間無顯著差異（P>0.05，下同）；貯藏第4 d后，25 ℃下貯藏的鮮切雪膽塊莖總酚含量也始終顯著高于-20和4 ℃。25 ℃下貯藏的鮮切雪膽塊莖中雪膽甲素含量在第4 d后急劇上升，在第6 d達(dá)最大值（1.1410 mg/g），顯著高于-20和4 ℃，而雪膽乙素含量在貯藏2 d后開始急劇增加，至第8 d時(shí)達(dá)0.01143 mg/g，也顯著高于-20和4 ℃。相關(guān)分析結(jié)果表明，3個(gè)貯藏溫度下的褐變度均與貯藏時(shí)間呈極顯著正相關(guān)（P<0.01，下同），與總酚、雪膽甲素和雪膽乙素含量均無顯著相關(guān)性；-20和4 ℃的褐變度與POD活性分別呈極顯著和顯著負(fù)相關(guān)，-25 ℃的褐變度與POD活性無顯著相關(guān)性；-20 ℃的褐變度與MDA含量呈顯著負(fù)相關(guān)?！窘Y(jié)論】低溫（-20和4 ℃）下貯藏，可通過抑制褐變關(guān)鍵酶POD活性，或減少褐變底物酚類物質(zhì)的生成而有效控制鮮切雪膽塊莖的褐變，以-20 ℃的控制褐變效果更佳。

關(guān)鍵詞：鮮切雪膽；塊莖；褐變；過氧化物酶；總酚；貯藏溫度

中圖分類號(hào)：S567.909.3? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2023）06-1689-08

Effects of different storage temperatures on browning-related

enzymes and substrates of fresh-cut tubers of Hemsleya chinensis

CHEN Geng1，2，3， LI Si-qi1， GAO Qing-qing1，2，3， LI Xia1，2，3， DUAN Ke-zhao4，

ZHANG Guang-hui1，2，3， YANG Sheng-chao1，2，3， ZHAO Yan1，2，3*

（1National-local Joint Engineering Research Center on Gemplasm Innovation & Utilization of Chinese Medicinal Materials in Southwest China，Yunnan Agricultural University，Kunming，Yunnan? 650201，China； 2The Key Laboratory of

Medicinal Plant Biology of Yunnan Province，Yunnan Agricultural University，Kunming，Yunnan? 650201，China；

3College of Agronomy and Biotechnology，Yunnan Agricultural University，Kunming，Yunnan? 650201，China；

4Yunnan Kezhao Biological Technology Limited Company，Kunming，Yunnan? 650200，China）

Abstract：【Objective】To investigate the factors that affected the browning of tuber of Hemsleya chinensis under sto-rage temperature，and to study the mechanism and change law of the browning process，to provide theoretical support for controlling browning and improving the stability of tuber of H. chinensis. 【Method】The fresh-cut tubers of H. chinensis were placed at three different storage temperatures（-20，4 and 25 ℃），and samples were taken on the 0，2nd，4th，8th，and 10th d of storage respectively，to study the degree of browning，changes in peroxidase（POD） activity，malondialdehyde （MDA），total polyphenols， cucurbitacin IIa and cucurbitacin IIb contents，and the correlation analysis between the degree of browning and measured indexes was carried out. 【Result】With the prolongation of storage time，the browning degree of fresh-cut tubers of H. chinensis increased. At the 10th d， the browning degree of fresh-cut tuber of H.chinensis stored at 25 ℃ was significantly higher than that at -20 and 4 ℃（P<0.05， the same below）. At this time，the POD activities of H.chinensis tubers at three temperatures showed a trend of first increasing and then decreasing，and the POD activities du-ring the whole storage period were significantly higher than those under -20 and 4 ℃. The higher the storage temperature， the greater the MDA content of fresh-cut tubers of H. chinensis， stored at 4-10 d， the MDA content at 25 ℃ was significantly higher than -20 and 4 ℃， but there was no significant difference in MDA content between -20 and 4 ℃ （P>0.05， the same below）； the total phenolic content of resh-cut tubers of H. chinensis stored at 25 ℃ after 4 d was always significantly higher than-20 and 4 ℃. At 25 ℃， the content of cucurbitacin IIa in fresh-cut tubers of H. chinensis increased sharply after 4 d and reached the maximum value on day 6 （1.1410 mg/g）， significantly higher than at -20 and 4 ℃， the content of cucurbitacin IIb began to increase sharply after 2 d of storage， and on day 8， the content of cucurbitacin IIb reached 0.01143 mg/g， which was significantly higher than at -20 and 4 ℃. The results of correlation analysis showed that the BD at the three storage temperatures had an extremely significant positive correlation with the storage period （P<0.01， the same below），but no significant correlation with total polyphenols，? cucurbitacin IIa and cucurbitacin IIb contents. BD had extremely significant and significant correlation with POD activity at -20 and 4 ℃ respectively， BD at -25 ℃ had no significant correlation with POD activity， BD at -20 ℃ had significant negative correlation with MDA content. 【Conclusion】Storage at low temperatures （-20 and 4 ℃） can inhibit the activity of POD， a key enzyme in browning， or reduce the production of browning substrate phenolic substances to effectively control the browning of fresh-cut tubers of H. chinensis. The browning control effect is better at -20 ℃.

Key words： fresh-cut Hemsleya chinensis； tuber； browning； peroxidas；total phenolic； storage temperature

Foundation items： National Natural Science Foundation of China（81960691）；Yunnan Major Science and Technology Project（2018ZF011）； Independent Research Project of Yunnan Characteristic Plant Extraction Laboratory （2022YK ZY001）

0 引言

【研究意義】褐變是藥材和果蔬食品加工中普遍存在的一種變色現(xiàn)象。在新鮮藥材和果蔬食品干燥加工的大規(guī)模生產(chǎn)中，受機(jī)械損傷或氧氣、溫度等因素影響，產(chǎn)品極易發(fā)生褐變并嚴(yán)重影響其外觀、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及市場(chǎng)價(jià)格（徐菲等，2011）。一般研究認(rèn)為 0～5 ℃適宜貯藏鮮切果蔬而不發(fā)生冷害，但更低溫度貯藏鮮切中藥材后褐變度和內(nèi)部理化性質(zhì)的變化規(guī)律尚不清楚。雪膽（Hemsleya chinensis）是一種具有膨脹大塊莖的多年生攀援草本植物，集中分布于我國(guó)西南地區(qū)，少量分布于中南地區(qū)（劉鈺瑩等，2017），具有清熱解毒、消炎抗菌等功效（李瑩等，2015；曾祥飛等，2016）。雪膽藥用價(jià)值最高的部位是附著在根部半裸露于地表的塊莖，初加工時(shí)需對(duì)其進(jìn)行剝皮、切片、切碎等，易導(dǎo)致其塊莖表皮細(xì)胞破裂，從而造成細(xì)胞組織脫水和微生物入侵，出現(xiàn)塊莖腐爛、褐變等現(xiàn)象，嚴(yán)重影響雪膽藥材的產(chǎn)量與品質(zhì)。因此，研究貯藏條件對(duì)鮮切雪膽塊莖褐變及生理生化特性的影響，對(duì)保證其藥材的產(chǎn)量與品質(zhì)具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】低溫貯藏可直接抑制酶的活力，減緩褐變反應(yīng)的速度和強(qiáng)度，是抑制果蔬褐變最直接有效的方法，且簡(jiǎn)單易行、安全性高，國(guó)內(nèi)外普遍將其作為鮮切果蔬保鮮的基本手段（Xu，2005；劉芳等，2015）。有研究表明，在藥材貯藏過程中以酶促反應(yīng)褐變?yōu)橹鳎喾友趸福≒PO）和過氧化氫酶（POD）在酶促褐變中是關(guān)鍵因素，引起藥材褐變或加劇褐變；而低溫條件下貯藏能抑制PPO和POD活性，從而減緩褐變發(fā)生速度（孫國(guó)東等，2017；朱玉蕓，2018；李東輝等，2022）。王靜等（2008）研究表明1～5 ℃冷藏可通過抑制PPO和POD活性延緩鮮切牛蒡的褐變，延緩產(chǎn)品衰老，提高產(chǎn)品質(zhì)量。王彥博（2009）、趙梅（2012）研究發(fā)現(xiàn)0～4 ℃是鮮切山藥適宜的貯藏溫度，能較好地保持鮮切山藥的品質(zhì)。張福平等（2014）、李蓉等（2022）發(fā)現(xiàn)低溫貯藏條件可有效預(yù)防新鮮余甘子果實(shí)的褐變，且有效延緩余甘子果實(shí)感官及品質(zhì)的下降，延長(zhǎng)貯藏期，以5 ℃貯藏保鮮效果最佳。謝榮娟等（2017）研究北青龍衣由鮮品到干品的貯藏期間出現(xiàn)失水、顏色變深等褐變現(xiàn)象的原因，為控制褐變、提高藥材的穩(wěn)定性提供依據(jù)。朱玉蕓等（2018）研究發(fā)現(xiàn)酶促褐變是導(dǎo)致花類藥材品質(zhì)裂變的主要原因之一，其中POD是引起新鮮菊花酶促褐變的一類氧化還原酶?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】關(guān)于雪膽的研究，近年來主要集中在馴化栽培（楊秋容，2014）、塊莖的化學(xué)成分生物活性（Wang et al.，2018）和化學(xué)成分含量測(cè)定（楊程等，2019；陳庚等，2020）及內(nèi)生真菌分離鑒定（賴清玉等，2019）等方面，而針對(duì)雪膽塊莖采收后不同貯藏溫度條件下褐變相關(guān)酶、底物及有效成分變化的研究鮮見報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】分析鮮切雪膽塊莖在不同貯藏溫度下褐變相關(guān)酶、底物及有效成分的變化規(guī)律，探索出減弱鮮切雪膽塊莖褐變的有效貯藏方法，為提升雪膽藥材的品質(zhì)提供參考依據(jù)，也為控制富含酚類的其他中藥材酶促褐變提供思路。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

雪膽植株的塊莖采自昆明市云南柯兆生物科技有限公司的雪膽資源圃，經(jīng)云南農(nóng)業(yè)大學(xué)楊生超教授鑒定為雪膽。雪膽甲素和雪膽乙素標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自四川省維克奇生物科技有限公司，生產(chǎn)批號(hào)分別為wkq16072205和wkq16072904，純度大于98%；乙腈為色譜級(jí)，水為純凈水，其他試劑均為分析純。主要儀器設(shè)備：Agilent1260系列高效液相色譜儀、Agilent Chem Station工作站（安捷倫公司）；UV-2450紫外分光光度計(jì)（日本島津公司）。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 試樣處理 試驗(yàn)用具（刀具、處理臺(tái)等）用75%乙醇進(jìn)行消毒處理。用200 μmol/L次氯酸鈉清洗、浸泡雪膽2 min，擦干后快速削皮，將其切成相同厚度的雪膽塊莖切片，然后分別置于-20、4和25 ℃下貯藏，每2 d取1次切片，立即用液氮冷凍并打磨成粉，測(cè)定褐變度、POD活性等指標(biāo)，每個(gè)指標(biāo)重復(fù)測(cè)定3次。

1. 2. 2 褐變度測(cè)定 參考謝榮娟等（2017）的方法，修改測(cè)定。取1支離心管，加入2 g雪膽樣品和10.0 mL 80%乙醇，充分混勻，放置于避光處30 min，放置期間每隔5 min攪拌1次；然后6000 r/min下離心，使上清液完全澄清，不含任何雜質(zhì)，用紫外分光光度計(jì)在410 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光值，測(cè)定3次取平均值，用80%乙醇作空白對(duì)照。

BD=A410×V/M

式中，BD為褐變度，A410為410 nm吸光值，V為提取液體積（mL），M為樣品質(zhì)量（g）。

1. 2. 3 POD活性測(cè)定 取1支試管，先加入0.1 mL 0.75%過氧化氫溶液，再加入2.0 mL 0.2 mol/L乙酸—乙酸鈉緩沖液（pH 5.5）和1.0 mL 0.05 mol/L愈創(chuàng)木酚溶液，最后加入0.05 mL離心得到的上清液，快速充分混勻，用紫外分光光度計(jì)在470 nm波長(zhǎng)下每隔15 s記錄1次數(shù)值。

POD活性（μg/min）=A470×Vt/W×Vs×0.01×t

式中，A470為470 nm吸光值，Vt為提取酶液總體積（mL），Vs為測(cè)定時(shí)所取酶液體積（mL），W為樣品重量（g），t為反應(yīng)時(shí)間。

1. 2. 4 丙二醛（MDA）含量測(cè)定 取1支離心管，加入1 g雪膽樣品，再加入5.0 mL 10%三氯乙酸（TCA）充分混勻，在4 ℃、1000 r/min的條件下離心20 min，之后收集上清液備用。

取1支離心管，加入上清液2.0 mL和0.67% 2-硫代巴比妥酸（TBA）2.0 mL；另取1支離心管，加入10% TCA溶液2.0 mL和0.67% TBA 2.0 mL作空白對(duì)照，將2支離心管內(nèi)的溶液充分混勻，水浴20 min，冷卻后離心，利用紫外分光光度計(jì)測(cè)量上清液分別在450、532和600 nm波長(zhǎng)處的吸光值，測(cè)定3次，取平均值。

消除誤差：C（μmol/L）=6.45×（A532-A600）-0.56×A450

MDA含量（μmol/g）=C×V/Vs×W×1000

式中，C為反應(yīng)混合液中MDA含量（μmol/L），A450、A532和A600分別為450、532和600 nm吸光值，V為樣品提取液總體積（mL），Vs為測(cè)定時(shí)所取樣品提取液體積（mL），W為樣品重量（g）。

1. 2. 5 總酚含量測(cè)定 稱取2 g雪膽樣品，加入32.0 mL 50%乙醇，充分混勻，進(jìn)行59 min冷凝回流提取，提取結(jié)束后趁熱過濾，冷卻后將全部上清液加入100 mL容量瓶中，用50%乙醇定容，所得即為雪膽多酚提取液，保留備用。雪膽多酚提取、沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線制作和雪膽多酚提取率計(jì)算參考段思宇等（2021）的方法進(jìn)行。

1. 2. 6 高效液相色譜（HPLC）測(cè)定雪膽素 稱取1 g雪膽樣品，加入正己烷和乙酸乙酯混合物（混合比例1∶4），振蕩使其充分混勻，在37 ℃下放置30 min，然后超聲30 min，離心至上清液澄清無雜質(zhì)，取上清液備用。向沉淀物中加入1.0 mL甲醇，超聲離心提取雪膽素。取上清液于浸提化合物樣品瓶中，55 ℃水浴鍋預(yù)熱并用旋蒸儀濃縮后甲醇定容，最后用高效液相色譜儀測(cè)定化合物含量（陳庚等，2020）。

液相色譜條件：色譜柱為Phenomenex Kinetex C18 analytical column（4.6 mm×100 mm，2.6 μm），測(cè)定雪膽素流動(dòng)相為0.2%磷酸水溶液（A）—乙腈（B），梯度洗脫：0～15 min，25%～33% B；15～20 min，33%～40% B；20～24 min，40%～60% B；24～28 min，60%～90% B。檢測(cè)波長(zhǎng)212 nm，流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣體積10 μL。

1. 3 統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2010和SPSS 20.0對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理統(tǒng)計(jì)和分析，以GraphPad Prism 8制圖。

2 結(jié)果與分析

2. 1 鮮切雪膽塊莖貯藏期間褐變度的變化

從圖1可明顯看出鮮切雪膽塊莖在3個(gè)貯藏溫度下的褐變情況，在25 ℃下貯藏的雪膽塊莖褐變顏色最深，至第8 d已全部褐化，在4 ℃下貯藏的雪膽塊莖褐變則相對(duì)緩慢，而在-20 ℃下貯藏的雪膽塊莖至第8 d才出現(xiàn)輕微的褐化。

由圖2可知，3個(gè)貯藏溫度（-20、4和25 ℃）下鮮切雪膽塊莖的褐變度均呈持續(xù)上升趨勢(shì)，貯藏至第10 d，褐變度分別為4.58、7.96和10.46。表明褐變度與貯藏溫度呈正相關(guān)，在不同貯藏溫度下的鮮切雪膽塊莖均會(huì)發(fā)生褐變，25 ℃下貯藏鮮切雪膽塊莖的褐變程度最高，顯著高于-20和4 ℃（P<0.05，下同）。

2. 2 鮮切雪膽塊莖貯藏期間POD活性的變化

如圖3所示，3個(gè)貯藏溫度下的鮮切雪膽塊莖POD活性均呈先上升后下降的變化趨勢(shì)。25 ℃下貯藏的鮮切雪膽塊莖POD活性在第2 d快速升高，第4 d達(dá)最大值，整個(gè)貯藏期間POD活性均顯著高于-20和4 ℃；在-20和4 ℃下貯藏時(shí)，鮮切雪膽塊莖POD活性在整個(gè)貯藏期間變化較小，均在第2 d達(dá)最大值，4 ℃的POD活性顯著高于-20 ℃。

2. 3 鮮切雪膽塊莖貯藏期間MDA含量的變化

MDA是膜脂過氧化的最終產(chǎn)物，其含量反映植物的受損害程度。如圖4所示，鮮切雪膽塊莖的MDA含量在3個(gè)貯藏溫度下均呈先升高后降低再升高的變化趨勢(shì)。在-20和4 ℃下貯藏時(shí)，鮮切雪膽塊莖的MDA含量在第2 d達(dá)峰值后逐漸下降，第4 d降至最低值；然而，25 ℃下貯藏時(shí)，鮮切雪膽塊莖的MDA含量在第4 d達(dá)最大值，且顯著高于-20和4 ℃。出現(xiàn)這種現(xiàn)象可能是由于削皮、切片等加工操作破壞雪膽塊莖組織細(xì)胞，導(dǎo)致MDA含量快速升高，0～4 d內(nèi)達(dá)峰值；25 ℃下貯藏時(shí)，MDA含量逐漸降低趨于正常，但由于貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，雪膽塊莖中MDA含量又開始升高。表明貯藏溫度越高，膜脂過氧化越強(qiáng)，MDA含量越高，越不利于雪膽塊莖的貯藏。貯藏4～10 d，25 ℃下的雪膽塊莖MDA含量顯著高于 -20和4 ℃，而后兩者間無顯著差異（P>0.05，下同）。

2. 4 鮮切雪膽塊莖貯藏期間總酚含量的變化

沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程及線性關(guān)系為Y=63.457X-0.0005，相關(guān)系數(shù)（r）為0.9998。植物褐變的底物是酚類物質(zhì)，雪膽塊莖中酚類物質(zhì)含量越高，其褐變度就越大。如圖5所示，鮮切雪膽塊莖的總酚含量在3個(gè)貯藏溫度下均呈先升高后降低的變化趨勢(shì)，均在第6 d達(dá)最大值且增速極快，25 ℃下的含量變化最大。在整個(gè)貯藏期間，25 ℃下貯藏的鮮切雪膽塊莖總酚含量始終高于-20和4 ℃，該變化與鮮切雪膽塊莖褐變度基本一致，由此可知，總酚含量直接影響雪膽塊莖的褐變程度。

2. 5 鮮切雪膽塊莖貯藏期間雪膽素含量的變化

HPLC測(cè)定對(duì)照品及樣品的結(jié)果見圖6。分別使用雪膽甲素標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=6804.5351X+18.9056（r=0.9999）和雪膽乙素標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=2360.1633X-3.5358（r=0.9998）計(jì)算雪膽甲素和雪膽乙素含量，其測(cè)定結(jié)果見圖7和圖8。

如圖7所示，25 ℃下貯藏的鮮切雪膽塊莖雪膽甲素含量在第4 d后急劇上升，在第6 d達(dá)最大值（1.1410 mg/g），顯著高于-20和4 ℃，第6 d后呈快速下降趨勢(shì)。相比于25 ℃，-20和4 ℃下貯藏的鮮切雪膽塊莖雪膽甲素含量呈波動(dòng)式緩慢上升趨勢(shì)，第6 d時(shí)分別升至 0.4346和0.1120 mg/g，二者間存在顯著差異，第6 d后也呈下降趨勢(shì)，貯藏至第10 d時(shí)均低于初始含量。

如圖8所示，鮮切雪膽塊莖在貯藏期間雪膽乙素含量極少，3個(gè)貯藏溫度均有出現(xiàn)檢測(cè)不到含量的情況，尤其是在4 ℃下貯藏的鮮切雪膽塊莖未檢測(cè)到雪膽乙素。-20 ℃下，貯藏前期鮮切雪膽塊莖的雪膽乙素含量呈先上升后下降的變化趨勢(shì)，但整體呈下降趨勢(shì)，直至未檢測(cè)到雪膽乙素含量。25 ℃下，鮮切雪膽塊莖的雪膽乙素含量在貯藏2 d后開始急劇增加，至第8 d時(shí)雪膽乙素含量達(dá)最大值（0.01143 mg/g），顯著高于-20和4 ℃，之后快速下降，貯藏至第10 d時(shí)未檢測(cè)到雪膽乙素含量。可見3個(gè)貯藏溫度條件下鮮切雪膽塊莖的雪膽乙素含量變化大。

2. 6 鮮切雪膽塊莖在不同貯藏溫度下褐變度與各指標(biāo)間的相關(guān)分析結(jié)果

以3個(gè)貯藏溫度條件下的鮮切雪膽塊莖褐變度與各測(cè)定指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)分析，結(jié)果（表1）顯示，3個(gè)貯藏溫度的鮮切雪膽塊莖褐變度均與貯藏時(shí)間呈極顯著正相關(guān)（P<0.01，下同），與總酚、雪膽甲素和雪膽乙素含量均無顯著相關(guān)性；-20和4 ℃的褐變度與POD活性分別呈極顯著和顯著負(fù)相關(guān)，-25 ℃的褐變度與POD活性無顯著相關(guān)性；-20 ℃貯藏條件下，褐變度與MDA含量呈顯著負(fù)相關(guān)，4和25 ℃貯藏條件下，褐變度與MDA含量無顯著相關(guān)性。由此可知，鮮切雪膽塊莖在貯藏過程中，其褐變與POD反應(yīng)系統(tǒng)和酚類物質(zhì)密切相關(guān)，將鮮切雪膽塊莖低溫（4和 -20 ℃）貯藏后，其褐變度與POD活性的相關(guān)性高于常溫（25 ℃）貯藏。

3 討論

前人研究發(fā)現(xiàn)褐變反應(yīng)不僅存在于果蔬中，也存在于許多富含多酚類物質(zhì)的中藥、或作為中藥使用的植物藥中，在藥材飲片中則可能會(huì)造成成分變化、藥效改變（徐菲等，2011；謝榮娟等，2017）。本研究以雪膽塊莖在不同貯藏溫度下褐變度和相關(guān)酶活性變化來推測(cè)雪膽塊莖此類植物藥的褐變機(jī)制，并結(jié)合褐變過程中成分變化結(jié)果，以期得出應(yīng)抑制褐變或促進(jìn)褐變，從而提高雪膽藥材質(zhì)量。

在本研究中，鮮切雪膽塊莖在不同貯藏溫度條件下，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，褐變度均明顯上升，且褐變度與貯藏時(shí)間呈極顯著正相關(guān)，其中25 ℃下貯藏至第10 d時(shí)褐變嚴(yán)重，說明貯藏溫度高會(huì)加快褐變速度，與鮮切牛蒡、鮮切山藥、北青龍衣、亳菊等藥材隨貯藏時(shí)間延長(zhǎng)其褐變度均上升的研究結(jié)果（王靜等，2008；趙梅，2012；謝榮娟等，2017；朱玉蕓等，2018）一致。雪膽藥用部位為地表的膨大塊莖，含有豐富的酚類物質(zhì)（段思宇等，2021），對(duì)其進(jìn)行剝皮、切片、切碎等初加工時(shí)，由于切割導(dǎo)致雪膽組織細(xì)胞嚴(yán)重受損，細(xì)胞膜的穩(wěn)定性降低，使原來分布在細(xì)胞內(nèi)的酚類物質(zhì)流出，當(dāng)與外界氧氣接觸后，POD作為植物體內(nèi)重要的抗氧化酶，酚類物質(zhì)可被POD氧化形成醌類物質(zhì)，聚集后呈褐色發(fā)生褐變。本研究結(jié)果表明，3種貯藏溫度下，POD活性在0～2 d內(nèi)均急劇上升，推測(cè)雪膽塊莖受切割損傷后，破壞了細(xì)胞膜系統(tǒng)的完整性，導(dǎo)致細(xì)胞壁降解，更容易與酚類化合物底物結(jié)合，使得POD活性增強(qiáng)。由于酶類物質(zhì)易受溫度影響，低溫會(huì)抑制POD活性；在-20和4 ℃的低溫環(huán)境下POD活性變化較小，但在25 ℃貯藏溫度下鮮切雪膽塊莖的POD活性有明顯變化。隨著貯藏溫度的上升，POD活性與褐變程度呈明顯的正相關(guān)，是導(dǎo)致鮮切雪膽塊莖褐變的關(guān)鍵因素。其可能的機(jī)制是由于酶類物質(zhì)易受溫度影響，低溫鈍化POD活性，一定程度上導(dǎo)致褐變底物的合成減少、氧化速度降低，進(jìn)一步延緩鮮切雪膽的褐變發(fā)生。由此可知，是由于POD所催化的雪膽多酚類物質(zhì)氧化反應(yīng)引起褐變，與亳菊中POD是引起新鮮菊花瓣酶促褐變的主要因素一致（朱玉蕓等，2018）。

本研究結(jié)果表明，在整個(gè)貯藏期間，3個(gè)溫度下的POD活性變化與MDA含量呈正相關(guān)，即POD活性越大，MDA含量越高。多酚類物質(zhì)是褐變的底物，底物積累增多，POD活性升高，氧化形成的醌類物質(zhì)越來越多，導(dǎo)致雪膽褐變更加嚴(yán)重。因此，減少褐變底物酚類物質(zhì)的生成以防止積累，抑制褐變相關(guān)酶POD活性，可有效阻止雪膽塊莖的褐變，MDA含量也會(huì)相應(yīng)減少。謝榮娟等（2017）研究發(fā)現(xiàn)鮮品北青龍衣在低溫貯藏期間，膜系統(tǒng)損傷會(huì)破壞自由基代謝平衡，使超氧化物歧化酶（SOD）和POD代謝作用失調(diào)，H2O2積累，導(dǎo)電率增大，MDA含量增加，導(dǎo)致褐變發(fā)生。本研究中，低溫（4和-20 ℃）貯藏下的褐變度、POD活性、MDA含量及總酚含量較低，不僅可有效減緩雪膽塊莖組織細(xì)胞的衰老，降低POD活性，減緩酚類物質(zhì)的生成，還可使雪膽塊莖細(xì)胞的生長(zhǎng)、繁殖和代謝減慢，降低雪膽塊莖褐變度。

雪膽素（雪膽甲素和雪膽乙素）是重要的中藥原料藥，是生產(chǎn)中成藥雪膽素片（中藥保護(hù)品種）和雪膽素膠囊的原料藥。本研究探索不同貯藏溫度下雪膽塊莖中有效成分的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)25 ℃貯藏期間，雪膽塊莖中褐變和相關(guān)酶活性變化可能會(huì)導(dǎo)致雪膽甲素轉(zhuǎn)化為雪膽乙素或促進(jìn)雪膽乙素的積累。本研究對(duì)比雪膽塊莖在-20和4 ℃條件下的貯藏效果，發(fā)現(xiàn)-20 ℃貯藏能明顯延緩鮮切雪膽塊莖的褐變度、POD活性、MDA含量及總酚含量的上升，且在-20 ℃下貯藏鮮切雪膽塊莖的有效成分（雪膽甲素和雪膽乙素）含量更高。在25 ℃貯藏期間，雪膽甲素含量在第6 d最高，雪膽乙素含量在第8 d最高，對(duì)應(yīng)的鮮切雪膽塊莖總酚含量在第6 d達(dá)最大值且增速極快，同時(shí)，褐變度也在快速增大。在不同溫度貯藏期間，鮮切雪膽塊莖褐變及相關(guān)酶和底物均劇烈變化會(huì)引起很多酶促反應(yīng)和非酶促反應(yīng)，可能導(dǎo)致雪膽藥材中有效成分雪膽素相互轉(zhuǎn)化和降解。-20 ℃的低溫儲(chǔ)存更有利于減緩褐變，且最大程度地保留雪膽塊莖中的有效成分雪膽素，保持藥材的質(zhì)量和價(jià)值。

4 結(jié)論

隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，鮮切塊莖褐變嚴(yán)重；POD活性可反映褐變程度。低溫（-20和4 ℃）下貯藏，可通過抑制褐變關(guān)鍵酶POD活性，或減少褐變底物酚類物質(zhì)的生成而有效控制鮮切雪膽塊莖的褐變，以-20 ℃的控制褐變效果更佳。

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（責(zé)任編輯 羅 麗）

收稿日期：2022-07-24

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81960691）；云南省重大科技專項(xiàng)（2018ZF011）；云南特色植物提取實(shí)驗(yàn)室自主研究項(xiàng)目（2022 YKZY001）

通訊作者：趙艷（1982-），https：//orcid.org/0000-0001-8088-4288，博士，副教授，主要從事藥用植物研究工作，E-mail：zhaoyankm@126.com

第一作者：陳庚（1994-），https：//orcid.org/0009-0000-0484-1753，研究方向?yàn)樗幱弥参镉行С煞滞緩浇馕?，E-mail：1462415742 @qq.com