基于高通量測(cè)序的明日葉不同組織內(nèi)生菌群落結(jié)構(gòu)分析

劉雯雯 張旭 黃奇 胡連清 陳露 周萬(wàn)海 魏琴 馮瑞章 趙鑫

DOI：10.3969/j.issn.2095-1191.2023.06.004

摘要：【目的】分析明日葉不同組織內(nèi)生菌的群落結(jié)構(gòu)和多樣性，為探究明日葉和內(nèi)生菌互作機(jī)制及功能菌株篩選提供參考?！痉椒ā恳运拇ㄒ速e栽培的藥食兼用型明日葉為試材，采用Illumina MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)確定根、莖、葉和果實(shí)組織內(nèi)生真菌和內(nèi)生細(xì)菌群落多樣性?！窘Y(jié)果】根據(jù)97%的序列相似性水平，將內(nèi)生真菌和細(xì)菌的reads分別歸類為1023和1871個(gè)操作分類單元（OTU）。韋恩圖和熱圖顯示明日葉各組織內(nèi)生真菌和內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異性較高，種群豐度存在一定的差異。α多樣性分析發(fā)現(xiàn)明日葉的葉內(nèi)生真菌種類數(shù)最多，根內(nèi)生真菌群落多樣性最低，果實(shí)內(nèi)生真菌群落豐富度最低；而根含有內(nèi)生細(xì)菌種類數(shù)最多，莖內(nèi)生細(xì)菌群落多樣性最低，果實(shí)內(nèi)生細(xì)菌群落豐富度最低。β多樣性分析表明，組織特征對(duì)明日葉內(nèi)生真菌或內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)有顯著影響。明日葉4個(gè)不同組織中的優(yōu)勢(shì)真菌門和細(xì)菌門分別為子囊菌門（Ascomycota）和變形菌門（Proteobacteria）。根、莖、葉和果實(shí)中內(nèi)生真菌優(yōu)勢(shì)屬分別為Serendipita、Paramycosphaerella、多臂菌屬（Trichomerium）和Apiotrichum，內(nèi)生細(xì)菌優(yōu)勢(shì)屬分別為羅爾斯通菌屬（Ralstonia）、羅爾斯通菌屬、甲基桿菌屬（Methylobacterium）和弧菌屬（Vibrio）。線性判別分析（LEfSe）表明，除根外，明日葉的莖、葉和果實(shí)中內(nèi)生真菌重要差異指示種分別是Paramycosphaerella、蒼白尾孢屬（Pallidocercospora）和橫斷孢屬（Strelitziana）；莖、葉和果實(shí)中內(nèi)生細(xì)菌重要差異指示種分別是羅爾斯通菌屬、甲基桿菌屬和亮桿菌屬（Leucobacter）。經(jīng)FUNGuild和COG功能預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，不同組織內(nèi)生菌群功能豐富，除具有固氮、促生和抑菌等功能的菌群外，還存在較大比例未知功能菌群?！窘Y(jié)論】明日葉中蘊(yùn)含豐富多樣的內(nèi)生菌群，在不同組織中的群落結(jié)構(gòu)、多樣性、優(yōu)勢(shì)菌屬及差異指示種存在保守性與差異性，組織特征差異是影響內(nèi)生菌群的重要因素；不同組織內(nèi)生菌群生態(tài)功能亦差異較大，且大量為未鑒定出種屬和未定義的功能菌群。

關(guān)鍵詞：明日葉；內(nèi)生真菌；內(nèi)生細(xì)菌；多樣性；功能預(yù)測(cè)

中圖分類號(hào)：S567.239? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2023）06-1622-11

Community structure analysis of the endophyte in different

tissues of Angelica keiskei （Miq.） Koidz. based on

high-throughput sequencing

LIU Wen-wen1，2， ZHANG Xu3， HUANG Qi2， HU Lian-qing2， CHEN Lu2，

ZHOU Wan-hai1，2*， WEI Qin1， FENG Rui-zhang1*， ZHAO Xin1

（1Sichuan Cinnamomum longepaniculatum Engineering Technology Research Center， Yibin University，Yibin，

Sichuan? 644007， China； 2Faculty of Agriculture，F(xiàn)orestry and Food Engineering，Yibin University，Yibin，

Sichuan? 644007，China； 3School of Life Science， Hainan University，Haikou， Hainan? 570228，China）

Abstract：【Objective】The community structure and diversity of endophyte in different tissues of Angelica keiskei （Miq.）Koidz. was analyzed， to provide a theoretical basis to explore the interaction mechanism and functional strain screening of A. keiskei and endophyte. 【Method】The medicinal and edible plant A. keiskei， which was cultivated in Yibin， Sichuan， was taken as the object. The diversity of endophytic fungi and bacteria in the root， stem， leave and fruit tissues was examined by high-throughput sequencing using Illumina MiSeq. 【Result】According to the 97% sequence similarity， endophytic fungal and endophytic bacterial reads could be indentified into 1023 and 1871 operational taxonomic units（OTU）， respectively. A Venn diagram and a heatmap showed that there were fairly high community structure difference between endophytic fungi or endophytic bacteria in the four different parts of tissues of A. keiskei， and the abundances of populations differed. According to α diversity analysis， the variety of endophytic fungi in the leaves of A. keiskei was the most， the diversity of endophytic fungal community in the roots was the lowest， and the abundance of endophytic fungal community in the fruits was the lowest. The variety of endophytic bacteria in the roots of A. keiskei was the most， the diversity of endophytic bacterial community in the stems was the lowest， and the abundance of endophytic bacterial community in the fruits was the lowest. β diversity analysis showed that the characteristics of tissues had a significant effect on the community structure of the endophytic fungi or endophytic bacteria in A. keiskei. Ascomycota and Proteobacteria were the dominant fungal phylum and bacterial phylum in the four different parts of tissues of A. keiskei respectively. The dominant genera of endophytic fungi in the roots， stems， leaves and fruits were Serendipita， Paramycosphaerella， Trichomerium and Apiotrichum respectively， and the dominant genera of endophytic bacteria were Ralstonia， Methylobacterium and Vibrio respectively. Linear discriminant analysis showed that， the most important biomarkers of the endophytic fungi in the stems， leaves and fruits were Paramycosphaerella， Pallidocercospora and Strelitziana respectively. The most important biomarkers of endophytic bacteria in stems， leaves and fruits were Ralstonia， Methylobacterium and Leucobacter respectively. FUNGuild and COG functional predictions showed that the function of endophyte in different tissues was abundant， and there was a large proportion of unknown functional endophyte in addition to those that could fix nitrogen， promote growth and inhibit bacteria. 【Conclusion】There are abundant and diverse endophytes in A. keiskei. The community structure， diversity， dominant genera and biomarkers in different tissues are conservative and different， and the difference of tissue characteristics is an important factor affecting the endophyte. The ecological functions of endophyte in different tissues are also quite different， and a large number of species and functional endophyte are not identified.

Key words： Angelica keiskei（Miq.） Koidz.； endophytic fungi； endophytic bacteria； diversity； function prediction

Foundation items：Sichuan National Natural Science Foundation （2022NSFSC0176）；Application Project of Sichuan Science and Technology Department（2018JY0495）；High-level Innovation and Entrepreneurship Team Project of Yibin Science and Technology Bureau（2021YGC03）

0 引言

【研究意義】明日葉［Angelica keiskei （Miq.） Koidz.］屬傘形科當(dāng)歸屬草本植物，是一種經(jīng)濟(jì)價(jià)值極高的藥食兩用植物（Gong et al.，2020）。藥用植物的次生產(chǎn)物積累、藥用品質(zhì)和抗病等與組織內(nèi)微生物有復(fù)雜的作用關(guān)系，內(nèi)生菌能對(duì)宿主植物物質(zhì)循環(huán)和能量轉(zhuǎn)換過(guò)程中的信號(hào)識(shí)別、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因表達(dá)等產(chǎn)生顯著影響，從而促進(jìn)植物對(duì)營(yíng)養(yǎng)成分的吸收和代謝（蔡媛等，2021），部分內(nèi)生菌還可代謝產(chǎn)生與宿主相同或相似作用的天然活性成分，此特征已成為挖掘新型藥物的重要來(lái)源（郭文秀等，2022）。因此，開(kāi)展特色藥食兩用植物明日葉不同組織的內(nèi)生菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性研究，有助于揭示明日葉不同組織內(nèi)生菌群落結(jié)構(gòu)特征，且對(duì)挖掘可提高其有效成分含量的內(nèi)生菌資源及開(kāi)發(fā)促進(jìn)明日葉生長(zhǎng)、生物轉(zhuǎn)化和品質(zhì)提升的方法具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前已對(duì)蛇足石衫、黃精和白蘞等多種藥用植物內(nèi)生菌群落結(jié)構(gòu)、多樣性和組織分布特征等開(kāi)展了相關(guān)研究（Fan et al.，2020；李鑒濱等，2022），亦對(duì)內(nèi)生菌響應(yīng)宿主植物內(nèi)環(huán)境因子及調(diào)節(jié)宿主植物生長(zhǎng)、活性次生代謝物積累和分布進(jìn)行了分析（黃雪珍和趙龍飛，2023），發(fā)現(xiàn)內(nèi)生菌分布于植物器官或組織中，每個(gè)植物器官均代表內(nèi)生細(xì)菌群落特有的生態(tài)位。Dong等（2018）對(duì)中草藥三七不同部位的內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行多樣性分析，得出根部的慢生型大豆根瘤菌、鞘氨醇單胞菌和苯基桿菌等內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量均高于莖部和葉部。許國(guó)琪等（2021）發(fā)現(xiàn)青藏高原冰川棘豆不同組織間形成了保守性內(nèi)生細(xì)菌和特異性內(nèi)生真菌共存的群落結(jié)構(gòu)，為其不同組織適應(yīng)極端環(huán)境提供幫助。陳美琪等（2023）發(fā)現(xiàn)對(duì)虎耳草不同組織內(nèi)生真菌的多樣性指數(shù)均高于多數(shù)已報(bào)道的其他藥用植物，且根部?jī)?nèi)生真菌的多樣性明顯高于莖部和葉部。張麗芳等（2023）發(fā)現(xiàn)火棘根中內(nèi)生細(xì)菌物種最豐富，參與各種代謝調(diào)控的細(xì)菌豐度最高。關(guān)于明日葉的研究主要集中在栽培技術(shù)、活性物質(zhì)提取與鑒定及中藥藥性探析等方面。關(guān)于內(nèi)生菌，本課題組前期采用純培養(yǎng)法篩選明日葉不同器官可培養(yǎng)的內(nèi)生真菌和產(chǎn)黃酮菌株，淺析了明日葉不同組織內(nèi)生真菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性，但分離的菌株數(shù)量和類型較少，多樣性較低（劉雯雯等，2022）。大量研究表明傳統(tǒng)的平板分離法并不能真正反映內(nèi)生菌群落特征，高通量測(cè)序技術(shù)能提供更加可靠和深入的分析（陳美琪等，2023）?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】有關(guān)明日葉內(nèi)生細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)及組織差異尚缺乏系統(tǒng)的認(rèn)識(shí)?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】收集四川宜賓栽培的藥食兼用型明日葉的根、莖、葉和果實(shí)組織，基于高通量測(cè)序技術(shù)分析明日葉不同組織中內(nèi)生真菌和內(nèi)生細(xì)菌群落組成和多樣性，并比較內(nèi)生真菌和內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異，探究明日葉中特有的微生物資源及其功能，為探尋功能微生物資源和明日葉的功能開(kāi)發(fā)應(yīng)用，挖掘能合成或促進(jìn)植物活性產(chǎn)物的菌株資源提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)區(qū)概況

明日葉采樣點(diǎn)位于四川省宜賓市宜賓學(xué)院試驗(yàn)農(nóng)場(chǎng)（東經(jīng)104°59′76″，北緯28°47′77″）。屬中亞熱帶季風(fēng)濕潤(rùn)氣候，氣候溫和，熱量豐足，雨量充沛，光照適宜，冬暖春早，無(wú)霜期為347 d，年平均溫度17.5 ℃，年均降水量1070.4 mm。

1. 2 樣品采集和處理

在采集地選擇不同位點(diǎn)的5株3年生且長(zhǎng)勢(shì)良好的明日葉植株，將整棵植株挖出，盡量保持根系完整，立即放入內(nèi)置冰袋的冰盒內(nèi)運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室，用大量無(wú)菌水對(duì)明日葉植株表面和根系附著泥土進(jìn)行沖洗后，用無(wú)菌剪刀將不同位品按根、莖、葉和果實(shí)組織分開(kāi)。將不同位點(diǎn)每株明日葉不同組織的混合樣品作為一個(gè)生物學(xué)重復(fù)，共設(shè)3個(gè)重復(fù)。稱取50 g的各組織樣品于超凈工作臺(tái)中無(wú)菌水沖洗多次，再依次用75%乙醇（40 s）、3% NaClO（3 min）、75%乙醇（40 s）無(wú)菌化處理，最后無(wú)菌水洗滌3次，無(wú)菌濾紙吸干表面水分，置于-80 ℃超低溫冰箱中保存，用于明日葉內(nèi)生菌群落結(jié)構(gòu)分析。

1. 3 明日葉微生物DNA提取與測(cè)序

明日葉不同組織樣本的總基因組DNA使用FastDNA?SPIN Kit for Soil試劑盒進(jìn)行提取，借助1%瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)分別測(cè)定DNA提取質(zhì)量和DNA濃度、純度。PCR使用引物ITS1F（5'-CTTGGTCATTTAGAGGA AGTAA-3'）和ITS2R（5'-GCTGCGTTCTTCATCGAT GC-3'）對(duì)內(nèi)生真菌ITS1區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增；使用引物799F（5'-AACMGGATTAGATACCCKG-3'）和1193R（5'-AC GTCATCCCCACCTTCC-3'）對(duì)內(nèi)生細(xì)菌16S rDNA的V5～V7區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增。利用凝膠回收試劑盒（Gel Extraction Kit）對(duì)擴(kuò)增目標(biāo)片段切膠回收，2%瓊脂糖凝膠電泳和Quantus?熒光儀對(duì)產(chǎn)物檢測(cè)并定量，使用NEXTflexTM DNA-Seq Kit建庫(kù)。最后利用Illumina公司Miseq PE300平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。上述工作均委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

1. 4 測(cè)序數(shù)據(jù)處理

將測(cè)序獲得的數(shù)據(jù)過(guò)濾去除引物和接頭序列、非特異性擴(kuò)增序列和嵌合體，得到有效序列用于進(jìn)一步分析。按照97%相似水平進(jìn)行操作分類單元（Operation taxonomic unit，OTU）聚類，利用R軟件繪制韋恩圖后展開(kāi)OTU聚類分析。α多樣性指數(shù)包括Shannon指數(shù)（反映內(nèi)生菌群落多樣性）和Chao1指數(shù)（反映內(nèi)生菌群落豐富度）。通過(guò)對(duì)OTU數(shù)據(jù)分析，利用柱狀圖統(tǒng)計(jì)樣本中內(nèi)生真菌和內(nèi)生細(xì)菌在門和屬水平上群落結(jié)構(gòu)的分類學(xué)組成，確定優(yōu)勢(shì)菌門和優(yōu)勢(shì)菌屬?；谥饕狾TU豐度信息繪制熱圖，反映不同樣本間物種分布的相似性和差異性。在ANOSIM組間差異檢驗(yàn)下進(jìn)行NMDS分析，用于判斷分組是否有意義。根據(jù)分類學(xué)組成對(duì)樣本進(jìn)行線性判別分析（LEfSe），找出對(duì)樣本劃分產(chǎn)生顯著性差異影響的群落或物種。使用FUNGuild和EggNOG數(shù)據(jù)庫(kù)分別預(yù)測(cè)內(nèi)生真菌和內(nèi)生細(xì)菌的功能，統(tǒng)計(jì)內(nèi)生真菌Trophic Mode（營(yíng)養(yǎng)方式）和Guild（功能分組）豐度結(jié)果，比對(duì)內(nèi)生細(xì)菌OTU的COG家族信息。

1. 5 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0和Excel 2007進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。利用上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司的I-sanger云數(shù)據(jù)分析平臺(tái)進(jìn)行在線數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 明日葉植物內(nèi)生菌OTU數(shù)量

明日葉內(nèi)生真菌OTUs總數(shù)為1023個(gè)，其中根、莖、葉和果實(shí)分別含有210、210、426和177個(gè)，4個(gè)組織共有內(nèi)生真菌OTUs 29個(gè)；葉部特有OTUs數(shù)量最多，為249個(gè)，莖部次之，果實(shí)特有OTUs數(shù)量最少，僅54個(gè)（圖1-A）。明日葉各組織內(nèi)生細(xì)菌共獲得1871個(gè)OTUs，其中根、莖、葉和果實(shí)分別含有1114、243、298和216個(gè)，4個(gè)組織共有內(nèi)生細(xì)菌OTUs 55個(gè)；根特有OTUs數(shù)量最多，為884個(gè)，其次是葉116個(gè)，莖最少，僅41個(gè)（圖1-B）。

2. 2 明日葉植物內(nèi)生菌α和β多樣性

2. 2. 1 內(nèi)生真菌α多樣性 測(cè)序共獲得247037條內(nèi)生真菌有效序列，平均測(cè)序覆蓋率達(dá)99.962%。由Shannon指數(shù)箱式圖（圖2-A）可知，明日葉的根與莖、根與葉差異極顯著（P<0.01，下同），其他組織間無(wú)顯著差異（P>0.05，下同），Shannon指數(shù)大小依次是葉>莖>果實(shí)>根；Chao1指數(shù)箱式圖（圖2-B）顯示葉與其他3個(gè)組織間均差異極顯著，Chao1指數(shù)大小依次為葉>莖>根>果實(shí)。說(shuō)明葉部?jī)?nèi)生真菌群落多樣性和豐富度均最好。

2. 2. 2 內(nèi)生細(xì)菌α多樣性 測(cè)序共獲得87178條內(nèi)生細(xì)菌有效序列，平均測(cè)序覆蓋率為99.808%。結(jié)合Shannon指數(shù)和Chao1指數(shù)箱式圖（圖3）可知，明日葉根的Shannon指數(shù)與其他組織間均差異極顯著，而其他組織間無(wú)顯著性差異；果實(shí)的Chaol指數(shù)與根和葉間差異顯著（P<0.05，下同）。因此，在Shannon指數(shù)上各組織排序依次是根>葉>果實(shí)>莖，Chao1指數(shù)大小依次為根>葉>莖>果實(shí)。說(shuō)明根部?jī)?nèi)生細(xì)菌的群落多樣性和豐富度均最好，葉部其次。

2. 2. 3 內(nèi)生菌β多樣性 基于ANOSIM組間差異檢驗(yàn)的NMDS分析表明，組織間內(nèi)生真菌OTU（R=0.4815，P=0.007）和內(nèi)生細(xì)菌OTU（R=0.7407，P=0.002）均存在極顯著差異（圖4）。Stress主要用于檢驗(yàn)NMDS分析結(jié)果的優(yōu)劣，通常認(rèn)為Stress<0.1時(shí)，不同樣本具有一個(gè)好的排序，內(nèi)生真菌NMDS分析Stress=0.090，內(nèi)生細(xì)菌Stress=0.073，因此在內(nèi)生真菌和內(nèi)生細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)的差異分析中，分組是一個(gè)好的排序。

2. 3 明日葉植物內(nèi)生菌組成分析

在門、屬分類水平上對(duì)明日葉不同組織內(nèi)生菌進(jìn)行群落組成和相對(duì)豐度分析，由于許多物種占比小，未有代表意義，因此將相對(duì)豐度<1%的物種歸于其他類（others）。

2. 3. 1 內(nèi)生真菌組成 700個(gè)內(nèi)生真菌OTUs比對(duì)到7個(gè)門和228個(gè)屬。在門水平上，根部菌門數(shù)最多，為6個(gè)（表1）。由圖5可知，子囊菌門（Ascomycota）在根、莖、葉和果實(shí)組織中均占主要優(yōu)勢(shì)，其中在葉部占比最高；而其他類門（p_others）和擔(dān)子菌門（Basidiomycota）在果實(shí)占比均高于根、莖和葉，未知真菌門（p_unclassified Fungi）在莖中相對(duì)占比最多。在屬分類水平上，根有81個(gè)菌屬，未知真菌屬（g_unclassified Fungi）、g_unclassified Dictyosporiaceae、Serendipita、Campylospora、Codinaea、子囊菌門未分類菌屬（g_unclassified Ascomycota）和g_unclassified Tremellodendropsidales 等7個(gè)菌屬的相對(duì)豐度占比大于3.00%，其他類屬（g_others）占比5.51%；莖有93個(gè)菌屬，未知真菌屬、Paramycosphaerella、g_unclassified Trichomeriaceae、多臂菌屬（Trichomerium）、子囊菌門未分類菌屬、橫斷孢屬（Strelitziana）和枝孢屬（Cladosporium）等7個(gè)菌屬的相對(duì)豐度占比大于3.00%，其他類屬占比11.79%；葉有156個(gè)菌屬，g_unclassified Trichomeriaceae、多臂菌屬、橫斷孢屬、枝孢屬和未知真菌屬等5個(gè)菌屬的相對(duì)豐度占比大于3.00%，其他類屬占比11.99%；果實(shí)有81個(gè)菌屬，Apiotrichum、g_unclassified Trichomeriaceae、橫斷孢屬、多臂菌屬、鏈格孢屬（Alternaria）、枝孢屬和未知真菌屬等7個(gè)菌屬的相對(duì)豐度占比大于3.00%，其他類屬占比9.78%。4個(gè)組織共有內(nèi)生真菌屬32個(gè)，占總屬類的14.03%（圖6）。

2. 3. 2 內(nèi)生細(xì)菌組成 1393個(gè)內(nèi)生細(xì)菌OTUs比對(duì)到30個(gè)門和550個(gè)屬（表2）。由圖7可知，在門分類水平上，變形菌門（Proteobacteria）在根、莖、葉和果實(shí)中占主要優(yōu)勢(shì)。擬桿菌門（Bacteroidetes）、衣原體門（Chlamydiae）、綠彎菌門（Chloroflexi）、Dependentiae及其他類菌門在根中相對(duì)占比均最高；放線菌門（Actinobacteria）、異常球菌—棲熱菌門（Deinococcus-Thermus）在葉中相對(duì)占比最多；厚壁菌門（Firmicutes）在果實(shí)的相對(duì)占比均高于其他組織；而酸桿菌門（Acidobacteria）在莖中相對(duì)占比最高。在屬分類水平上，根有454個(gè)菌屬，僅羅爾斯通菌屬（Ralstonia）和短根瘤菌屬（Bradyrhizobium）2個(gè)菌屬相對(duì)豐度占比大于3.00%，其他類屬占比52.66%；莖有172個(gè)菌屬，羅爾斯通菌屬、弧菌屬（Vibrio）、紅球菌屬（Rhodococcus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、甲基桿菌屬（Methylobacterium）、伯克氏科未分類菌屬（g_unclassified Burkholderiaceae）、Aureimonas和鞘脂單胞菌屬（Sphingomonas）等8個(gè)菌屬的相對(duì)豐度占比大于3.00%，其他類屬占比18.54%；葉有169個(gè)菌屬，甲基桿菌屬、鞘脂單胞菌屬、異常球菌屬（Deinococcus）、胺桿菌屬（Amnibacterium）、紅球菌屬和馬賽菌屬（Massilia）6個(gè)菌屬相對(duì)豐度占比大于3.00%，其他類屬占比10.50%；果實(shí)有147個(gè)菌屬，弧菌屬、Ruegeria、甲基桿菌屬、羅爾斯通菌屬、亮桿菌屬（Leucobacter）和紅球菌屬等6個(gè)菌屬相對(duì)豐度占比大于3.00%，其他類屬占比11.81%。4個(gè)組織共有內(nèi)生細(xì)菌屬58個(gè)，占總屬類的10.55%（圖8）。

2. 3. 3 內(nèi)生菌群落結(jié)構(gòu)熱圖分析 對(duì)明日葉不同組織內(nèi)生真菌和內(nèi)生細(xì)菌測(cè)序所得的OTU結(jié)果在屬水平上進(jìn)行分類，并利用相對(duì)豐度信息繪制熱圖，選取在屬水平上前30的物種進(jìn)行聚類分析（圖9），在內(nèi)生真菌方面，葉和果實(shí)聚為一類，而對(duì)于內(nèi)生細(xì)菌，莖和果實(shí)聚為一類。根與其他3個(gè)組織的菌群物種組成和物種豐度差距均最大。

2. 4 明日葉不同組織內(nèi)生菌群落差異性

采用LEfSe分析方法進(jìn)行明日葉不同組織內(nèi)生菌差異顯著分析，尋找具有差異的生物標(biāo)識(shí)（Biomarker）。設(shè)置LDA閾值為4，從圖10-A可看出，除根外，Paramycosphaerella是莖中起重要作用的內(nèi)生真菌類群；散囊菌綱（Eurotiomycetes）、刺盾炱目（Chaetothyriales）、Trichomeriaceae、蒼白尾孢屬（Pallidocercospora）、多臂菌屬、擲孢酵母屬、莖點(diǎn)霉屬、亞隔孢殼科未分類菌屬（g_unclassified Didymellaceae）、煤炱目未分類菌科（f_unclassified Capnodiales）和煤炱目未分類菌屬（g_unclassified Capnodiales）是葉中起重要作用的內(nèi)生真菌類群；橫斷孢屬和刺盾炱目的fam_Incertae_sedis科是果中起重要作用的內(nèi)生真菌類群。從圖10-B可知，根中起重要作用的內(nèi)生細(xì)菌類群是擬桿菌綱（Bacteroidia）、擬桿菌門、黃單胞菌目（Xanthomonadales）、黃單胞菌科（Xanthomonadaceae）、生絲微菌科（Hyphomicrobiaceae）和Gaiellaceae；莖中起重要作用的內(nèi)生真菌類群是γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria）、羅爾斯通菌屬、假單胞菌目（Pseudomonadales）、假單胞菌科（Pseudomonadaceae）、假單胞菌屬和黃桿菌目（Flavobacteriales）；葉中起重要作用的內(nèi)生細(xì)菌類群是甲基桿菌屬、鞘脂單胞菌目（Sphingomonadales）、鞘脂單胞菌科（Sphingomonadaceae）和鞘脂單胞菌屬；果實(shí)中起重要作用的內(nèi)生細(xì)菌類群是微球菌目（Micrococcales）和亮桿菌屬。

2. 5 明日葉內(nèi)生菌菌群功能組成

2. 5. 1 內(nèi)生真菌 通過(guò)FUNGuild數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)生真菌群落功能預(yù)測(cè)（圖11）可知，從營(yíng)養(yǎng)類型看，腐生型（57.67%）、未知（29.79%）和共生型（10.42%）在根組織中占比較大；莖中未知型（35.36%）、腐生—病理寄生型（30.89%）和共生型（13.01%）占優(yōu)勢(shì)；葉中共生型（52.33%）、病理寄生型（14.49%）和腐生—共生—病理寄生型（9.17%）占比較高；果實(shí)中共生型（28.04%）、腐生型（26.19%）、病理寄生型（16.96%）和腐生—共生—病理寄生型（12.21%）具有優(yōu)勢(shì)。根據(jù)Guild分類，又分為植物病原菌、附生真菌、植物內(nèi)生菌、土壤腐生菌、蘭花類菌根真菌、植物腐生菌—木腐菌等17種。除未知腐生菌和未定義功能外，根中菌根真菌（15.05%），莖中植物病原菌—未定義腐生菌（24.14%）和附生真菌（12.55%），葉中植物病原菌（14.48）、附生真菌（32.99%）和內(nèi)生菌（19.27%），以及果實(shí)中植物病原菌（16.36%）、附生真菌（16.78%）和土壤腐生菌（21.55%）功能菌群在各組織Guild分類中的占比均超過(guò)10.00%。

2. 5. 2 內(nèi)生細(xì)菌 通過(guò)比對(duì)EggNOG數(shù)據(jù)庫(kù)得到24種COG功能，包括RNA加工和修飾（A），染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和動(dòng)態(tài)變化（B），能量產(chǎn)生與轉(zhuǎn)換（C），細(xì)胞循環(huán)調(diào)控、細(xì)胞分裂、染色體分裂（D），氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝（E），核苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝（F），碳水化合物的運(yùn)輸和代謝（G），輔酶轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝（H），脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝（I），翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物合成（J），翻譯（K），復(fù)制、重建和修復(fù)（L），細(xì)胞壁/細(xì)胞膜/膜結(jié)構(gòu)的生物合成（M），細(xì)胞活力（N），翻譯后修飾、蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)、伴侶（O），無(wú)機(jī)離子轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝（P），次生代謝產(chǎn)物的合成、轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝（Q），一般功能預(yù)測(cè)（R），未知功能基因家族（S），信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制（T）、細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)、分泌和液泡運(yùn)輸（U）、防御機(jī)制（V）、細(xì)胞外結(jié)構(gòu)（W），以及細(xì)胞骨架（Z），其豐度隨組織的不同而異。明日葉不同組織內(nèi)生細(xì)菌COG功能組成分析顯示，根中排名前10的COG功能分布是S>E>R>C>K>M>T>P>G>L，莖中S>E>R>C>K>P>T>M>G>J，葉中S>E>R>C>K>P>G>M>T>I，果實(shí)中S>E>R>K>C>G>P>M>J>T。在明日葉根（2.58%）、莖（2.59%）、葉（2.94%）、果實(shí)（2.29%）組織中Q相關(guān)基因均有表達(dá)。

3 討論

3. 1 不同組織中內(nèi)生菌多樣性和豐富度的差異分析

相關(guān)研究認(rèn)為，宿主植物群落多樣性受植物種類及同種植物不同組織的結(jié)構(gòu)、功能和特有化學(xué)成分等因素影響（Deng et al.，2019）。通過(guò)對(duì)冰川棘豆內(nèi)生菌多樣性研究可知，內(nèi)生真菌和內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性存在差異（許國(guó)琪等，2021）；對(duì)蛇足石杉內(nèi)生真菌的研究（Fan et al.，2020）發(fā)現(xiàn)，其葉部具有相對(duì)莖和根組織更為豐富的內(nèi)生菌群落組成。本研究中，明日葉4個(gè)不同組織均定殖豐富的內(nèi)生真菌和內(nèi)生細(xì)菌，但其分布存在器官組織差異性，葉中也表現(xiàn)出較高的內(nèi)生真菌群落多樣性和豐富度，根部最低，而根中內(nèi)生細(xì)菌群落多樣性和豐富度最高。究其原因，可能葉部除來(lái)源于莖部真菌外，較大的表面積利于來(lái)自空氣、水分或其他生物的真菌附著并進(jìn)入植物體，植物光合作用產(chǎn)生的豐富營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)也為真菌共生創(chuàng)造優(yōu)越條件。但也有研究發(fā)現(xiàn)根中具有最高的內(nèi)生真菌豐富度和多樣性（Wang et al.， 2022），可能與宿主種類、生長(zhǎng)環(huán)境不同有關(guān)，還應(yīng)做進(jìn)一步研究。有報(bào)道得出中藥石蓮根部?jī)?nèi)生細(xì)菌的多樣性和豐富度顯著高于葉和莖（Huo et al.，2020），可能由于內(nèi)生細(xì)菌常以根際土壤微生物為起點(diǎn)，經(jīng)根部表面和內(nèi)部開(kāi)始定殖，隨著蒸騰作用沿著維管束向莖部和葉部遷移，且微生物對(duì)根部浸染程度強(qiáng)于地面部分，從而導(dǎo)致根部?jī)?nèi)生細(xì)菌群落多樣性高于其他組織。

3. 2 不同組織中內(nèi)生菌的群落組成分析

通過(guò)聚類熱圖分析，明日葉的根、莖、葉和果實(shí)微生物菌群組成差異較大，但莖、葉和果實(shí)組織內(nèi)生真菌和內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相近，由于三者發(fā)育來(lái)源均屬于地面組織，可能是三者內(nèi)生菌結(jié)構(gòu)更為類似的原因，說(shuō)明明日葉組織是影響其內(nèi)生菌種群結(jié)構(gòu)與多樣性變化因素之一。

白蘞、蛇足石杉等藥用植物的內(nèi)生菌中子囊菌門為優(yōu)勢(shì)類群（Fan et al.，2020；李鑒濱等，2022），子囊菌門是真菌中種類最多的類群，占真菌總數(shù)的40%，可能與奠基者效應(yīng)及其遺傳特性有關(guān)（張淼等，2020），且在根際土壤、藏茶、葡萄表皮等中均占比較高。本研究中子囊菌門亦為不同組織內(nèi)生真菌優(yōu)勢(shì)菌門，該門類中大多數(shù)為腐生菌，具有較強(qiáng)的物質(zhì)分解和合成能力，在養(yǎng)分循環(huán)中起著重要作用（張愛(ài)梅等， 2021），是最易與植物互惠共生的門類，因此該菌門對(duì)明日葉不同組織的養(yǎng)分循環(huán)和代謝具有意義。高通量測(cè)序的明日葉不同組織優(yōu)勢(shì)菌屬與純培養(yǎng)內(nèi)生真菌結(jié)果有較大差異（劉雯雯等，2022），說(shuō)明傳統(tǒng)培養(yǎng)法解析植物內(nèi)生真菌群落多樣性的深度與高通量技術(shù)有較大差別。此外，莖、葉和果實(shí)共有的多臂菌屬具有促進(jìn)宿主植物產(chǎn)生藥用價(jià)值物質(zhì)的作用（Nassal et al.，2018）。僅存在于根中的Serendipita能產(chǎn)生促進(jìn)宿主互作的效應(yīng)分子（Mahdi et al.，2022）。Campylospora、橫斷孢屬和Apiotrichum等菌屬可合成有用的生物活性物質(zhì)或?qū)闹髦参锞哂兄匾纳鷳B(tài)效應(yīng)。本研究中仍有一些OTU序列在不同的分類水平上未被注釋分類，表明明日葉體內(nèi)還蘊(yùn)含有大量未知的內(nèi)生真菌，有待深入研究。

明日葉4個(gè)組織中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門類為變形菌門。變形菌門是植物內(nèi)部存在的最廣泛的細(xì)菌門類，物種和遺傳多樣性豐富，具有生物固氮、病蟲害防治和土壤修復(fù)等輔助作用，莼菜嫩芽、莖和葉（張秋玉等， 2022）及甜櫻桃（趙柏霞和閆建芳，2022）不同組織內(nèi)生細(xì)菌分析均發(fā)現(xiàn)，優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門類為變形菌門，且變形菌門豐度越高，組織內(nèi)碳氮養(yǎng)分及有機(jī)質(zhì)含量就越多。放線菌門、厚壁菌門和擬桿菌門是促進(jìn)生物進(jìn)化、挖掘農(nóng)用抗生素菌群的重要種質(zhì)資源來(lái)源，其在明日葉中占比也較高。此外，本研究利用高通量測(cè)序結(jié)果注釋到的一些具有不同功能的優(yōu)勢(shì)菌或核心種，如假單胞菌屬的某些菌株可分泌生長(zhǎng)素和抗生素，作為生物防治菌（王紅瑩等， 2021）。羅爾斯通菌屬具有碳固定和能量利用的代謝特點(diǎn)。馬賽菌屬?gòu)V泛存在于水體、植物根際和葉際等環(huán)境中，具有分泌生長(zhǎng)素和酶、增強(qiáng)植物抗逆性、耐受重金屬等功能（陳翔，2021）。分布于根中的短根瘤菌屬具有固氮作用；葉中甲基桿菌屬和鞘脂單胞菌屬具有促生和抑制病原體的作用，表明組織特征是影響明日葉內(nèi)生菌群落結(jié)構(gòu)的重要因素，明日葉不同組織內(nèi)生菌的種類、豐度和功能有較大差異。同時(shí)，明日葉組織中還存在大量未被注釋的微生物類群，可為挖掘促生、抗逆及醫(yī)藥等有重要應(yīng)用價(jià)值的新種提供基礎(chǔ)。

3. 3 不同組織內(nèi)生菌功能預(yù)測(cè)分析

內(nèi)生真菌與植物宿主的演化選擇過(guò)程中，為應(yīng)對(duì)植物不同時(shí)期、不同組織的生理狀態(tài)，具備共生、腐生和寄生生存策略，并發(fā)揮自生重要的生態(tài)作用，而內(nèi)生細(xì)菌通過(guò)與宿主植物間基因的橫向轉(zhuǎn)移，參與宿主關(guān)鍵的生命活動(dòng)（孫紅敏等，2016）。本研究利用FUNGuild對(duì)內(nèi)生真菌群落營(yíng)養(yǎng)模式和功能分析發(fā)現(xiàn)，不同組織中未知營(yíng)養(yǎng)型和功能型均占比較大，說(shuō)明FUNGuild數(shù)據(jù)庫(kù)解析不全面，也反映出明日葉存在大量待挖掘的內(nèi)生真菌資源。根中腐生型功能群較高，可能因?yàn)楦佑|土壤，根際土壤中腐生真菌種類多，腐生真菌進(jìn)入根中成為內(nèi)生真菌的概率更高，同時(shí)腐生真菌可產(chǎn)生氧化酶和水解酶，利于碳水化合物的分級(jí)，與養(yǎng)分循環(huán)密切相關(guān)（寧琪等，2022）。莖中病理腐生型功能群較多，葉和果實(shí)中共生型功能群占比較高，可能由于植物內(nèi)生真菌在不同組織中發(fā)揮不同功能，導(dǎo)致不同組織優(yōu)勢(shì)功能類群分布不同。針對(duì)內(nèi)生細(xì)菌功能，氨基酸運(yùn)輸與代謝和能量產(chǎn)生與轉(zhuǎn)換的相關(guān)基因在各組織中均占比較高，為各組織提供基礎(chǔ)保障；葉組織無(wú)機(jī)離子運(yùn)輸與代謝相關(guān)基因比其他組織高，可能與葉活動(dòng)功能代謝快有關(guān)。次生代謝產(chǎn)物是內(nèi)生菌發(fā)揮功能作用的物質(zhì)基礎(chǔ)（李盼盼等，2018），明日葉不同組織中均存在一定比例的次生代謝產(chǎn)物生物合成、分解代謝相關(guān)基因，為微生物參與宿主植物代謝提供可能。

4 結(jié)論

明日葉中蘊(yùn)含豐富多樣的內(nèi)生菌群，在不同組織中的群落結(jié)構(gòu)、多樣性、優(yōu)勢(shì)菌屬及差異指示種存在保守性與差異性，組織特征差異是影響內(nèi)生菌群的重要因素；不同組織內(nèi)生菌群生態(tài)功能亦差異較大，且大量為未鑒定出種屬和未定義的功能菌群。

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（責(zé)任編輯 鄧慧靈）

收稿日期：2023-04-15

基金項(xiàng)目：四川省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2022NSFSC0176）；四川省科學(xué)技術(shù)廳應(yīng)用基礎(chǔ)項(xiàng)目（2018JY0495）；宜賓市科技局高端創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（2021YGC03）

通訊作者：周萬(wàn)海（1979-），https：//orcid.org/0000-0002-8013-0029，博士，副教授，主要從事農(nóng)業(yè)資源開(kāi)發(fā)利用研究工作，E-mail：wanhaizhou@126.com；馮瑞章（1978-），https：//orcid.org/0000-0002-1601-5843，博士，教授，主要從事微生物資源開(kāi)發(fā)利用研究工作，E-mail：ruizhangfeng@126.com

第一作者：劉雯雯（1991-），https：//orcid.org/0000-0002-8659-430X，主要從事微生物學(xué)研究工作，E-mail：965501606@qq.com