松蘿提取物對膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠高遷移率族蛋白B1介導(dǎo)的細(xì)胞自噬及炎癥因子的影響

文紅　安陽　張軍　徐暉　陸道敏　曹躍朋　寧喬怡　王瑩

【摘 要】目的：研究松蘿提取物對膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎（CIA）大鼠滑膜細(xì)胞中凋亡相關(guān)因子的影響，進(jìn)一步探討松蘿提取物對CIA大鼠關(guān)節(jié)炎癥及高遷移率族蛋白B1（HMGB1）介導(dǎo)的細(xì)胞自噬的影響。

方法：將54只Wistar雌性大鼠隨機(jī)分為空白對照組，模型對照組，羥氯喹組，松蘿提取物低、中、高劑量組，每組9只。松蘿提取物低、中、高劑量組給藥劑量分別為2 mg·kg-1、6 mg·kg-1、54 mg·kg-1，羥氯喹組給藥劑量為36 mg·kg-1。建立CIA大鼠模型后，連續(xù)灌胃給藥28 d。ELISA法檢測血清中HMGB1、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的濃度，RT-PCR檢測HMGB1、Beclin1、PI3K C3 mRNA的表達(dá)，Western Blot法檢測HMGB1、Beclin1、PI3K C3蛋白表達(dá)。結(jié)果：與空白對照組比較，各模型組HMGB1、TNF-α、IL-1β含量均增高，HMGB1、PI3K C3蛋白表達(dá)上升，Beclin1蛋白表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；與模型對照組比較，松蘿提取物中、高劑量組和羥氯喹組HMGB1、TNF-α、IL-1β含量均降低，且HMGB1、PI3K C3蛋白表達(dá)下降，Beclin1蛋白表達(dá)上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。結(jié)論：松蘿提取物通過上調(diào)Beclin1蛋白，下調(diào)HMGB1、PI3K C3相關(guān)蛋白的表達(dá)，調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬，降低CIA大鼠血清中HMGB1、IL-1β、TNF-α濃度，減輕關(guān)節(jié)炎癥。

【關(guān)鍵詞】 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎；松蘿提取物；膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎；高遷移率族蛋白B1；關(guān)節(jié)炎癥；自噬；大鼠

Effects of Usnea Extract on Cell Autophagy and Inflammatory Factors Mediated by High Mobility Group Protein B1 in Collagen Induced Arthritis RatsWEN Hong，AN Yang，ZHANG Jun，XU Hui，LU Dao-min，CAO Yue-peng，NING Qiao-yi，WANG Ying

【ABSTRACT】Objective：To study the effect of Usnea extract on apoptosis related factors in synovial cells of collagen induced arthritis（CIA）rats，and further explore its effect on joint inflammation and high mobility group protein B1（HMGB1）mediated cell autophagy in CIA rats.Methods：Fifty-four female Wistar rats were randomly divided into a blank control group，a model control group，a hydroxychloroquine group，and low，medium，and high dose groups of Usnea extract，with 9 rats in each group.The low，medium，and high dose groups of Usnea extract were administered with doses of 2 mg·kg-1，6 mg·kg-1，54 mg·kg-1，respectively，while the hydroxychloroquine group was administered with dose of 36 mg·kg-1.After establishing a CIA rat model，the drug was continuously administered by gavage for 28 d.ELISA method was used for detecting the concentration of HMGB1，IL-1β and TNF-α;RT-PCR was used to detect the expression of HMGB1，Beclin1 and PI3K C3 mRNA;and WB method was used to detect the the protein expression levels of HMGB1，Beclin1，and PI3K C3.

Results：Compared with the blank control group，the content of HMGB1，TNF- α and IL-1β in each model group increased，the protein expression of HMGB1 and PI3K C3 increased，while the protein expression of Beclin1 decreased，with a statistically significant difference（P < 0.05）.Compared with the model control group，the content of HMGB1，TNF-α and IL-1β in the middle and high dose groups of Usnea extract and the hydroxychloroquine group decreased，the content decreased，and the protein expression of HMGB1 and PI3K C3 decreased，while the protein expression of Beclin1 increased，with a statistically significant difference（P < 0.05）.Conclusion：Usnea extract up-regulates Beclin1 protein，down-regulates the expression of HMGB1 and PI3K C3 related proteins，regulates cell autophagy，and reduces the concentration of HMGB1，IL-1β and TNF-α in serum of CIA rats，and reduces joint inflammation.

【Keywords】 rheumatoid arthritis;Usnea extract;collagen induced arthritis;HMGB1;joint inflammation;

autophagy;rats

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以滑膜炎為主要病理改變的自身免疫性疾病。當(dāng)機(jī)體受到外界刺激，滑膜細(xì)胞從正常的4層增生到10層以上［1］，并伴隨大量促炎因子釋放，導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨和骨質(zhì)破壞［2］。相關(guān)研究表明，核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）信號通路的阻斷可影響滑膜細(xì)胞的凋亡與炎性反應(yīng)［3］。高遷移率族蛋白B1（HMGB1）作為一種促炎介質(zhì)，參與調(diào)控細(xì)胞自噬，調(diào)節(jié)炎癥通路，促進(jìn)炎癥損傷，在RA關(guān)節(jié)損傷過程中具有十分重要的作用［4］。RA在侗醫(yī)學(xué)屬于“風(fēng)濕痛”，侗醫(yī)藥松蘿有除濕通絡(luò)、清熱解毒之功，用于治療風(fēng)濕痹痛、跌打損傷。課題組前期以松蘿、虎杖組方，能夠降低RA患者炎癥活動(dòng)，改善臨床癥狀［5］。本文通過研究松蘿提取物對膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎（CIA）大鼠細(xì)胞自噬及對炎癥因子的影響，探討松蘿提取物調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬及抑制關(guān)節(jié)炎癥的作用機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級5周齡Wistar雌性大鼠

54只，體質(zhì)量150～180 g，購自長沙市天勤生物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號SCXK（湘）2019-0013，分籠飼養(yǎng)于貴州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，喂養(yǎng)環(huán)境室溫20～25 ℃，濕度70%左右，自由進(jìn)食、自由飲水，適應(yīng)環(huán)境1周后開始實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 松蘿提取物（江蘇采薇生物科技有限公司，CAS125-46-2）；硫酸羥氯喹片（上海上藥中西制藥有限公司，CAS118-42-3）。按實(shí)驗(yàn)需求配置成含藥混懸液，冷藏保存。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 磷酸酶抑制劑（碧云天，批號S1873）；RIPA裂解液（碧云天，批號P0013B）；BCA蛋白濃度測定試劑盒（碧云天，批號P0010）；PVDF膜（Millipore，批號IPVH00010）；兔多抗PI3K（Bioss，批號bs-20611R）；兔多抗RAGE（Bioss，批號bs-4999R）；兔多抗Beclin1（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，批號11306-1-AP）；兔多抗HMGB1（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，批號10829-1-AP）；兔多抗Bcl-2（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，批號26593-1-AP）；影定影試劑盒（天津市漢中攝影材料廠）；ECL底物液（北京普利萊基因技術(shù)有限公司，批號P1050）；HMGB1檢測試劑盒（武漢優(yōu)爾生商貿(mào)有限公司，批號SEA399Ra）；大鼠白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）ELISA試劑盒（欣博盛，批號ERC007.48）；大鼠腫瘤壞死因子-α（TNF-α）ELISA試劑盒（欣博盛，批號ERC102a.48）；Trizol試劑（Aidlab，批號252250AX）；dNTP（TINGEN，批號P4325）；Taq Plus DNA 聚合酶（TIANGEN，批號ET105-01）等。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器 垂直電泳槽（北京六一儀器廠，型號DYCZ-24DN）；酶標(biāo)儀（Thermo，型號Multskan MK3）；離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司，型號H1650）；微型高速離心機(jī)（美國Labnet，型號C2500-R-230V）；電熱恒溫培養(yǎng)箱（日本ASONE，型號ICV-450）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（ABI，型號QuantStudio 6）；水平電泳儀（北京君意東方電泳設(shè)備有限公司，型號JY300）；紫外分析儀（北京君意東方電泳設(shè)備有限公司，型號JY02S）；PCR檢測儀（東勝創(chuàng)新生物科技有限公司，型號EDC-810）；電熱恒溫水浴鍋（北京市長風(fēng)儀器儀表有限公司，型號HW-SY11-KP2）；分光光度計(jì)（上海舜宇恒科學(xué)儀器有限公司，型號752）等。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 CIA模型建立與分組 54只SPF級Wistar大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，隨機(jī)選取9只作為空白對照組，其余均建立CIA大鼠模型，將0.1 mol·L-1的醋酸與Ⅱ型膠原溶解成2 mg·mL-1溶液，4 ℃保存，再與等體積完全弗氏佐劑混合，乳化配制成Ⅱ型膠原乳劑，在尾根部皮內(nèi)進(jìn)行多點(diǎn)注射，每只大鼠給予0.1 mLⅡ型膠原乳劑［6］。于第7天和第14天，按照同樣方法再次加強(qiáng)誘導(dǎo)1次；待關(guān)節(jié)紅腫開始評分，具體參照評分標(biāo)準(zhǔn)［7］：0分，無紅腫；1分，小趾關(guān)節(jié)紅斑或輕度腫脹；2分，趾關(guān)節(jié)和跖趾關(guān)節(jié)中度腫脹；3分，踝關(guān)節(jié)以下足爪腫脹；4分，包括踝關(guān)節(jié)在內(nèi)均腫脹。計(jì)算四肢關(guān)節(jié)的得分總和為該大鼠所得積分，> 4分為造模成功。造模成功后隨機(jī)分為模型對照組，羥氯喹組，松蘿提取物低、中、高劑量組［8］。

2.2 動(dòng)物給藥 根據(jù)大鼠體質(zhì)量計(jì)算給藥量，羥氯喹組按36 mg·kg-1給予羥氯喹藥液灌胃（參照60 kg成人臨床每日用量400 mg），松蘿提取物低劑量組給予2 mg·kg-1松蘿藥液灌胃，松蘿提取物中劑量組給予6 mg·kg-1松蘿藥液灌胃，松蘿提取物高劑量組給予54 mg·kg-1松蘿藥液灌胃［9-10］（參照60 kg成人臨床每日用量5～15 g，CIA大鼠取6 mg·kg-1為中劑量，其1/3為低劑量，9倍為高劑量），空白對照組、模型對照組給予等量生理鹽水灌胃。每日灌胃1次，連續(xù)給藥28 d。

2.3 標(biāo)本取材 末次灌胃結(jié)束后，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的烏拉坦［0.4 mL·（100 g）-1］麻醉大鼠，予以腹主動(dòng)脈取血，以普通采血管收集血清，再于大鼠踝關(guān)節(jié)剝除皮膚取滑膜組織放入EP管。

2.4 電鏡檢測 取滑膜組織后，稱取質(zhì)量，將待觀察細(xì)胞經(jīng)離心、洗滌、戊二醛固定、鋨酸固定、丙酮梯度脫水、浸泡、包埋、修塊、定位、切片、染色后，在透射電鏡下觀察細(xì)胞自噬小體和自噬泡的形成。

2.5 RT-PCR法檢測 采用TRIzol法提取滑膜組織RNA，測定濃度，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得cDNA，按照試劑盒說明書建立PCR體系。具體反應(yīng)條件為50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s。40個(gè)循環(huán)。使用β-actin作為內(nèi)參，引物序列見表1。

2.6 Western Blot法檢測 將EP管中的滑膜組織進(jìn)行蛋白提取，先進(jìn)行蛋白濃度測定，隨后沸水浴10 min將蛋白變性。將質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的SDS-PVDF電泳，各樣品總蛋白量為40 μg，加樣后先恒壓80 V電泳至溴酚藍(lán)指示劑在濃縮膠與分離膠交界處成線狀，改為恒壓120 V至溴酚藍(lán)到凝膠底部，約用時(shí)1.5 h，封閉2 h。一抗4 ℃孵育過夜，二抗37 ℃孵育2 h，顯色曝光，進(jìn)行顯影操作，用BandScan分析膠片灰度值。

2.7 ELISA法檢測 將采取的血漿放入離心機(jī)，以3000 r·min-1離心15 min，離心半徑8 cm，分離血清，采用ELISA試劑盒檢測血清中IL-1β、TNF-α、HMGB1的水平。上述檢測步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以表示，采用單因素方差分析。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 各組大鼠滑膜細(xì)胞自噬的透射電鏡觀測結(jié)果 通過電鏡觀察可以發(fā)現(xiàn)各組滑膜細(xì)胞自噬水平，各組均可見內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、溶酶體、高爾基體等正常細(xì)胞器，空白對照組可見少量自噬泡，模型對照組自噬泡較空白對照組減少，松蘿提取物低劑量組自噬泡較模型對照組稍增多，松蘿提取物中、高劑量組自噬泡較模型對照組自噬泡增多，與羥氯喹組相當(dāng)。見圖1。

3.2 PT-PCR法檢測各組大鼠滑膜組織中HMGB1、Beclin1、PI3K C3 mRNA表達(dá) 與空白對照組比較，各模型組HMGB1、PI3K C3 mRNA表達(dá)均上升，Beclin1 mRNA表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；與模型對照組比較，松蘿提取物中、高劑量組和羥氯喹組HMGB1、PI3K C3 mRNA表達(dá)下降，Beclin1 mRNA表達(dá)上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見表2。

3.3 Western Blot法檢測各組大鼠滑膜組織中HMGB1、Beclin1、PI3K C3蛋白表達(dá) 與空白對照組比較，各模型組HMGB1、PI3K C3蛋白表達(dá)上升，Beclin1蛋白表達(dá)下降（P < 0.05）；與模型對照組比較，松蘿提取物中、高劑量和羥氯喹組HMGB1、PI3K C3蛋白表達(dá)下降，Beclin1蛋白表達(dá)上升（P < 0.05）。見圖2、表3。

3.4 ELISA法檢測各組大鼠血清中HMGB1、IL-1β、TNF-α含量 與空白對照組比較，各模型組HMGB1、IL-1β、TNF-α含量均增高（P < 0.05）；與模型對照組比較，松蘿提取物中、高劑量組和羥氯喹組HMGB1、IL-1β、TNF-α含量均降低（P < 0.05）。見表4。

4 討 論

RA是一種病因未明的慢性自身免疫性疾病，成纖維樣滑膜細(xì)胞的凋亡是治療RA的重要機(jī)制之一［11］。RA的關(guān)節(jié)軟骨組織被增生滑膜侵蝕破壞，導(dǎo)致大量細(xì)胞壞死，從而釋放HMGB1；同時(shí)，又在受損關(guān)節(jié)局部聚集了很多活化的單核巨噬細(xì)胞，分泌HMGB1［12］，激活NF-κB通路，導(dǎo)致TNF-α、IL-1β等炎癥因子上調(diào)。

自噬是真核細(xì)胞在自噬相關(guān)基因的調(diào)控下利用溶酶體降解自身細(xì)胞質(zhì)蛋白和受損細(xì)胞器的過程。研究表明，HMGB1主要通過與Beclin1、RAGE作用調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬［13］。HMGB1是細(xì)胞外損傷相關(guān)的普遍存在的黏液蛋白，是自噬的關(guān)鍵調(diào)控因子。HMGB1通過和Beclin1競爭性結(jié)合破壞，以及Beclin1和Bcl-2之間的結(jié)合，使得Bcl-2解離，核內(nèi)HMGB1進(jìn)入到細(xì)胞質(zhì)中，并與自噬相關(guān)蛋白Beclin1相互作用，將其從Beclin1/Bcl-2復(fù)合物中釋放出來［14］，促進(jìn)Beclin1和Ⅲ型磷酸肌醇3激酶/Vsp34結(jié)合，誘導(dǎo)和激活自噬。此外，HMGB1與RAGE結(jié)合后，可以激活細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶，進(jìn)一步激活死亡相關(guān)蛋白激酶促使Beclin1磷酸化，誘導(dǎo)Beclin1與Bcl-2分離，調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬的水平［15］。自噬在調(diào)節(jié)促炎因子的釋放中發(fā)揮著重要作用，可以通過清除有害物質(zhì)抑制炎癥小體的激活從而影響巨噬細(xì)胞。自噬缺陷則會(huì)導(dǎo)致炎癥小體釋放，加重炎癥反應(yīng)［16］。

本研究結(jié)果顯示，松蘿提取物能有效上調(diào)Beclin1蛋白表達(dá)，下調(diào)HMGB1、PI3K C3相關(guān)蛋白的表達(dá)，并降低CIA大鼠血清中HMGB1、IL-1β、TNF-α濃度，減少炎癥發(fā)生。提示松蘿提取物可能是通過上調(diào)自噬水平，達(dá)到改善滑膜細(xì)胞炎癥情況。

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收稿日期：2023-04-21；修回日期：2023-06-08

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81960909，82060909）；貴州省科技平臺(tái)及團(tuán)隊(duì)計(jì)劃項(xiàng)目（黔科合平臺(tái)人才〔2018〕5707）

作者單位：1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽 550025；2.貴州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，貴州 貴陽 550003

通信作者：安陽 貴州省貴陽市云巖區(qū)飛山街83號，anyang8372@126.com