基于急性肝損傷藥效的丹參不同炮制品選擇性研究

曹鳳媚 嚴(yán)慧婕

（廣州中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院藥學(xué)部，廣東 廣州 510360）

丹參為一種常用的活血化瘀類中藥，初載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，其味苦，性微寒，具有活血調(diào)經(jīng)、祛瘀止痛、涼血消癰、養(yǎng)血安神和清心除煩等功效?，F(xiàn)代藥理研究［1-3］證實(shí)：丹參具有保肝、護(hù)心肌、抗血栓、保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞、抗炎抗菌、抗腫瘤和抗氧化等一系列藥理作用，臨床上主要用于醫(yī)治心血管系統(tǒng)疾病，近年來也用于肝損傷、痤瘡、流行性腦膜炎和病毒性心肌炎等的治療［4，5］?！吨兴幣谥平?jīng)驗(yàn)集成》中收載了生丹參、炒丹參、酒丹參、醋丹參和丹參炭等丹參的炮制品種類［6］，炮制方法不同，其中的化學(xué)成分含量也不同。但具體治療不同病癥時(shí)，應(yīng)選擇何種炮制品暫時(shí)還沒有定論。

肝臟作為人體內(nèi)主要的代謝器官，易受化學(xué)、藥物、代謝、酒精及環(huán)境等多種因素的影響造成損傷。肝損傷是各種肝臟疾病的病變結(jié)果，長(zhǎng)期的肝損傷易發(fā)展為肝纖維化、肝硬化、肝癌及肝功能衰竭，對(duì)身體健康造成嚴(yán)重的危害［7-9］。目前，對(duì)乙酰氨基酚（Acetaminophen，APAP）作為大多數(shù)常用感冒藥的主要成分，其大劑量或長(zhǎng)期服用可造成臟器損傷，嚴(yán)重可致死亡。APAP是臨床上引起肝損傷最常見的藥物，其所致肝損傷模型為代表性的藥物性肝損傷模型［10，11］。

丹參可防治多種肝?。?2，13］，本研究擬以丹參不同炮制品對(duì)采用APAP 誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷模型的藥效作為考察指標(biāo)，以最直接的方式比較它們的藥效差異，為丹參治療肝損傷時(shí)選擇合適的炮制品提供依據(jù)；同時(shí)也為其他中藥材不同的炮制品在臨床應(yīng)用中的準(zhǔn)確選擇，探索更為合理的研究方法。

1 材料與試劑

1.1 材料主料：丹參（廣州市嶺南中藥飲片有限公司佛山分公司，批號(hào)：1707001）；輔料：黃酒（上海金楓酒業(yè)股份有限公司，酒精度：14% vol）；老陳醋（山西水塔醋業(yè)股份有限公司，濃度：6 g/100 mL）。

1.2 儀器萬分之一電子分析天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司，BSl10S 型）；數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，KQ-300DE型，300 W，40 kHz）。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF 級(jí)昆明種小鼠，雄性，60 只，5 周齡，體質(zhì)量（20±2）g，合格證號(hào)：SCXK（粵）2019-0047，購(gòu)于廣州中醫(yī)藥大學(xué)。

所有與動(dòng)物相關(guān)的程序均符合廣州中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)根據(jù)國(guó)家衛(wèi)生研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南批準(zhǔn)的動(dòng)物護(hù)理協(xié)議， 動(dòng)物倫理批準(zhǔn)號(hào)為44005900002835、44005900002836。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 丹參不同炮制品的制備

1.4.1.1 炒丹參的制備丹參文火炒至色澤為紫褐色，出現(xiàn)焦斑后取出放涼，即得炒丹參。

1.4.1.2 酒丹參的制備丹參用黃酒拌勻，悶透。置于鍋內(nèi)，文火炒干，取出放涼，即得酒制丹參［14，15］。每100 g丹參片用黃酒30 g。

1.4.1.3 醋丹參的制備丹參用醋拌勻，悶透。置于鍋內(nèi)，文火炒干，取出放涼，即得醋制丹參。每100 g丹參片用米醋30 g。

1.4.2 丹參不同炮制品濃縮液的制備取過8 號(hào)篩的生丹參、炒丹參、酒丹參及醋丹參藥材細(xì)粉各100 g，加70%乙醇回流1 h，過濾，藥渣再用8 倍量70%乙醇回流1 h，過濾，合并2 次濾液，回收乙醇，濃縮至1 g/mL 的稠浸膏，備用。

1.4.3 藥效考察

1.4.3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組取60 只SPF 級(jí)雄性昆明小鼠，依據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法分為6 組，即空白對(duì)照組、模型組、生丹參組、炒丹參組、酒丹參組和醋丹參組。除空白對(duì)照組外，其余各組小鼠一次性腹腔注射300 mg/kg 的APAP 溶液進(jìn)行造模，6 h 后各組均灌胃給藥，空白對(duì)照組和模型組給予生理鹽水，其余各治療組則給予相應(yīng)炮制品的濃縮液，給藥劑量均為2 mL/100 g，每天1次，連續(xù)給藥10 d。

1.4.3.2 血液樣品的采集及丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）和門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）的檢測(cè)各組小鼠連續(xù)灌胃給藥10 d，于第11 天摘眼球取血，室溫靜置20 min，離心提取血清，-80 ℃冰箱保存待測(cè)。檢測(cè)時(shí)解凍，振搖混勻，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作步驟測(cè)定血清ALT 和AST水平。

1.4.3.3 肝臟組織中谷胱甘肽（GSH）和丙二醛（MDA）的含量測(cè)定取“1.4.3.2”項(xiàng)下的小鼠脫頸處死，解剖摘取肝臟組織，準(zhǔn)確稱取組織重量，按重量（g）∶體積（mL）=1∶9的比例加入生理鹽水，在冰水浴條件下用組織勻漿機(jī)機(jī)械勻漿，制備成10%的肝臟勻漿液，1690×g離心10 min，取上清液進(jìn)行測(cè)定。

1.4.3.4 肝組織形態(tài)學(xué)變化取出小鼠肝組織，立刻浸入10%中性福爾馬林液中進(jìn)行固定，48 h 后用自來水沖洗固定液，用乙醇梯度脫水，透明化組織，浸蠟后包埋。制成4～5 μm 切片，經(jīng)60 ℃烤片后采用常規(guī)的蘇木精-伊紅（HE）染色，觀察［16-18］。

2 結(jié)果

2.1 各組對(duì)APAP 誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷模型血清ALT、AST 活性的影響與空白對(duì)照組比較，模型組小鼠血清ALT、AST 的水平均有顯著性提高（P＜0.01），表明APAP 誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷模型復(fù)制成功；與模型組比較，4 個(gè)給藥組可不同程度地降低小鼠血清中ALT、AST 的水平，降低幅度由大到小排列為醋丹參＞酒丹參＞生丹參＞炒丹參。

其中，醋丹參組、酒丹參組和生丹參組分別與模型組比較，ALT、AST 降低水平均顯著優(yōu)于空白對(duì)照組（P＜0.01），說明上述3 組給藥組能減少由APAP 誘導(dǎo)的急性肝組織損傷。見表1。

表1 各組對(duì)APAP誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷模型血清ALT、AST活性的影響（±s，ng/L）

表1 各組對(duì)APAP誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷模型血清ALT、AST活性的影響（±s，ng/L）

注：與空白對(duì)照組比較，1）P＜0.01；與模型組比較，2）P＜0.01。

組別空白對(duì)照組模型組生丹參組炒丹參組酒丹參組醋丹參組AST 90.94±3.80 123.21±5.511）106.18±7.042）110.13±9.55 100.07±6.542）98.69±6.222）鼠數(shù)10 10 10 10 10 10 ALT 40.82±2.10 61.77±3.951）49.18±5.352）55.78±4.56 47.09±4.392）45.60±3.872）

2.2 各組對(duì)APAP 誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷模型的肝組織病理結(jié)果空白對(duì)照組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)正常，肝小葉清晰，肝細(xì)胞排列規(guī)整、核形態(tài)正常；模型組小鼠經(jīng)300 mg/kg 的APAP 誘導(dǎo)后，肝組織結(jié)構(gòu)被破壞，肝小葉模糊，肝細(xì)胞被炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，出現(xiàn)液化性壞死，呈溶解態(tài)并伴有出血。

與模型組比較，4 個(gè)給藥組可不同程度地減輕小鼠肝組織的病變，使肝組織結(jié)構(gòu)趨于正常。減輕幅度由大到小排列為醋丹參＞酒丹參＞生丹參＞炒丹參。表明4個(gè)給藥組對(duì)APAP 引起的肝損傷有一定的保護(hù)作用。其中，醋丹參組、酒丹參組對(duì)肝損傷的保護(hù)作用較強(qiáng)，生丹參組對(duì)肝損傷保護(hù)作用較弱，炒丹參組的肝損傷保護(hù)作用最弱。見圖1。

圖1 丹參不同炮制品對(duì)小鼠肝組織病理形態(tài)的影響（HE，×10）

綜上，丹參不同炮制品對(duì)小鼠急性肝損傷的治療效果排序?yàn)榇椎ⅲ揪频ⅲ旧ⅲ境吹?。故基于APAP 誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷藥效結(jié)果可知，治療肝損傷時(shí)準(zhǔn)確選用丹參炮制品的順序?yàn)榇椎ⅲ揪频ⅲ旧ⅲ境吹ⅰ?/p>

3 討論

炮制系指將藥材凈制、切制和炮炙處理，制成一定規(guī)格的飲片，以適應(yīng)醫(yī)療要求及調(diào)配、滿足制劑的需要等，保證用藥的安全和效用。其作為中藥材前處理的關(guān)鍵步驟，不僅決定著藥材的品質(zhì)優(yōu)劣，也影響著中藥飲片有效成分的含量。藥材通過不同的炮制，性味功能及藥效可產(chǎn)生不同的變化，主要原因在于藥材的有效成分與炮制所用的輔料之間發(fā)生的化學(xué)反應(yīng)可影響有效成分的含量，從而增強(qiáng)藥效、減少毒副作用［19，20］。

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)小鼠急性肝損傷的治療效果為醋丹參＞酒丹參＞生丹參＞炒丹參，原因可能在于：炒丹參在炮制的過程中需要加熱升溫，而丹參所含主要有效成分丹參酮ⅡA 和丹酚酸B 對(duì)熱不穩(wěn)定，故炒丹參中主要成分的損失較為嚴(yán)重，甚至比生丹參中的含量還要低；而醋丹參和酒丹參，盡管在炮制的過程中有效成分也有一定程度的損失，但其所加的輔料乙醇和醋對(duì)丹參主要有效成分有不同程度的保護(hù)作用，可增加其中有效成分的含量。其中，因?yàn)榇妆旧砭哂锌寡趸人幮ё饔?，故醋丹參治療肝損傷的藥效稍好于酒丹參［21-24］。

程立方等［25］采用正交實(shí)驗(yàn)考察了不同炮制方法對(duì)丹參酮ⅡA 的影響，結(jié)果顯示丹參酮ⅡA 的含量依次為黃酒炙丹參（加酒量110%）＞黃酒炙丹參（加酒量60%）＞生丹參＞烘制丹參＞黃酒炙丹參（加酒量20%）＞麩炒丹參＞白酒炙丹參＞丹參炭，以黃酒炙丹參（加酒量110%）質(zhì)量為最優(yōu)，且丹參酮ⅡA 的含量與加酒量成正比；而李慧芬等［26］、陸小華［27］、李懿［28］和閆東暉［29］考察了不同的炮制方法對(duì)丹酚酸B 的影響，結(jié)果表明丹酚酸B 含量依次為酒丹參＞醋丹參＞生丹參＞炒丹參＞丹參炭。

但是，藥材所含化學(xué)成分含量的高低與藥效并不一定成正比關(guān)系，如李昌勤等［30］直接以藥效為指標(biāo)，采用紙片擴(kuò)散法考察了丹參不同炮制品對(duì)金黃色葡萄球菌（SA）等病菌的抑制活性，結(jié)果表明炒丹參的抗菌活性最強(qiáng)，酒丹參的抗菌活性有所增強(qiáng)，而丹參炭具有一定抗菌活性但明顯減弱。故盡管炮制后酒丹參中丹參酮ⅡA 和丹酚酸B 的含量最高，而炒丹參中含量較低，但就抗菌活性而言，炒丹參的抗菌藥效最強(qiáng)，酒丹參僅有所增強(qiáng)。這可能是由于丹參中多種有效成分彼此間相互作用造成的，提示單純從考察含量變化的角度來判斷藥效的好壞并不具有絕對(duì)代表性。

然而，目前眾多的實(shí)驗(yàn)研究主要還是通過考察藥材經(jīng)過不同的炮制后主要成分的含量變化來判斷藥效的好壞，這種驗(yàn)證藥效的方式相對(duì)片面。在臨床用藥的過程中，必須結(jié)合具體病癥的治療，進(jìn)行不同炮制品與病癥的匹配實(shí)驗(yàn)，才能進(jìn)一步確定在治療某特定病癥時(shí)適合的炮制品類型。因此，相比于使用化學(xué)成分作為評(píng)判的指標(biāo)，以其藥效作為評(píng)判指標(biāo)更為合理，更有利于提高臨床效果。

因此，本實(shí)驗(yàn)選擇以藥效作為考察指標(biāo)來篩選更為適合急性肝損傷治療的丹參炮制品，以期為臨床用藥提供研究基礎(chǔ)及相關(guān)依據(jù)。