小檗堿下調NLRP3減輕PC12細胞缺氧缺糖/復氧復糖損傷的作用

李 強， 沈琳娜， 劉 沖， 古亞偉， 王利軍

細胞焦亡與炎性因子的釋放有關，是近年來人類發(fā)現(xiàn)的細胞程序性死亡方式，不同于細胞凋亡及壞死性凋亡，當生物體受到毒性刺激時，有害的細胞內和細胞外信號就會被誘導通過經典的焦亡途徑在細胞質中形成炎癥小體，該途徑依賴于非經典的焦亡通路，對于中樞神經系統(tǒng)疾病中，這種細胞死亡方式非常普遍，尤其是具有高發(fā)病率的阿爾茨海默?。ˋlzheimer's disease，AD）、癲癇等均會出現(xiàn)細胞焦亡；抑制炎癥級聯(lián)反應是改善腦缺血再灌注損傷的理想策略；小檗堿（berberine，BBR）已被證明具有許多藥理活性和良好的安全性，如鎮(zhèn)痛、抗炎和抗癌；很多的研究結果顯示，BBR能保護腦缺血再灌注損傷；小檗堿可以通過抑制氧化應激，減輕炎癥反應，提高免疫功能，抑制NF-κB/NLRP3信號通路，減輕大鼠腦缺血/再灌注損傷；小檗堿預處理缺氧缺糖/復氧復糖（hypoxia/reoxygenation，OGD/R）誘導的PC12 細胞損傷有怎樣的作用？本部分對以上問題進行了研究。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 PC12細胞株（由武漢普諾公司提供），CO2恒溫培養(yǎng)箱（Panasonic），倒置熒光顯微鏡（廣州明美光電技術有限公司），生物倒置顯微鏡（廣州明美光電技術有限公司），胎牛血清（浙江天杭生物科技股份有限公司），RPMI 1640 培養(yǎng)基（biosharp），Na2S2O4（SIGMA），ELISA［大鼠白細胞介素-1（interleukin-1，IL-1）、IL-18］試劑盒（酶免），GSDMD（CST），NLRP3（BOSTER），CASP1（P20）（BOSTER）。

1.2 小檗堿給藥濃度的確定及分組 對制備好的樣品根據(jù)實驗分組進行加藥處理，首先用1640 培養(yǎng)基配置鹽酸小檗堿溶液：0 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L、200 μmol/L、400 μmol/L、800 μmol/L及對照組，不同治療濃度的鹽酸小檗堿分別作用于PC12 細胞損傷模型，制作鹽酸小檗堿的量效曲線，在此基礎上，進一步得出鹽酸小檗堿給藥的低、高濃度。細胞分為對照組、OGD/R 損傷組、小檗堿低（25 μmol/L）、高劑量（200 μmol/L）組。小檗堿干預24 h后，通過OGD/R損傷后，檢測相關指標的變化情況。

1.3 LDH 檢測 收集各處理組細胞培養(yǎng)液，離心取上清液待測。按照試劑盒說明書溶解試劑，測試前室溫下平衡至少30 min?；靹?，放置于室溫環(huán)境中，一段時間后取出并在450 nm 處酶標儀測定吸光值。之后按照以下方法確定出LDH的抑制率：

1.4 TUNEL 首先用4%多聚甲醛固定15 min，接著進行反復洗滌；破膜，此操作持續(xù)5 min，之后用專用洗液進行反復洗滌；于樣品中加入適量的TUNEL反應液，放置于無光照的室溫環(huán)境中培養(yǎng)，持續(xù)時長為4 h；切片于尼康熒光顯微鏡下觀察并采集圖像；經過浸染后制備而成的細胞核在紫外的激發(fā)下為藍色；同時經過檢測，發(fā)現(xiàn)其陽性表達為紅光或者綠光。

1.5 免疫熒光 加入破膜液破膜，此操作的持續(xù)時間為10 min，之后進行反復洗滌；之后進行血清封閉，這一操作需持續(xù)10 min；加一抗、二抗、DAPI復染細胞核；爬片用弱堿性的PBS洗滌，此步驟重復3 次，每次持續(xù)時間為1 min，切片稍甩干后進行封片；切片于熒光顯微鏡下觀察并采集圖像；經過浸染后制備而成的細胞核在紫外的激發(fā)下為藍色；同時經過檢測，發(fā)現(xiàn)其陽性表達為綠光。

1.6 IL-1β 及IL-18 檢測 按試劑盒說明書進行操作，將各種試劑移至室溫環(huán)境中半小時。要是在450 nm 處依序測量各孔的吸光值。得出這一數(shù)值后，再結合標準品的濃度繪制出相應的標準曲線，進而確定出樣本濃度。

1.7 蛋白質印跡（Western blotting） 提取細胞總蛋白，經制膠、電泳、凝膠轉膜、封閉，加入一抗、二抗，用Image J 軟件統(tǒng)計分析采集的圖像，確定出灰度值，設置的內參為 GAPDH，進行計算分析確定出相對蛋白表達水平。

1.8 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 24.0軟件完成數(shù)據(jù)處理。同時本研究中用(±s)描述數(shù)據(jù)分布情況，時間差異的分析中，主要是采用重復測量方法展開分析。而進行組間對比時，則用單因素方差分析。對于本文收集的相關數(shù)據(jù)，引入LSD-t檢驗進行組間兩兩比較。另外還使用功能強大的Graphpad prism 7.05 繪制統(tǒng)計圖，各環(huán)節(jié)中的數(shù)據(jù)檢驗均為雙側檢驗，若統(tǒng)計結果為P＜0.05，則表示差異顯著。

2 結 果

2.1 小檗堿對OGD/R 誘導的PC12 細胞損傷后乳酸脫氫酶（LDH）活性的影響 此處結合下圖展開分析，不難得出，OGD/R 損傷組與Control 組相比，前者的細胞LDH 活性顯著增加，兩組數(shù)據(jù)差異較大；與OGD/R 損傷組相比，給予25 μmol/L、200 μmol/L 小檗堿預處理后，能顯著降低細胞中LDH活性水平，差異均具有統(tǒng)計學意義（見圖1）。

圖1 PC12細胞損傷后LDH活性的影響

2.2 小檗堿對細胞凋亡率的影響 在本環(huán)節(jié)的研究中，使用TUNEL 染色法對神經元陽性凋亡細胞進行染色。將樣品放置于顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)Control 組中有少量神經元TUNEL 陽性熒光染色；相較于該組，OGD/R組中有大量凋亡細胞。另外，經過進一步的觀察和分析發(fā)現(xiàn)，其TUNEL 陽性凋亡細胞數(shù)量增多，兩組數(shù)據(jù)差異較大；同時相較于損傷組而言，小檗堿處理組中，可觀察到凋亡神經元減少，兩組數(shù)據(jù)差異明顯（見圖2、圖3）。

圖2 四組神經細胞TUNEL染色結果（×400）

圖3 小檗堿對PC12細胞凋亡的影響

2.3 小檗堿對OGD/R 誘導的PC12 細胞損傷后GSDMD 熒光表達的影響 在本環(huán)節(jié)中，首先要觀察神經元內GSDMD 熒光表達，期間需要用到細胞免疫熒光染色法；由此得出的結論是：相較于Control組而言，OGD/R損傷組細胞內綠色熒光增強，兩組數(shù)據(jù)差異較大；進一步的分析可知，相較于OGD/R 損傷組，預處理組細胞內綠色熒光減少，兩組數(shù)據(jù)差異較大（見圖4、圖5）。

圖4 四組神經細胞GSDMD熒光表達結果（×400）

圖5 小檗堿對OGD/R誘導的PC12細胞損傷后GSDMD熒光表達的影響

2.4 小檗堿抑制OGD/R 誘導的PC12 細胞損傷后IL-1β 及IL-18 的分泌 酶聯(lián)免疫法實驗結果顯示，對比分析OGD/R 組與空白組，發(fā)現(xiàn)前一組細胞培養(yǎng)上清中IL-1β 及IL-18 含量較多，兩組數(shù)據(jù)差異顯著；干預組與OGD/R 組相比，后者細胞培養(yǎng)上清中IL-1β及IL-18含量更低（見圖6、圖7）。

圖6 小檗堿抑制OGD/R 誘導的PC12 細胞損傷后IL-1β 的分泌

圖7 小檗堿抑制OGD/R誘導的PC12細胞損傷后IL-18的分泌

2.5 小檗堿抑制OGD/R 誘導的PC12 細胞NLRP3、GSDMD、Caspase-1 蛋白表達 Western blotting結果顯示：與空白組相比，OGD/R 組大鼠海馬組織NLRP3、GSDMD、Caspase-1 蛋白表達均有不同程度增加，均具有統(tǒng)計學意義。預處理組與OGD/R 組相比，前者中這些蛋白表達水平降低，此外兩個治療組大鼠的這些指標降幅更大，差異顯著（見圖8～圖11）。

圖8 四組NLRP3、GSDMD、Caspase-1蛋白表達

圖9 小檗堿抑制OGD/R誘導的PC12細胞GSDMD蛋白表達

圖10 小檗堿抑制OGD/R誘導的PC12細胞Caspase-1 蛋白表達

圖11 小檗堿抑制OGD/R誘導的PC12細胞NLRP3蛋白表達

3 討 論

多種病理機制參與缺血性腦卒中的發(fā)病過程，包括鈣失衡、興奮性毒性、氧化應激、炎癥反應和血腦屏障（blood brain barrier，BBB）破壞［1，2］；其中炎癥過程是在中風的整個過程中所固有的，焦亡是一種促炎驅動的程序性細胞死亡，通常會表現(xiàn)為細胞腫脹、膜破裂等［3］；不同的刺激可激活它們的炎癥小體，而后Caspase-1作用于IL-1β和IL-18并使這兩種物質裂解；此過程中促炎半胱天蛋白酶切割GSDMD在焦亡中起著關鍵性作用，GSDMD裂解n端結構域對細胞具有細胞毒性，并易位到細胞膜上，誘導焦亡細胞死亡。

近年來使用OGD/R模型模擬腦梗死、腦卒中、腦缺血再灌注損傷等細胞分子水平的研究，PC12細胞是神經細胞株，有學者從大鼠腎上腺髓質嗜鉻細胞瘤中將其提取出來。這類細胞在形態(tài)、生理等方面和神經元類似，且二者的性質也趨于一致；因此本研究構建體外缺血再灌注PC12 細胞模型，通過體外實驗觀察小檗堿對OGD/R 誘導的PC12 細胞焦亡的影響及調控機制。研究結果表明：經25 μmol/L、200 μmol/L 的小檗堿預處理的細胞其增值率顯著提高，差異具有統(tǒng)計學意義；由此可推斷出小檗堿可緩解OGD/R 誘導的PC12損傷。

LDH 則可以反映細胞膜完整性，腦組織局部供血不足時，病變細胞會釋放出LDH，這種物質會穿透保護屏障而最終進入血液循環(huán)。因此細胞存活率和LDH 的漏出量是評價細胞損傷的常用指標之一［4］；此研究發(fā)現(xiàn)，OGD/R 誘導的PC12 細胞LDH 活性較高；因而可以認為，這種細胞OGD 細胞損傷模型有效，且小檗堿可以抑制損傷。

NOD樣受體蛋白-3和先天免疫存在密切關系，可看作為一種識別受體，參與腦缺血后的炎癥損傷，NLRP 的組成單元包括NLRP3、ASC 和Caspase-1。這種炎癥小體的結構和功能研究已經有很多，且發(fā)現(xiàn)其在缺血腦組織的神經元中廣泛地分布，從而介導腦缺血損傷，這就提供了一個新的方案開發(fā)和使用靶向NLRP3介導的炎癥反應的藥物治療缺血性卒中；本文的實驗研究結果表明NLRP3、GSDMD 相關蛋白的表達有所增加，誘導PC12細胞焦亡，這與既往文獻報道相一致［5～7］，熒光檢測結果同時顯示，OGD/R后GSDMD表達明顯增強，而小檗堿干預后使得NLRP3、GSDMD蛋白水平降低，由此也可判斷出小檗堿對PC12 細胞損傷的保護作用主要是通過抑制焦亡實現(xiàn)。

IL-1是炎癥性［8］的一種胞質蛋白，是腦缺血神經元損傷［9］的關鍵介質；IL-1家族中有9個成員，其中最典型的是IL-1β和IL-18，越來越多的證據(jù)表明，NLRP3組裝前Caspase-1，觸發(fā)一個信號級聯(lián)，該信號級聯(lián)對失調性細胞因子如IL-1β、IL-6 和IL-18 的產生至關重要，這些關鍵的炎癥分子對神經元存活產生不利影響，并在卒中損傷［10］的進展中發(fā)揮不同的作用，本實驗結果表明OGD/R處理后的PC12細胞中IL-1β和IL-18水平明顯地提高，而小檗堿干預后這兩個炎性因子的含量有一定幅度下降，由此結果可推斷出小檗堿對與此相關的IL-1β和IL-18釋放可起到抑制作用。一些學者的實驗研究發(fā)現(xiàn)小鼠腦缺血再灌注時Caspase-1被激活，而通過一定的藥物干預來抑制其激活，可緩解腦缺血再灌注相關的損傷［11，12］。

綜上所述，小檗堿干預可阻礙NLRP3、GSDMD的激活，同時也抑制了IL-1β和IL-18分泌和釋放，據(jù)此抑制了細胞焦亡，相應的炎性反應損傷也減輕。根據(jù)以上論述可知OGD/R可誘導PC12焦亡，小檗堿對這種焦亡相關的損傷有抑制作用，這主要是通過抑制神經元凋亡和炎性因子的釋放實現(xiàn)。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：李強負責設計論文框架、起草論文及論文修改；李強、沈琳娜負責數(shù)據(jù)收集、統(tǒng)計學分析、繪制圖表；李強、劉沖、谷亞偉負責實驗操作、研究過程的實施；李強、王利軍負責擬定寫作思路、指導撰寫文章并最后定稿。