LOXL1-AS1對(duì)OGD誘導(dǎo)的人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的影響

徐 楓， 黎村豐， 朱觀祥

卒中仍然是全球第二大死亡原因，也是導(dǎo)致患者長(zhǎng)期殘疾的第一大原因［1］。卒中主要分為兩種類型：缺血性卒中和出血性卒中。幾乎86%的卒中是由腦缺血引起的，這是由于血液從血塊流向大腦的過程中斷，導(dǎo)致大腦缺氧和營(yíng)養(yǎng)不足，最終導(dǎo)致原發(fā)性腦損傷［2］。缺血性卒中是一個(gè)復(fù)雜的病理過程，其機(jī)制尚不清楚。非編碼RNA，包括長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）和微小RNA（microRNA，miRNA/miR），通過不同的機(jī)制調(diào)節(jié)基因表達(dá)和功能［3，4］。lncRNA 被報(bào)道作為miRNA 充當(dāng)競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA（competing endogenous RNAs，ceRNA），影響卒中過程［5］。例如lncRNA SNHG14 通過調(diào)節(jié)miR-199b/水通道蛋白4 軸促進(jìn)缺血性腦損傷［6］，lncRNA XIST 的消耗通過miR-362/Rho 相關(guān)卷曲螺旋形成蛋白激酶2軸減弱腦缺血/再灌注中的神經(jīng)損傷和炎癥反應(yīng)［7］。lncRNA LOXL1 反義RNA 1（antisense RNA 1，LOXL1-AS1）位于人類染色體15q24.1，由10 781 個(gè)核苷酸和5 個(gè)外顯子組成［8］。LOXL1-AS1 通過調(diào)節(jié)miR-590-5p 調(diào)節(jié)的Kruppel 樣鋅指轉(zhuǎn)錄因子6/血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子信號(hào)通路，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展中的血管生成［8］，并通過靶向miR-423-5p/賴氨酸特異性去甲基化酶5C 軸促進(jìn)骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)展［9］。然而，LOXL1-AS1 是否在缺血性卒中中起作用仍不清楚。本研究通過HBMEC 的氧糖剝奪（oxygen-glucose deprivation，OGD）來模擬缺血性卒中模型，旨在探索LOXL1-AS1 在缺血性卒中中的生物學(xué)功能并揭示其相關(guān)的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞（human brain microvascular endothelial cells，HBMEC）及其培養(yǎng)基購(gòu)于上海中喬新舟生物科技有限公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8（cell counting kit-8，CCK-8）、RIPA 裂解液、白細(xì)胞介素（interleukin，IL-6）酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒、IL-1β ELISA 試劑盒、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α） ELISA 試劑盒、膜聯(lián)蛋白V（annexinV）-FITC/碘化丙啶（propidium iodide，PI）試劑盒購(gòu)于上海Beyotime 公司；si-NC、si-LOXL1-AS1、miRNC、miR-761 mimic、anti-miR-NC、miR-761 Inhibitor購(gòu)于廣州RiboBio 公司；兔抗B 細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/lewkmia-2，Bcl-2）抗體、兔抗Bcl-2相關(guān)X 蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）抗體購(gòu)于美國(guó)Abcam公司；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit 購(gòu)于美國(guó)Thermo 公司；SYBR Green PCR Master 購(gòu)于上海Toyobo 公司；pmirGLO 質(zhì)粒、Dual-Glo熒光素酶檢測(cè)試劑盒購(gòu)于美國(guó)Promega公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與OGD 損傷 HBMEC 在包含5%胎牛血清、1%內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、1%青霉素/鏈霉素的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基中，在37 ℃、5% CO2氣氛中生長(zhǎng)。OGD損傷時(shí)，將細(xì)胞培養(yǎng)基替換為無糖培養(yǎng)基，并在94% N2、5% CO2和1% O2培養(yǎng)箱中保持。4 h 后將培養(yǎng)液替換為含糖培養(yǎng)基，并在正常培養(yǎng)箱中保持2 h［10］。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組 HBMEC 分為對(duì)照組（正常培養(yǎng)）、OGD 組（OGD 損傷）、OGD+si-NC 組（轉(zhuǎn)染si-NC）、OGD+si-LOXL1-AS1 組（轉(zhuǎn)染si-LOXL1-AS1）、OGD+miR-NC 組（轉(zhuǎn)染miR-NC）、OGD+miR-761 組（轉(zhuǎn)染miR-761 mimic）、OGD+si-LOXL1-AS1+陰性對(duì)照組（轉(zhuǎn)染si-LOXL1-AS1 與anti-miR-NC）、OGD+si-LOXL1-AS1+miR-761 抑制劑組（轉(zhuǎn)染si-LOXL1-AS1與miR-761 Inhibitor）。轉(zhuǎn)染時(shí)，按照制造商Invitrogen 的操作指示，使用Lipofectamine 2000 試劑在HBMEC 中轉(zhuǎn)染si-NC、si-LOXL1-AS1、miR-NC、miR-761 mimic、anti-miR-NC、miR-761 inhibitor，轉(zhuǎn)染48 h后，進(jìn)行OGD損傷。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 RT-qPCR 檢測(cè)LOXL1-AS1 和miR-761 表達(dá)HBMEC 處理結(jié)束后，用TRIzol 裂解液在冰上裂解。按照RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit的操作流程進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，將總RNA 轉(zhuǎn)化為cDNA。按照SYBR Green PCR Master 的操作流程進(jìn)行PCR 反應(yīng)。U6 作為miR-761 的內(nèi)源對(duì)照，GAPDH作為L(zhǎng)OXL1-AS1的內(nèi)源對(duì)照。2-ΔΔCt值表示基因的相對(duì)表達(dá)。LOXL1-AS1正向引物5'-AATTGCCCTCTTGGGC TTAT-3'，反向引物5'-GTCTCACCTTCCCATTCCAA-3'；GAPDH 正向引物5' -CATGAGAAGTATGACAACAG CCT-3'，反向引物5'-AGTCCTTCCACGATACCAAAG T-3'；miR-761正向引物5'-ACAGGCAGGCACAGAC-3'，反向引物5'-GAGCAGGCTGGAGAA-3'；U6 正向引物5'-CTCGCTTCGGGCAGCACA-3'，反向引物5'-AA CGCTTCACGAATTTGCGT-3'。

1.5 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活率 將每組HBMEC接種于96 孔板（5×103個(gè)細(xì)胞/孔），培養(yǎng)48 h。除去之前的培養(yǎng)基，加入CCK-8 和培養(yǎng)基混合物（CCK-8與培養(yǎng)基的比例為1∶10）。在正常培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h后，通過酶標(biāo)儀測(cè)定培養(yǎng)板在450 nm 處的吸光度OD 值，以實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組OD 百分比為細(xì)胞存活率（%）。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 將每組HBMEC（1×105）懸浮在結(jié)合緩沖液中，按照annexinV-FITC/PI 試劑盒的操作流程，加入5 μl annexinV-FITC 和5 μl PI 試劑，避光反應(yīng)15 min。應(yīng)用BD FACS Calibur流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.7 Western blotting 檢測(cè)Bax、Bcl-2 蛋白表達(dá)每組HBMEC處理完成后，使用RIPA裂解液在冰上裂解。細(xì)胞完全裂解30 min，然后在4 ℃離心機(jī)中以14 000 r/min離心15 min。共取50 μg總蛋白，用SDSPAGE 在100 V 下電泳2 h。分離的蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上。在室溫下用5%脫脂奶粉密封膜1 h。然后與Bax 抗體（1∶1 500）、Bcl-2 抗體（1∶1 500）、GAPDH 抗體（1∶2 000）在4 ℃下孵育過夜，與辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗兔二抗（1∶10 000）一起孵育（室溫，1 h）。使用Pierce ECL 蛋白質(zhì)印跡底物試劑進(jìn)行X 射線顯影，并通過Image J分析Bax、Bcl-2蛋白的灰度值。

1.8 ELISA 檢測(cè)炎性因子IL-6、IL-1β 和TNF-α 水平 收集HBMEC 上清液，按照IL-6、IL-1β和TNF-α ELISA 試劑盒的操作流程，進(jìn)行測(cè)定，用酶標(biāo)儀記錄450 nm 處的OD 值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算IL-6、IL-1β和TNF-α水平。

1.9 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測(cè)LOXL1-AS1和miR-761 的互補(bǔ)結(jié)合 將LOXL1-AS1 的序列擴(kuò)增并轉(zhuǎn)移至pmirGLO 質(zhì)粒下游的熒光素酶基因，獲得WT-LOXL1-AS1。同時(shí)根據(jù)starbase 軟件預(yù)測(cè)的LOXL1-AS1 和miR-761 結(jié)合位點(diǎn)，獲得含有突變靶點(diǎn)的LOXL1-AS1 片段MUT-LOXL1-AS1。使用Lipofectamine 2000 試劑將WT-LOXL1-AS1、MUTLOXL1-AS1 和miR-761 mimic、miR-NC 共轉(zhuǎn)染到HBMEC 中。轉(zhuǎn)染48 h，通過Dual-Glo 熒光素酶檢測(cè)試劑盒評(píng)估相對(duì)熒光素酶活性。

2 結(jié) 果

2.1 抑制LOXL1-AS1 對(duì)OGD 誘導(dǎo)的HBMEC 損傷的影響 與對(duì)照組相比，OGD 組HBMEC 的LOXL1-AS1 表達(dá)量增加（見圖1A），存活率減少（見圖1B），凋亡率增加（見圖2A 和圖1C），Bax表達(dá)量增加，Bcl-2表達(dá)量減少（見圖2B和圖1D，均P＜0.05）。抑制LOXL1-AS1 后，與OGD 組或OGD+si-NC 組相比，OGD+si-LOXL1-AS1 組HBMEC的LOXL1-AS1 表達(dá)量減少（見圖1A），存活率增加（見圖1B），凋亡率降低（見圖2A 和圖1C），Bax 表達(dá)量減少，Bcl-2 表達(dá)量增加（見圖2B 和圖1D，均P＜0.05）。

圖1 抑制LOXL1-AS1對(duì)OGD誘導(dǎo)的HBMEC損傷的檢測(cè)（n=3，±s）

圖2 抑制LOXL1-AS1對(duì)OGD誘導(dǎo)的人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

2.2 抑制LOXL1-AS1 能降低OGD 誘導(dǎo)的HBMEC中炎性因子的水平 如圖3所示，與對(duì)照組相比，OGD組HBMEC的炎性因子IL-6、IL-1β和TNF-α水平均升高（均P＜0.05）。抑制LOXL1-AS1后，與OGD組或OGD+si-NC 組相比，OGD+si-LOXL1-AS1 組HBMEC的IL-6、IL-1β和TNF-α水平均降低（均P＜0.05）。

圖3 抑制LOXL1-AS1對(duì)OGD誘導(dǎo)的HBMEC中炎性因子的檢測(cè)（n=3，±s）

2.3 LOXL1-AS1 靶向調(diào)控miR-761 Starbase 軟件預(yù)測(cè)的LOXL1-AS1 和miR-761 的互補(bǔ)序列見圖4。miR-761組WT-LOXL1-AS1熒光素酶活性比miR-NC組減少約52.08%（P＜0.05），而MUT-LOXL1-AS1 熒光素酶活性與miR-NC 組無顯著差異（P=0.511）（見圖5）。轉(zhuǎn)染si-LOXL1-AS1 的HBMEC 中miR-761 表達(dá)量比轉(zhuǎn)染si-NC增加約1.89倍（P＜0.05）（見圖6）。

圖4 LOXL1-AS1和miR-761的互補(bǔ)序列

圖5 LOXL1-AS1雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)（n=3，±s）

圖6 LOXL1-AS1調(diào)控miR-761（±s，n=3）

2.4 miR-761 對(duì)OGD 誘導(dǎo)的HBMEC 損傷炎性因子的影響 過表達(dá)miR-761 后，OGD+miR-761 組HBMEC 的miR-761 表達(dá)量比OGD+miR-NC 組增加（見圖7A），存活率比OGD+miR-NC組增加（見圖7B），凋亡率比OGD+miR-NC 組減少（見圖8A 和圖7C），Bax 表達(dá)量比OGD+miR-NC 組減少，Bcl-2 表達(dá)量比OGD+miR-NC 組增加（見圖8B 和圖7D），并且IL-6、IL-1β 和TNF-α 水平均比OGD+miR-NC 組降低（見圖7E，均P＜0.05）。

圖7 miR-761對(duì)OGD誘導(dǎo)的HBMEC損傷炎性因子的檢測(cè)（±s，n=3）

圖8 miR-761對(duì)OGD誘導(dǎo)的人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡及凋亡蛋白表達(dá)的影響

2.5 抑制miR-761 對(duì)抑制LOXL1-AS1 處理的OGD 誘導(dǎo)的HBMEC 損傷炎性因子的影響 抑制miR-761 和抑制LOXL1-AS1 后，OGD+si-LOXL1-AS1+miR-761 抑制劑組HBMEC 的miR-761 表達(dá)量低于OGD+si-LOXL1-AS1+陰性對(duì)照組（見圖9A），存活率低OGD+于si-LOXL1-AS1+陰性對(duì)照組（見圖9B），凋亡率高于si-LOXL1-AS1+陰性對(duì)照組（見圖10A 和圖9C），Bax 表達(dá)量高于OGD+si-LOXL1-AS1+陰性對(duì)照組，Bcl-2 表達(dá)量少于OGD+si-LOXL1-AS1+陰性對(duì)照組（見圖10B 和圖9D），并且IL-6、IL-1β 和TNF-α 水平均高于OGD+si-LOXL1-AS1+陰性對(duì)照組（見圖9E，均P＜0.05）。

圖9 抑制miR-761對(duì)抑制LOXL1-AS1處理的OGD誘導(dǎo)的HBMEC損傷炎性因子的檢測(cè)（±s，n=3）

圖10 抑制miR-761對(duì)抑制LOXL1-AS1處理的OGD誘導(dǎo)的人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡及凋亡蛋白表達(dá)的影響。

3 討 論

缺血性腦卒中是最常見的腦血管疾病類型，是多種因素引起的腦血管循環(huán)障礙，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜［11］。目前，缺血性腦卒中的分子機(jī)制尚不清楚，缺乏早期診斷標(biāo)志物。HBMEC 位于血液和腦實(shí)質(zhì)之間，對(duì)正常的神經(jīng)功能至關(guān)重要，并負(fù)責(zé)傳輸必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和去除潛在的有害毒素［12］。缺血性腦卒中導(dǎo)致腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞死亡，并加重神經(jīng)損傷，保護(hù)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞免受缺血性損傷可能對(duì)改善腦卒中預(yù)后具有重要意義［13］。大量研究表明，腦組織中的炎癥反應(yīng)發(fā)生在多種腦部急性病變中，包括缺血性卒中。缺血性卒中后的腦損傷導(dǎo)致壞死和細(xì)胞凋亡，這些會(huì)驅(qū)動(dòng)由細(xì)胞因子釋放控制的炎癥反應(yīng)［14，15］。因此本研究利用OGD 處理HBMEC，發(fā)現(xiàn)OGD 使HBMEC存活降低、凋亡增加，還提升細(xì)胞炎性因子IL-6、IL-1β和TNF-α水平，與前人研究［10，16］吻合。

研究發(fā)現(xiàn)，LOXL1-AS1 在胰腺癌［17］、肺腺癌［18］、食管癌［19］、膠質(zhì)瘤［20］等多種腫瘤中表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。最近的研究還證明LOXL1-AS1 在非腫瘤疾病中具有重要作用。例如，LOXL1-AS1在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥患者外周血中異常高表達(dá)，它抑制人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化但促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化［21］。LOXL1-AS1在冠心病患者中高表達(dá)，LOXL1-AS1 與miR-16-5p 結(jié)合來下調(diào)miR-16-5p的表達(dá)，從而增強(qiáng)氧化低密度脂蛋白誘導(dǎo)的人冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞焦亡［22］。敲低LOXL1-AS1 對(duì)增殖和遷移產(chǎn)生抑制作用，而加速血管平滑肌細(xì)胞和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡［23］。此外，在骨關(guān)節(jié)炎軟骨組織中，LOXL1-AS1 上調(diào)，沉默LOXL1-AS1 會(huì)阻礙軟骨細(xì)胞的增殖和炎癥（IL-6、IL-8 表達(dá)）［9］。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，OGD 處理的HBMEC 顯示出增加的LOXL1-AS1 水平，提示LOXL1-AS1 可能在OGD 介導(dǎo)的HBMEC 炎癥和凋亡中發(fā)揮潛在作用。抑制LOXL1-AS1 可增加OGD 誘導(dǎo)的HBMEC 存活，并減輕凋亡和炎性因子IL-6、IL-1β 和TNF-α 水平，表明抑制LOXL1-AS1 可以促進(jìn)細(xì)胞存活、減輕凋亡并減弱炎性因子水平，從而改善OGD 誘導(dǎo)的HBMEC損傷。

本研究進(jìn)一步考察了LOXL1-AS1發(fā)揮作用的機(jī)制。前人已發(fā)現(xiàn)LOXL1-AS1 可充當(dāng)海綿miRNA 的ceRNA，例如miR-28-5p［24］、miR-708-5p［25］、miR-21［26］。本研究發(fā)現(xiàn)，LOXL1-AS1 直接與HBMEC 中的miR-761 結(jié)合。miR-761 在急性心肌梗死和缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的HL-1 細(xì)胞中下調(diào)，miR-761 過表達(dá)減輕了缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的HL-1細(xì)胞損傷［27］。miR-761保護(hù)心肌細(xì)胞免受過氧化氫和缺血/再灌注誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和心肌梗死的影響［28］。miR-761 在動(dòng)脈粥樣硬化中以自噬依賴性方式抑制泡沫細(xì)胞形成并減少致動(dòng)脈粥樣硬化炎癥細(xì)胞因子IL-1β和IL-18的產(chǎn)生［29］。然而尚未報(bào)道m(xù)iR-761 與缺血性卒中之間的關(guān)聯(lián)。本研究證明，過表達(dá)miR-761促進(jìn)OGD處理的HBMEC的存活，抑制細(xì)胞凋亡和炎性因子水平。表明miR-761對(duì)缺血性卒中的潛在保護(hù)效果。此外，抑制miR-761可以逆轉(zhuǎn)抑制LOXL1-AS1對(duì)OGD 誘導(dǎo)的HBMEC 存活、凋亡和炎性因子的影響，表明抑制miR-761 逆轉(zhuǎn)了抑制LOXL1-AS1 的保護(hù)作用?？傊?，這些數(shù)據(jù)證明LOXL1-AS1 通過在OGD 處理的HBMEC 中靶向miR-761，調(diào)節(jié)細(xì)胞存活、凋亡和炎性因子水平。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)抑制LOXL1-AS1 可增強(qiáng)OGD 誘導(dǎo)的HBMEC 存活，并抑制凋亡和炎性因子水平，保護(hù)細(xì)胞損傷，其機(jī)制可能與靶向上調(diào)miR-761 表達(dá)有關(guān)。這有助于更好的理解LOXL1-AS1 和miR-761在缺血性卒中中的作用，二者可能是治療卒中的候選靶點(diǎn)。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：徐楓負(fù)責(zé)設(shè)計(jì)論文框架、起草論文；黎村豐負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)操作、研究過程的實(shí)施；朱觀祥負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)收集、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析、繪制圖表；徐楓負(fù)責(zé)論文修改、擬定寫作思路、指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。