右美托咪定對癲癇大鼠海馬神經(jīng)元凋亡及BDNF/TrκB信號通路的影響

趙 莉， 范翠翠

癲癇是一種腦功能障礙的慢性綜合征，神經(jīng)元突發(fā)性異常放電是其主要原因［1］。在癲癇發(fā)作過程中，機體神經(jīng)化學(xué)和生理學(xué)功能異常，可造成腦水腫、心律失常、體溫失調(diào)、電解質(zhì)和葡萄糖的紊亂、橫紋肌溶解綜合征以及認(rèn)知功能受損等，甚至猝死［2］。神經(jīng)元凋亡是癲癇發(fā)作后大腦損傷的重要形式［3］。因此，防治癲癇發(fā)作后神經(jīng)元凋亡具有重要意義。研究顯示，腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）以及介導(dǎo)其生物學(xué)效應(yīng)的受體-酪氨酸激酶受體B（TrκB）與多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展都有關(guān)［4］。研究顯示，激活BDNF/TrκB信號通路可以改善阿爾茨海默病大鼠的記憶障礙［5］。作為一種α2-腎上腺素受體激動劑，右美托咪定具有抗交感、鎮(zhèn)靜及鎮(zhèn)痛等作用［6］。右美托咪定對腦血管病也具有治療效果，楊永紅等［7］研究發(fā)現(xiàn)，右美托咪定在改善腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)損傷方面療效顯著。但其在抗癲癇方面的作用以及機制尚不清楚。本研究擬基于BDNF/TrκB信號通路，探討右美托咪定對癲癇發(fā)作后海馬神經(jīng)元凋亡的影響及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 SPF 級別雄性SD 大鼠，8～10 周齡，體質(zhì)量244～274 g，購自南京偉沃生物科技有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK（蘇）2021-0012，大鼠飼養(yǎng)于溫度為（21～24）℃，相對濕度為（57～62）%，12 h光暗循環(huán)的環(huán)境中，本研究經(jīng)復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院吳淞醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)編號：JCLS-2022-11-02）。

1.1.2 主要藥物與試劑 鹽酸右美托咪定注射液、氯化鋰、腫瘤壞死因子（TNF-α）、白介素（IL-6）ELISA 試劑盒、鹽酸匹羅卡品、BCA 試劑盒（批號分別 為 DS29050、DS14681、DS58930、DS23582、DS28442、DS53821）均購自江西中洪博元生物技術(shù)有限公司；BDNF/TrκB 通路激活劑（LM22B-10，純度＞99%）、TUNEL 凋亡檢測試劑盒、硫酸阿托品、ECL試劑、蛋白裂解液（批號分別為BS25011、BS49142、BS52855、BS27589、BS59202）均購自杭州鉑賽生物科技有限公司；鼠源β-微管蛋白Ⅲ（Tuj1）一抗、羊抗鼠二抗、兔源BDNF、TrκB、B 細(xì)胞淋巴瘤-2 相關(guān)X 蛋白（Bax）、B 細(xì)胞淋巴瘤-2（Bcl-2）、β-actin、羊抗兔二抗（批號分別為KJ10940、KJ52015、KJ58292、KJ25829、KJ57193、KJ53820、KJ25810、KJ41847）均購自江蘇凱基生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 主要儀器 LW3000T 型顯微鏡、SpectraMax M2 型酶標(biāo)儀、Quantum CX5 型凝膠成像儀均購自武漢天德生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 癲癇模型的建立及分組給藥 構(gòu)建癲癇大鼠模型［8，9］：大鼠腹腔注射127 mg/kg 的氯化鋰溶液，24 h后腹腔注射1 mg/kg的硫酸阿托品，30 min后注射30 mg/kg 的鹽酸匹羅卡品。根據(jù)Racine 分級進(jìn)行癲癇發(fā)作評定［10］，Ⅰ：嘴和面部抽動；Ⅱ：肌陣攣性運動，但無直立；Ⅲ：肌陣攣，伴直立；Ⅳ：全身陣攣性直立；Ⅴ：全身強直陣攣，姿勢控制喪失（摔倒）。造模成功的標(biāo)準(zhǔn)是達(dá)Racine 分級Ⅳ以上，并持續(xù)15 min以上［8］。將造模成功的36只大鼠隨機分為模型組、右美托咪定組（50 μg/kg）［11］、右美托咪定+LM22B-10 組（50 μg/kg+5 mg/kg）［12］，每組12 只。另取12 只健康大鼠按照上述造模方法注射等量生理鹽水作為對照組。

建模結(jié)束后，右美托咪定組根據(jù)參考文獻(xiàn)［11］給予大鼠50 μg/kg 右美托咪定腹腔注射（將右美托咪定和生理鹽水混溶成濃度為5 μg/ml的溶液，注射體積10 ml/kg）；右美托咪定+LM22B-10 組大鼠給予50 μg/kg 右美托咪定腹腔注射和5 mg/kg LM22B-10側(cè)腦室注射［12］（將右美托咪定、LM22B-10 分別和生理鹽水混溶成濃度分別為5 μg/ml、0.5 mg/ml 的溶液，注射體積10 ml/kg）；對照組和模型組大鼠腹腔注射等體積生理鹽水。各組每天注射1次，連續(xù)1周。

1.2.2 大鼠癲癇發(fā)作頻率和持續(xù)時間觀察給藥結(jié)束24 h后，于上午9：00～12：00，下午3：00～6：00，記錄大鼠癲癇發(fā)作頻率和持續(xù)時間。

1.2.3 TUNEL染色觀察大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡情況 行為學(xué)觀察結(jié)束后，處死大鼠，收集海馬CA1區(qū)處腦組織，分為兩部分，一部分置于-70 ℃冰箱保存，另一部分用4%多聚甲醛固定，制作石蠟切片，厚度為4 μm。取部分切片，脫蠟、復(fù)水，蛋白酶K工作液進(jìn)行細(xì)胞通透操作，加入TUNEL 試劑常溫避光孵育1 h，含HRP 的抗熒光素抗體室溫避光孵育0.5 h，DAB 試劑顯色7 min，每一步驟間用PBS 漂洗3次（每次5 min），細(xì)胞核采用蘇木素復(fù)染，顯微鏡下觀察。每張切片隨機選取5 個視野，記錄視野內(nèi)棕褐色的陽性染色細(xì)胞數(shù)，即為凋亡細(xì)胞數(shù)，計算平均值。

1.2.4 免疫熒光染色檢測大鼠海馬CA1區(qū)腦組織Tuj1 陽性細(xì)胞情況 取1.2.3 中石蠟切片，脫蠟洗滌后，進(jìn)行抗原修復(fù)，室溫封閉1 h，加入稀釋好的鼠源Tuj1（1∶1 500）一抗，4 ℃孵育過夜，加入羊抗鼠二抗（1∶2 500），室溫孵育2 h，對細(xì)胞核進(jìn)行DAPI染色后，熒光顯微鏡下觀察，紅色熒光即為Tuj1陽性細(xì)胞。用Image J處理圖像，結(jié)果以Tuj1陽性細(xì)胞數(shù)目/mm2表示。

1.2.5 大鼠海馬CA1區(qū)腦組織中TNF-α、IL-6水平的測定 取1.2.3中海馬CA1區(qū)腦組織，研磨勻漿，4 ℃下11 200 r/min 離心15 min，取上清，ELISA法檢測上清液中TNF-α、IL-6水平。

1.2.6 大鼠海馬CA1區(qū)腦組織中BDNF、TrκB、Bax、Bcl-2 的蛋白表達(dá)水平的測定 取1.2.3 中大鼠海馬CA1區(qū)腦組織，研磨勻漿，蛋白裂解液裂解，定量總蛋白濃度，取蛋白樣品85 μg，電泳分離，轉(zhuǎn)膜，用5%的脫脂奶粉室溫下孵育1.5 h。加入稀釋好的兔源BDNF（1∶1 200）、TrκB（1∶1 450）、Bax（1∶1 500）、Bcl-2（1∶1 500）、β-actin（1∶2 000）一抗，4 ℃孵育過夜，加入羊抗兔二抗（1∶2 400），室溫下孵育2 h，ECL 試劑顯影，以β-actin 為內(nèi)參，Image J軟件分析定量各組蛋白的灰度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

使用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料以-x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較行SNK-q檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 右美托咪定對癲癇大鼠癲癇行為的影響 與對照組相比，模型組大鼠癲癇發(fā)作頻率、持續(xù)時間顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，右美托咪定組、右美托咪定+LM22B-10 組大鼠癲癇發(fā)作頻率、持續(xù)時間顯著降低（P＜0.05）；與右美托咪定組相比，右美托咪定+LM22B-10 組大鼠癲癇發(fā)作頻率、持續(xù)時間顯著升高（P＜0.05）（見表1）。

表1 各組大鼠癲癇發(fā)作頻率、持續(xù)時間的比較（±s，n=12）

表1 各組大鼠癲癇發(fā)作頻率、持續(xù)時間的比較（±s，n=12）

與對照組相比aP＜0.05；與模型組相比bP＜0.05；與右美托咪定組相比cP＜0.05。

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2.2 右美托咪定對癲癇大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡和海馬CA1區(qū)腦組織Tuj1 陽性細(xì)胞的影響與對照組相比，模型組大鼠海馬神經(jīng)元凋亡細(xì)胞數(shù)目顯著升高，海馬CA1區(qū)腦組織Tuj1 陽性細(xì)胞數(shù)目顯著降低（P＜0.05）；與模型組相比，右美托咪定組、右美托咪定+LM22B-10 組大鼠海馬神經(jīng)元凋亡細(xì)胞數(shù)目顯著降低，海馬CA1區(qū)腦組織Tuj1 陽性細(xì)胞數(shù)目顯著升高（P＜0.05）；與右美托咪定組相比，右美托咪定+LM22B-10 組大鼠海馬神經(jīng)元凋亡細(xì)胞數(shù)目顯著升高，海馬CA1區(qū)腦組織Tuj1 陽性細(xì)胞數(shù)目顯著降低（P＜0.05）（見表2、圖1、圖2）。

圖1 各組大鼠海馬神經(jīng)元TUNEL染色圖（400×）

表2 各組大鼠海馬神經(jīng)元凋亡細(xì)胞數(shù)目和海馬CA1區(qū)腦組織Tuj1陽性細(xì)胞數(shù)目的比較（±s，n=12）

表2 各組大鼠海馬神經(jīng)元凋亡細(xì)胞數(shù)目和海馬CA1區(qū)腦組織Tuj1陽性細(xì)胞數(shù)目的比較（±s，n=12）

與對照組相比aP＜0.05；與模型組相比bP＜0.05；與右美托咪定組相比cP＜0.05。

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2.3 右美托咪定對癲癇大鼠海馬CA1區(qū)腦組織中TNF-α、IL-6 水平的影響 與對照組相比，模型組大鼠海馬CA1區(qū)腦組織中TNF-α、IL-6 水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，右美托咪定組、右美托咪定+LM22B-10 組大鼠海馬CA1區(qū)腦組織中TNF-α、IL-6 水平顯著降低（P＜0.05）；與右美托咪定組相比，右美托咪定+LM22B-10 組大鼠海馬CA1區(qū)腦組織中TNF-α、IL-6 水平顯著升高（P＜0.05）（見表3）。

表3 各組大鼠海馬CA1區(qū)腦組織中TNF-α、IL-6 水平的比較（±s，n=12，pg/mg）

表3 各組大鼠海馬CA1區(qū)腦組織中TNF-α、IL-6 水平的比較（±s，n=12，pg/mg）

注：與對照組相比aP＜0.05；與模型組相比bP＜0.05；與右美托咪定組相比cP＜0.05。

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2.4 右美托咪定對癲癇大鼠海馬CA1區(qū)腦組織中BDNF、TrκB、Bax、Bcl-2 蛋白表達(dá)水平的影響 與對照組相比，模型組海馬CA1區(qū)腦組織中BDNF、TrκB、Bax 蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）；與模型組相比，右美托咪定組、右美托咪定+LM22B-10 組大鼠海馬CA1區(qū)腦組織中BDNF、TrκB、Bax蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），Bcl-2 蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）；與右美托咪定組相比，右美托咪定+LM22B-10 組大鼠海馬CA1區(qū)腦組織中BDNF、TrκB、Bax 蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），Bcl-2 蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）（見圖3、表4）。

圖3 各組大鼠海馬CA1區(qū)腦組織中BDNF、TrκB、Bax、Bcl-2 蛋白印跡圖

表4 各組大鼠海馬CA1區(qū)腦組織中BDNF、TrκB、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)水平的比較（±s，n=12）

表4 各組大鼠海馬CA1區(qū)腦組織中BDNF、TrκB、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)水平的比較（±s，n=12）

注：與對照組相比aP＜0.05；與模型組相比bP＜0.05；與右美托咪定組相比cP＜0.05。

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3 討 論

海馬神經(jīng)元凋亡是癲癇持續(xù)狀態(tài)后神經(jīng)細(xì)胞丟失的重要形式［13］。研究顯示，癲癇發(fā)作后還伴隨著神經(jīng)炎癥反應(yīng)，會引起腦組織細(xì)胞神經(jīng)炎性損傷［14］。本研究構(gòu)建癲癇大鼠模型，其病理學(xué)表現(xiàn)類似于顳葉癲癇，其行為表現(xiàn)遵循Racine標(biāo)準(zhǔn)。同時，模型組大鼠癲癇發(fā)作頻率、持續(xù)時間、海馬神經(jīng)元凋亡細(xì)胞數(shù)目、海馬CA1區(qū)腦組織TNF-α、IL-6 水平較對照組顯著升高，表明癲癇大鼠神經(jīng)元凋亡情況加重，存活神經(jīng)元減少，同時伴隨炎癥反應(yīng)。

右美托咪定可與不同的α2 受體亞型結(jié)合后產(chǎn)生相應(yīng)的鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抗焦慮、血壓升高等作用。研究發(fā)現(xiàn)，右美托咪定能減輕腦缺血再灌注損傷大鼠神經(jīng)炎癥和神經(jīng)元損害，改善腦細(xì)胞凋亡，是一種神經(jīng)保護(hù)劑［15］，其在臨床治療老年精神病患者無抽搐電休克方面效果顯著［16］。Bax和Bcl-2是凋亡調(diào)控蛋白，Bax 促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而Bcl-2 作為抗凋亡蛋白，功能與之相反［17，18］。Tuj1 是一種微管蛋白，也是神經(jīng)元的標(biāo)志物之一，其表達(dá)越高表示神經(jīng)元存活數(shù)越多［19］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相比于模型組，右美托咪定組大鼠癲癇發(fā)作頻率、持續(xù)時間、海馬神經(jīng)元凋亡細(xì)胞數(shù)目、海馬CA1區(qū)腦組織TNF-α、IL-6 水平、Bax 蛋白表達(dá)水平顯著降低，海馬CA1區(qū)腦組織Tuj1 陽性細(xì)胞數(shù)目、Bcl-2 蛋白表達(dá)水平顯著升高，提示右美托咪定干預(yù)可以顯著降低癲癇大鼠的發(fā)作頻率和持續(xù)時間以及神經(jīng)元凋亡數(shù)量，增加神經(jīng)元存活數(shù)目，抑制炎癥反應(yīng)。

BDNF 能影響神經(jīng)元的存活、分化和維持，還在成熟海馬的興奮性和神經(jīng)遞質(zhì)合成方面具有重要調(diào)控作用［20］。作為BDNF 的受體TrκB，與BDNF結(jié)合時，引發(fā)酪氨酸磷酸化，進(jìn)而觸發(fā)一系列級聯(lián)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，參與多種生理反應(yīng)［21］。Javaid 等［22］研究報道，癲癇小鼠腦組織中BDNF/TrκB 信號傳導(dǎo)被激活，使得腦組織促炎細(xì)胞因子活性升高，而經(jīng)噻加賓治療后癲癇小鼠腦組織氧化應(yīng)激、BDNF/TrκB信號傳導(dǎo)和促炎細(xì)胞因子活性受到抑制，癲癇癥狀得到顯著改善［23］。除此之外，BDNF/TrκB 信號通路的激活還可引起海馬興奮環(huán)路的建立，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣離子內(nèi)流，增強興奮性突觸后電位［24］。本研究結(jié)果顯示，癲癇大鼠海馬CA1區(qū)腦組織中BDNF、TrκB 蛋白表達(dá)水平顯著升高，而右美托咪定干預(yù)后BDNF、TrκB 蛋白表達(dá)水平顯著降低。在右美托咪定基礎(chǔ)上添加BDNF/TrκB 通路激活劑LM22B-10后，癲癇大鼠發(fā)作頻率、持續(xù)時間以及海馬神經(jīng)元凋亡細(xì)胞數(shù)目、海馬CA1區(qū)腦組織TNF-α、IL-6 水平、BDNF、TrκB、Bax蛋白表達(dá)水平較右美托咪定組顯著升高，海馬CA1區(qū)腦組織Tuj1陽性細(xì)胞數(shù)目、Bcl-2蛋白表達(dá)水平較右美托咪定組顯著降低，提示右美托咪定引起的減弱癲癇大鼠神經(jīng)元細(xì)胞凋亡能力被LM22B-10 抑制，進(jìn)一步提示右美托咪定可能通過阻斷BDNF/TrκB 通路的激活發(fā)揮改善大鼠癲癇發(fā)作、抑制海馬神經(jīng)元凋亡及炎癥反應(yīng)的目的。

綜上所述，右美托咪定能降低癲癇大鼠的癲癇發(fā)作以及抑制海馬神經(jīng)元的凋亡，減輕大鼠炎癥反應(yīng)，其機制可能與抑制BDNF/TrκB 信號通路的激活有關(guān)。但本研究僅探究了右美托咪定通過BDNF/TrκB 信號通路對癲癇大鼠的作用，右美托咪定能否通過其他信號通路發(fā)揮抗癲癇作用，有待后續(xù)研究。

倫理學(xué)聲明：本研究方案經(jīng)復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院吳淞醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)編號：JCLS-2022-11-02）。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：趙莉負(fù)責(zé)論文設(shè)計、撰寫論文；范翠翠負(fù)責(zé)論文修改并最后定稿。