基于比較基因組學的解脂亞羅酵母CA20高產(chǎn)赤蘚糖醇機理及進化分析

夏凱，劉芳美，陳雨晴，陳珊珊，黃春瑩，趙學群，沙如意，黃俊

研究報告

基于比較基因組學的解脂亞羅酵母CA20高產(chǎn)赤蘚糖醇機理及進化分析

夏凱，劉芳美，陳雨晴，陳珊珊，黃春瑩，趙學群，沙如意，黃俊

浙江科技學院生物與化學工程學院，浙江省農產(chǎn)品化學與生物加工技術重點實驗室，浙江省農業(yè)生物資源生化制造協(xié)同創(chuàng)新中心，杭州 310023

解脂亞羅酵母()是赤蘚糖醇生產(chǎn)中使用的主要菌種，復合誘變是選育優(yōu)良菌株的常用方法。然而，誘變處理所引起的基因組變化尚待探索。本研究對前期獲得的高產(chǎn)菌株CA20和原始菌株WT5進行基因組測序，并與已發(fā)布的8株解脂亞羅酵母進行比較基因組分析，旨在探究菌株CA20高產(chǎn)赤蘚糖醇的機理以及不同菌株的基因組進化關系。結果顯示，菌株CA20基因組大小為20,420,510 bp，GC堿基含量為48.97%，編碼6330個CDS和649個ncRNA，菌株CA20和其他8株菌高度同源，平均核苷酸同源性(average nucleotide identity，ANI)> 99.50%，其中與菌株IBT 446和H222具有更近的親緣關系。比較基因組分析顯示，CA20和其他8株菌共有5342個核心基因，而CA20特有的65個基因主要參與物質跨膜運輸和蛋白質轉運過程。CA20基因組中含有166個碳水化合物活性酶(carbohydrate-active enzymes，CAZymes)基因，遠多于其他菌株(108～137個)，包括特有的4個糖苷水解酶類(glycoside hydrolases，GHs)、2個糖基轉移酶類(glycosyltransferases，GTs)和13個碳水化合物酯酶類(carbohydrate esterases，CEs)。除轉醛酶TAL1外，赤蘚糖醇代謝途徑有關酶在不同菌株中高度保守。此外，菌株CA20的赤蘚糖醇產(chǎn)量和產(chǎn)率為190.97 g/L和1.33 g/L/h，顯著高于WT5的128.61 g/L和0.92 g/L/h (<0.001)。相比于WT5，CA20中5個基因發(fā)生移碼變異，15個基因存在非同義突變位點，這些基因主要參與細胞分裂、細胞壁合成、蛋白質合成及穩(wěn)態(tài)維持等過程。以上結果表明，解脂亞羅酵母基因組在進化過程中保守；生存環(huán)境不同是導致菌株間基因組差異的重要因素；基因組中CAZymes數(shù)量的差異是不同菌株間性能差異的原因之一；菌株CA20高產(chǎn)赤蘚糖醇與其細胞結構及內環(huán)境穩(wěn)定性的提升有關。本研究結果為赤蘚糖醇高產(chǎn)菌株的定向選育提供基礎。

解脂亞羅酵母；赤蘚糖醇；比較基因組；移碼變異；蛋白激酶

糖過量攝入造成的肥胖、糖尿病等健康問題給人們的生活造成了困擾[1,2]。甜味劑的合理使用有助于降低食品中高熱量糖的添加，從而達到減少糖攝入的目的。赤蘚糖醇(erythritol)，化學名為(2R, 3S)-butane-1, 2, 3, 4-丁四醇，是一種白色、不吸濕、無光學活性、熱穩(wěn)定性好以及易溶于水的四碳醇，廣泛存在于水果、蔬菜和發(fā)酵食品中[3,4]。近年來，天然甜味劑赤蘚糖醇憑借獨特的理化性質如熱值低、基本不被人體代謝、穩(wěn)定性高和食用不會引起腸道不適等受到廣泛關注，市場需求量持續(xù)增加。據(jù)預測，到2025年，其市場需求將達到48.9萬噸左右，這對赤蘚糖醇的生產(chǎn)提出了新要求[5,6]。

赤蘚糖醇主要通過微生物發(fā)酵進行生產(chǎn)，所用菌種為解脂亞羅酵母()[7]。解脂亞羅酵母可以利用葡萄糖、甘油等為底物，通過磷酸戊糖途徑代謝合成赤蘚糖醇，整個過程由葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase，ZWF1)、6-磷酸葡萄糖酸內酯酶(6-phosphogluconolactonase，PGLS)、磷酸葡萄糖酸脫氫酶(phosphogluconate dehydrogenase，GND1)、核酮糖磷酸 3-差向異構酶(ribulose phosphate 3-epimerase，RPE1)、核酮糖-5-磷酸異構酶 (ribulose-5-phosphate isomerase，RPI)、轉酮酶(transketolase，TKL1)、轉醛酶(transaldolase，TAL1)、赤蘚糖-4-磷酸激酶(erythrose-4-phosphate kinase，E4PK)和赤蘚糖還原酶(erythrose reductase，ER)共同催化完成[2,8,9]。目前，赤蘚糖醇生產(chǎn)過程中存在成本較高、冷卻能耗大以及生產(chǎn)效率低等問題[1,10]。因此，如何有效降低赤蘚糖醇生產(chǎn)成本一直備受關注。

提高單位時間內細胞的赤蘚糖醇產(chǎn)量是降低生產(chǎn)成本的有效舉措，目前采用較多的方法是菌種誘變選育、發(fā)酵工藝優(yōu)化和代謝途徑改造[4,11,12]。其中，誘變選育是重要的基礎性工作。通過紫外線(ultraviolet，UV)輻射、硫酸二乙酯(diethyl sulphate，DES)處理、以及常壓室溫等離子體(atmospheric and room temperature plasma，ARTP)誘變等方法，研究人員已獲得產(chǎn)量顯著增加的優(yōu)勢突變株[13～15]。然而，已報道的不同菌種間性能差異顯著，同時對于誘變所引起性狀變化的潛在機制尚未清楚。誘變處理可以引起菌種DNA發(fā)生突變和重組，進而產(chǎn)生新的性狀[16]。然而，誘變所引起的性狀變化具有隨機性。因此，探究誘變處理所引起的基因組序列變化有助于闡明菌種高產(chǎn)赤蘚糖醇背后的機制，挖掘適用于高產(chǎn)菌株定向構建的新靶點。

課題組前期利用60Co-γ射線輻射結合ARTP復合誘變處理，已獲得一株高產(chǎn)赤蘚糖醇且遺傳性能穩(wěn)定的解脂亞羅酵母CA20，具有較大的工業(yè)應用潛力[17]。為進一步揭示CA20高產(chǎn)赤蘚糖醇的分子機制，深入了解并挖掘其基因資源，本研究對CA20進行全基因組測序，同時對原始菌株WT5進行重測序分析，比較分析高產(chǎn)菌和原始菌株之間的基因組序列差異。此外，通過比較基因組學分析，比較菌株CA20和已公布的解脂亞羅酵母菌株的基因組異同，分析不同菌株的進化關系。同時，分析碳水化合物活性酶(carbohydrate-active enzymes，CAZymes)家族的多樣性，明確赤蘚糖醇代謝途徑中關鍵酶的保守性，以期為進一步利用基因工程技術定向構建優(yōu)良菌株提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株和培養(yǎng)條件

解脂亞羅酵母CA20保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC: M2022880)。研究中所用原始菌株WT5由浙江科技學院生物與化學工程學院生物工程實驗室保存。菌種活化采用YPD (yeast extract peptone dextrose medium)培養(yǎng)基：D-葡萄糖20 g/L、酵母浸出粉(Oxoid) 10 g/L、蛋白胨(Oxoid) 5 g/L、NaCl 5 g/L、KH2PO40.5 g/L，pH值6.0。發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖濃度更換為300 g/L，其他成分濃度保持不變。

赤蘚糖醇發(fā)酵實驗[17]：挑取單菌落過夜活化培養(yǎng)，之后以5% (v/v)比例轉接于30 mL YPD培養(yǎng)基(250 mL 搖瓶)中于30 °C、200 r/min 條件下培養(yǎng)24 h制備一級種子液；而后以5%比例轉接于80 mL (500 mL 搖瓶)YPD培養(yǎng)基中培養(yǎng)制備二級種子液，之后以10%比例轉接于6.0 L發(fā)酵培養(yǎng)基(發(fā)酵罐體積10 L)；控制通氣量在0.6 vvm，轉速600 r/min，罐壓0.1 MPa，發(fā)酵周期為6天，消泡劑自動添加，發(fā)酵過程中不進行補料和pH調節(jié)。發(fā)酵過程中每隔24 h取樣測定赤蘚糖醇濃度、葡萄糖濃度和菌液OD600。

1.2 赤蘚糖醇及葡萄糖檢測

產(chǎn)物和底物濃度測定采用高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)，具體過程參照文獻所述[17]。取樣后離心收集上清(8000 r/min，5 min)，過0.22 μm濾膜，保存于–20 ℃?zhèn)溆?。樣品檢測采用e2695高效液相色譜儀(美國Waters公司)、Aminex HPX-87H分析柱(300 mm× 7.8 mm) (美國Bio-Rad公司)、2414示差折光檢測器(美國Waters公司)。檢測條件為柱溫35 °C，上樣量10 μL，流動相為5 mmol/L硫酸，流速0.6 mL/min。

1.3 基因組提取與測序

菌株CA20和WT5基因組DNA的提取參照真菌基因組DNA提取試劑盒(OMEGA)說明進行。采用TBS-380 fluorometer(美國Turner BioSystems公司)對提取的DNA進行定量。高質量DNA樣品(OD260/280= 1.8～2.0，> 6 μg)用于后續(xù)文庫構建和測序。

文庫構建和測序工作由上海凌恩生物科技有限公司完成。采用Illumina NovaSeq PE150二代測序(美國Illumina公司)結合PacBio Sequel II三代測序平臺(美國Pacific Biosciences公司)完成CA20的全基因組測序以及WT5的重測序分析。

1.4 基因組組裝與基因分析

使用軟件Trimmomatic (v0.39，http://www. usadellab.org/cms/index.php?page=trimmomatic)去除測序過程中產(chǎn)生的質量較低的序列。利用軟件MaSuRCA (v4.0.8，http://www.genome.umd.edu/ masurca.html)對二代Illumina reads和三代PacBio long-reads進行混合組裝。使用軟件Canu (v2.1.1，https://github.com/marbl/canu)組裝三代PacBio long- reads，同時使用軟件MUMmer (v4.0，http:// mummer.sourceforge.net/)整合MaSuRCA和Canu的組裝結果，并去冗余。最后使用軟件Racon (https:// github.com/isovic/racon)和Pilon (https://github.com/ broadinstitute/pilon/wiki)對整合后的基因組序列進行3輪polish和堿基校正。

以數(shù)據(jù)庫中已報道的解脂亞羅酵母基因組序列為參考，采用AUGUSTUS(v3.2.3)軟件 (http://bioinf. uni-greifswald.de/augustus/)對CA20基因組進行de novo基因預測。利用參考基因組的蛋白序列進行同源比對預測，過濾較差結果，去冗余，之后運行軟件Genewise (v2.4.1，https://www.ebi.ac.uk/seqdb/ confluence/display/THD/GeneWise)做精確比對，確定基因編碼區(qū)和內含子區(qū)。利用軟件EVidenceModeler (v1.1.1，http://evidencemodeler.github.io/)對所預測基因集進行整合，得到樣品基因組編碼基因。非編碼RNA (non-coding RNA，ncRNA)包括sRNA、snRNA、miRNA、tRNA及rRNA的預測采用rRNAmmer(v1.2)、tRNAscan-SE(v2.0.7)以及Rfam(v14.9)等軟件。串聯(lián)重復序列(tandem repeat，TR)的預測采用軟件RepeatMasker (v4.1.5，http://www.repeatmasker.org/)。

1.5 基因功能注釋

將預測基因的蛋白序列分別與NR (non-redundant protein database，http://www.ncbi. nlm.nih.gov/)、Swiss-Prot (https://www.uniprot.org/ downloads#uniprotkblink)、eggNOG (evolutionary genealogy of genes：non-supervised orthologous groups，http://eggnogdb.embl.de/)、GO (gene ontology，http://geneontology.org/)和KEGG (kyoto encyclopedia of genes and genomes，http://www.genome.jp/kegg/)數(shù)據(jù)庫進行blastp比對(BLAST+ 2.7.1，值小于10–5)，注釋相關基因的功能。碳水化合物相關酶(CAZymes)的注釋采用碳水化合物活性酶數(shù)據(jù)庫(http:// www.cazy.org/)[18]。蛋白質結構域分析采用NCBI CDD v3.20-59693 PSSMs數(shù)據(jù)庫(Conserved Domain Database，值小于10–3，https://www.ncbi.nlm.nih. gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi?)。

1.6 基因組序列比較與分析

將CA20基因組序列和NCBI數(shù)據(jù)庫中已完成測序的8株解脂亞羅酵母基因組進行比對分析，基因組序列信息如表1所示。使用MUMmer(v3.23)軟件對目標基因組和參考基因組進行比對，確定基因組間的大范圍共線性關系。然后使用LASTZ (v1.03.54)對區(qū)域間進行比對，確認局部位置排列關系，查找易位(translocation，TRA)，倒置(inversion，INV)和易位+倒置(TRA+INV)區(qū)域。采用pyani (https://github.com/widdowquinn/pyani)對樣本進行平均核苷酸同源性(average nucleotide identity，ANI) 聚類分析。

利用MUMmer軟件將每個樣品與參考序列進行全局比對，找出樣品序列與參考序列之間的差異位點并進行初步過濾，檢測潛在單核苷酸多態(tài)性位點(single nucleotide polymorphism，SNP)。提取參考序列SNP位點兩邊各100 bp序列，然后使用BLAT(v35)軟件將提取的序列和組裝結果進行比對，驗證SNP位點。利用LASTZ軟件將樣品和參考序列進行比對，檢測得到初步插入和缺失(insertion + deletion，Indel)結果。然后取參考序列Indel位點上下游150 bp與樣品的測序reads用軟件BWA (v0.7.12-r1039)及SAMtools(v1.17，http://www.htslib. org/)進行比對驗證，過濾得到可靠的Indel。利用軟件ANNOVAR(v2019Oct24)對所鑒定的SNP和Indel位點進行注釋。此外，利用軟件BreakDancer(v 1.1.2)鑒定染色體結構變異區(qū)域(structure variants，SV)。

表1 基因組信息

同源基因分析采用軟件cd-hit (v4.6.1，http://cd-hit.org)。利用軟件對需要分析的多個樣品的蛋白序列進行聚類分析(identity > 50%，coverage > 50%)，所有樣本中均存在的同源基因作為共有基因(core gene)，其余為不同樣品中的特有基因(specific gene)?；谕椿蚍治?，利用軟件MUSCLE (v3.8.31)進行蛋白多序列的比對，比對結果用于進化樹構建。采用PhyML(v3.0)軟件(http://www.atgc- montpellier.fr/phyml/)基于最大似然法(1000 boot-strap)構建全基因組系統(tǒng)進化樹。赤蘚糖醇代謝途徑中相關酶的比較分析由NCBI在線BLAST完成，以菌株CA20的蛋白序列為參考序列進行搜索比對。

1.7 重測序分析結果驗證

以菌株CA20基因組為參考序列，對菌株WT5進行基因組重測序分析，針對由于基因突變或插入、缺失突變引起的基因缺失及蛋白非同義突變，采用PCR方法進行體外擴增驗證。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

研究中所涉及生物學實驗均重復三次以上，每次3組平行，數(shù)據(jù)差異顯著性分析由Origin 9.0軟件中的ANOVA(analysis of variance)分析方法完成[19]，選用Bonferroni多重比較，<0.05為兩組數(shù)據(jù)間差異顯著。圖片組合采用軟件Adobe Illustrator CC 2022。部分圖表的繪制由凌波微課在線云平臺完成(http://www.cloud.biomicroclass.com/CloudPlatform)。

2 結果與分析

2.1 菌株CA20基因組特征及系統(tǒng)發(fā)育分析

菌株CA20的基因組大小為20,420,510 bp (不包含線粒體)，含有6條染色體(表2)。基因組的平均GC含量為48.97%，包含6330個CDS，基因平均長度為1437 bp，基因總長占基因組的44.54%?；蚪M含有的ncRNA數(shù)量為649，包括510個tRNA，112個5S rRNA，2個18S rRNA，2個23S rRNA，以及23個snRNA (表2)。此外，串聯(lián)重復序列(TR) 的數(shù)量為9663。已報道的解脂亞羅酵母基因組大小和GC堿基含量分別在20 Mb和49%左右(表1)，CA20與其接近。已將CA20基因組序列上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫，BioProject號為PRJNA957569。

CA20基因組中分別有4033、4301、和3325個基因具有GO、COG、和KEGG注釋功能，分別占全部基因的63.71%、67.95%、以及52.53%。COG和KEGG功能分類如圖1所示。COG功能分類中，功能未知蛋白(function unknown，S)數(shù)量最多，共539個，其次為蛋白翻譯后的修飾、伴侶蛋白(posttranslational modification，protein turnover, chaperones，O)、胞內轉運、分泌和小泡運輸(intracellular trafficking, secretion, and vesicular transport，U)、翻譯、核糖體結構和生物發(fā)生(translation, ribosomal structure and biogenesis，J)以及信號轉導機制(signal transduction mechanisms，T) 等。豐富的功能未知蛋白分類可能和CA20特殊的性狀及功能相關，同時較多的蛋白與基因表達過程相關預示著CA20具備較強的蛋白合成能力。KEGG功能分類中，較多的基因參與信號轉導(signal transduction)、翻譯(translation)、轉運和代謝(transport and catabolism)、細胞生長和死亡(cell growth and death)、碳水化合物代謝(carbohydrate metabolism)以及氨基酸代謝(amino acid metabolism)，預示著CA20具備較強的環(huán)境壓力響應能力。

表2 解脂亞羅酵母CA20基因組特征

圖1 解脂亞羅酵母CA20基因功能注釋

A：COG功能分類；B：KEGG功能分類

為探究菌株CA20和其他解脂亞羅酵母的親緣關系，從NCBI數(shù)據(jù)庫下載已完成測序的8個基因組序列用于構建全基因組系統(tǒng)發(fā)育樹(表1)。根據(jù)數(shù)據(jù)庫信息可知，除菌株DSM 3286和CLIB122未記錄分離來源外，其他菌株分離于廢水(W29、22301-5和PO1f)、奶酪(IBT 446)和泥土(H222和WSH-Z06)。雖然分離于不同環(huán)境，但是ANI分析顯示CA20和其他8株解脂亞羅酵母高度同源，ANI值>99.50% (圖2A)，其中CA20和IBT-446及H222的ANI值分別高達99.84%和99.98%，表明這三株菌進化距離更近，親緣關系更強。全基因組進化樹分析結果同樣證實CA20、IBT-446及H222處于同一分支(圖2B)。

2.2 比較基因組分析

2.2.1 基因組共線性分析

系統(tǒng)發(fā)育分析表明CA20和IBT 446以及H222具有更近的親緣關系。類似地，共線性分析顯示這三株菌的基因組線性關系更好(圖3，A和B)。同時，分析結果表明CA20和其他8株菌的基因組之間存在較大區(qū)域的倒位(inversion)和易位(translocation)現(xiàn)象。其中，和22301-5相比，易位區(qū)域存在于Chr2、Chr3、Chr4、Chr5和Chr6 (圖3C)；與DSM 3286相比，易位區(qū)域主要存在于Chr3、Chr4、Chr5和Chr6 (圖3D)；和W29、IBT 446、CLIB122、PO1f以及WSH-Z06相比，CA20的Chr2、Chr3、Chr4和Chr6染色體上均存在大區(qū)域的易位現(xiàn)象(圖4，A～D)；此外，Chr1存在倒置加易位區(qū)域。大區(qū)域基因組重排現(xiàn)象的發(fā)生可能歸結于不同菌株為適應不同生存環(huán)境而產(chǎn)生的適應性變化。

2.2.2 基因突變位點分析

除了大區(qū)域基因組重排，基因位點變異是引起菌種遺傳性狀改變的另一個重要因素。單核苷酸多態(tài)性分析(SNP)顯示，CA20和W29、DSM 3286、22301-5、CLIB122、PO1f以及WSH-Z06基因組相比存在大量突變位點，其中同義突變位點數(shù)量大于非同義突變。CA20和IBT 446以及H222之間存在的突變位點數(shù)較少，這與上文中的ANI分析結果相一致(圖5A)。此外，位點突變所引起的讀碼框改變以及CDS區(qū)域變化在不同菌株中存在差異。其中，除菌株IBT 446和H222以外，其他6株菌中發(fā)生移碼突變的基因數(shù)量均在30個以上，而CDS區(qū)域中含有插入突變的基因數(shù)量在100個以上(圖5B)。

圖2 基于全基因組序列的ANI分析和系統(tǒng)發(fā)育樹

A：核苷酸同源性分析；B：系統(tǒng)發(fā)育樹分析。

圖3 解脂亞羅酵母CA20和H222(A)、IBT 446(B)、22301-5(C)以及DSM 3286(D)基因組的共線性分析

圖4 解脂亞羅酵母CA20和W29 (A)、CLIB122 (B)、PO1f (C)以及WSH-Z06 (D)基因組的共線性分析

2.2.3 泛基因和核心基因分析

對包括CA20在內的9株解脂亞羅酵母全基因組進行同源基因聚類分析，參與分析的基因總數(shù)為57,254個。結果顯示，核心基因數(shù)量隨著樣本數(shù)量的增加而減少(圖6A)，泛基因數(shù)量隨著樣本數(shù)量的增加而逐步增加(圖6B)，表明解脂亞羅酵母基因組為開放式基因組，具備較高的遺傳多樣性。9株菌共有的核心基因數(shù)量為5342個(圖6C)。此外，各菌株存在的特有基因數(shù)量分別為65個(CA20)、64個(W29)、72個(DSM 3286)、55個(22301-5)、62個(IBT 446)、63個(H222)、242個(CLIB122)、54個(PO1f)和54個(WSH-Z06)。

圖5 解脂亞羅酵母CA20與其他菌株基因組間的單核苷酸多態(tài)性和插入缺失位點分析

A：單核苷酸突變所引起的同義突變和非同義突變位點數(shù)量；B：堿基插入或缺失所引起的基因突變數(shù)量。

圖6 解脂亞羅酵母核心基因和泛基因分析

A：核心基因分析；B：泛基因分析；C：9個基因組的共有和特有基因花瓣圖，圓圈部分為共有基因數(shù)量，花瓣部分為各個菌株中特有的基因數(shù)量。

為進一步理解不同菌株中特有基因可能發(fā)揮的功能，對這些特有基因進行GO功能注釋。結果顯示，各菌株特有的基因中未得到注釋的(not available，NA)占有較大比重，特別是菌株CLIB122中，比例高達75%以上(圖7)。在注釋的特有基因中，大部分基因所編碼蛋白均位于細胞質膜或者細胞膜(plasma membrane or membrane)。不同的是，菌株CA20和DSM 3286中部分蛋白位于線粒體(mitochondrion)，而H222和WSH-Z06中部分蛋白位于細胞核中(nucleus)(圖7A)。大部分蛋白具有跨膜轉運活性 (transmembrane transporter activity) (圖7B)。除此以外，CA20中部分蛋白具有氧化還原酶活性 (oxidoreductase activity)；DSM 3286中部分蛋白具有NADH脫氫酶活性(NADH dehydrogenase activity)以及催化活性(catalytic activity)；IBT 446中部分蛋白具有核酸結合活性(nucleic acid binding)。類似地，生物過程(BP)分析顯示不同菌株中均存在部分蛋白參與跨膜轉運(transmembrane transport) (圖7C)。此外，菌株CA20中部分蛋白參與定位(localization)；DSM 3286中部分蛋白參與好氧呼吸過程(aerobic respiration)；IBT 446中部分蛋白參與蛋白的磷酸化或酰基化或糖基化(protein phosphorylation or glycosylation or acetylation)以及DNA復制(DNA replication)；PO1f 中部分蛋白參與氨基酸轉運(amino acid transport)以及WSH-Z06中部分蛋白參與氧化壓力響應(response to oxidative stress)等特定生物過程。以上結果表明不同菌株中的特有基因一部分具有相同的分子生物學功能，參與類似生物過程；同時也存在一部分基因發(fā)揮各自特定的功能。

圖7 不同解脂亞羅酵母中特有基因的GO功能分類

A：細胞成分(cellular component，CC)；B：分子功能(molecular function，MF)；C：生物過程(biological process，BP)。

2.2.4 碳水化合物活性酶比較分析

為探索不同解脂亞羅酵母對碳水化合物利用潛力的差異，對基因組中的CAZymes進行分析。結果顯示，解脂亞羅酵母中碳水化合物活性酶數(shù)量范圍為108～166個，包括糖苷水解酶類(glycoside hydrolases，GHs)、糖苷轉移酶類(glycosyltransferases，GTs)、碳水化合物結合模塊類(carbohydrate-binding modules，CBMs)、碳水化合物酯酶類(carbohydrate esterases，CEs)和輔助模塊酶類(auxiliary activities，AAs) (表3)。其中，碳水化合物酶數(shù)量最多和最少的菌株分別是CA20和IBT 446。根據(jù)功能的不同，GHs、GTs、CBMs、CEs和AAs分別可細分為26個、28個、6個、8個和6個家族(圖8，A和B)。不同家族酶在不同菌株中的分布存在明顯差異，如GHs中的GH3、GH16、GH17、GH72和GH81，CBMs中的CBM18、CBM19和CBM21，AAs中的AA1、AA2和AA6，以及GTs中的GT1、GT4和GT39等，預示著不同解脂亞羅酵母對不同碳水化合物的利用潛力存在差異。

表3 不同解脂亞羅酵母中碳水化合物活性酶的數(shù)量

GHs：糖苷水解酶類；GTs：糖苷轉移酶類；CBMs：碳水化合物結合模塊類；CEs：碳水化合物酯酶類；AAs：輔助模塊酶類。

相比于其他解脂亞羅酵母菌株，菌株CA20含有更豐富的GH4、GH9、GH109、GH158、CBM19、CBM32、CBM43、AA1、AA2、AA4、GT28、GT34、GT90、CE1、CE3、CE4、CE9、CE10、CE12、CE14、CE16，其中GH4、GH9、GH109、GH158、GT28、GT90、CE3、CE10、CE12、CE14、CE16只存在于CA20中(圖8)?；蜃⑨岋@示，GH4為α-葡萄糖苷酶，參與淀粉水解；GH9為β-葡萄糖苷酶，參與纖維素水解；GH109為α-N-乙酰氨基半乳糖苷酶；GH158為內切-β-1,3-葡聚糖酶，參與細胞壁β-葡聚糖水解。在酯酶類中，CE10、CE12、CE14和CE16分別為芳香基酯酶、果膠甲酯酶、幾丁二糖脫乙酰酶和乙酰酯酶，參與果膠及幾丁質的降解等過程。綜上可知，解脂亞羅酵母CA20含有更豐富的碳水化合物活性酶，可能具有更好的底物水解能力。

圖8 解脂亞羅酵母中碳水化合物活性酶的家族分布

A：GHs，CBMs和AAs的數(shù)量；B：GTs 和CEs的數(shù)量。

2.2.5 赤蘚糖醇代謝途徑中關鍵酶的比較分析

解脂亞羅酵母主要利用葡萄糖為底物通過磷酸戊糖途徑代謝合成赤蘚糖醇。研究中選取和葡萄糖轉運、葡萄糖代謝、赤蘚糖醇合成直接相關的蛋白進行序列比較分析，包括6個葡萄糖轉運蛋白(YHT1-YHT6)、葡萄糖激酶和己糖激酶(GK和HK)、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(ZWF1)、6-磷酸葡萄糖酸內酯酶(PGLS)、磷酸葡萄糖酸脫氫酶(GND1)、核酮糖磷酸 3-差向異構酶(RPE1)、核酮糖-5-磷酸異構酶(RPI)、轉酮酶(TKL1)、轉醛酶(TAL1)、赤蘚糖-4-磷酸激酶(E4PK)、3個赤蘚糖還原酶(ER10、ER25和ER27)、赤蘚糖醇脫氫酶(EYD1)、赤蘚酮糖激酶(EYK1)、赤蘚酮糖-1-磷酸異構酶(EYI1)和赤蘚酮糖- 4-磷酸異構酶(EYI2)。結果顯示，除HK、YHT6和TAL1以外，其他蛋白在解脂亞羅酵母中高度保守，序列相似度達100% (圖9)。HK和YHT6編碼基因分別在菌株DSM 3286和PO1f中發(fā)生缺失；來源于W29、IBT 446和H222的轉醛酶(TAL1)和CA20中的TAL1相比相似度<85%。以上結果說明，除小部分菌株外，本文所選取解脂亞羅酵母均具有代謝合成赤蘚糖醇的潛在能力。

2.3 解脂亞羅酵母CA20和WT5性能差異分析

2.3.1 菌株CA20與WT5合成赤蘚糖醇性能的比較

根據(jù)之前菌株篩選結果，原始菌株WT5的赤蘚糖醇產(chǎn)量顯著低于菌株CA20[17]，然而其罐上發(fā)酵性能差異待分析。本研究首先比較菌株CA20和WT5發(fā)酵產(chǎn)赤蘚糖醇的性能差異。整個過程在10 L發(fā)酵罐中進行，發(fā)酵周期6天。結果顯示，在生長前24 h，菌株CA20培養(yǎng)液的OD600高于菌株WT5，24 h后兩株菌的生長無明顯差異，72 h后培養(yǎng)液OD600逐漸穩(wěn)定(圖10A)。發(fā)酵144 h后，培養(yǎng)基中葡萄糖濃度接近于0，菌株CA20的赤蘚糖醇產(chǎn)量達190.97 g/L，顯著高于菌株WT5的128.61 g/L (< 0.001，圖10B)。此外，菌株CA20利用葡萄糖合成赤蘚糖醇的得率為0.65 g/g，產(chǎn)率為1.33 g/L/h，均顯著高于菌株WT5的0.47 g/g和0.92 g/L/h (<0.001；圖10，C和D)。以上結果表明，菌株CA20和WT5在發(fā)酵產(chǎn)赤蘚糖醇的性能上存在明顯差異。

圖9 赤蘚糖醇代謝途徑中關鍵酶的比較分析

YHT1-YHT6：glucose transporter (XP_501516.1，XP_501621.1，XP_505610.1，XP_504302.1，XP_500382.1，and XP_500566.1)； GK：glucokinase (VBB78679.1)；HK：hexokinase (XP_501216.1)；ZWF1：glucose-6-phosphate dehydrogenase (XP_504275.1)；PGLS：6-phosphogluconolactonase (VBB78832.1)；GND1：phosphogluconate dehydrogenase (XP_500938.1)； RPE1：ribulose phosphate 3-epimerase (QNP96251.1)；RPI：ribulose-5-phosphate isomerase (XP_500588.1)；TKL1：transketolase (XP_503628.1)；TAL1：transaldolase (XP_505460.1)；E4PK：erythrose-4-phosphate kinase；ER：erythrose reductase [ER10 (XP_502540.1)，ER25 (XP_501796.1)，and ER27 (XP_505585.1)]；EYD1：erythritol dehydrogenase (XP_504870.1)；EYK1： erythrulose kinase (XP_504868.1)；EYI1：erythrulose-1-phosphate isomerase (XP_504867.1)；EYI2：erythrulose-4-phosphate isomerase (XP_504869.1)；P：phosphate。

2.3.2 菌株WT5基因組重測序分析

為在基因組水平闡明菌株CA20和WT5之間性狀差異的原因，對菌株WT5進行基因組重測序分析，并比較CA20和WT5的基因組序列差異。結果顯示，菌株CA20基因組序列中存在278個SNP和370個Indel，位點突變產(chǎn)生15個非同義突變氨基酸，5個同義突變氨基酸以及5個移碼變異基因(圖11)。同時，CA20中的染色體結構變異包括9個染色體之間的易位(inter-chromosomal translocation，CTX)、6個插入(insertion，INS)、25個缺失(deletion，DEL)、1個倒位(inversion，INV) 和9個染色體內部的易位(intra-chromosomal translocation，ITX)。對這些突變位點所在基因進行功能注釋，結果如表4所示。其中，值得注意的是，5個移碼變異基因在菌株WT5中為移碼缺失，堿基位點的缺失或替換導致讀碼框改變及引入終止密碼子。CA20中這5個基因能夠完整表達，分別編碼假設蛋白(RMI98785.1和VBB88313.1)、蛋白激酶(SEI32238.1)、YALIA101S09e01662g1_1 (SEI35917.1)和YALI0F18458p (CAG78388.1)。結構域分析表明，RMI98785.1含有F-BAR (cd07651)、SH3 (smart00326)和PHA03247 (cl33720)，可能參與細胞分裂；VBB88313.1含有Rad2 (cl36701)，參與DNA剪切修復過程；SEI35917.1為功能未知蛋白；CAG78388.1為轉錄因子，參與轉錄調控；SEI32238.1是PKc_like類蛋白激酶，參與細胞信號傳遞。序列比較分析發(fā)現(xiàn)，上述5個基因所編碼蛋白序列在其他解脂亞羅酵母中高度保守(相似度> 99%，除了IBT 446的SEI35917.1，圖12)。

A：菌株WT5和CA20的生長曲線；B：菌株WT5和CA20的葡萄糖消耗及赤蘚糖醇合成曲線；C：赤蘚糖醇得率；D：赤蘚糖醇產(chǎn)率?！?**”代表兩組數(shù)據(jù)間差異顯著(<0.001)。

發(fā)生非同義突變的蛋白中，幾丁質轉糖基化酶(VBB85253.1)和幾丁質酶(VBB88398.1)與細胞壁的合成相關；支架蛋白VBB85012.1含有Ecm29結構域，參與穩(wěn)定胞內蛋白酶體，與胞內蛋白質的降解穩(wěn)定維持相關；假設性蛋白VBB85808.1含有Vps54結構域，參與胞內蛋白質的轉運過程；假設性蛋白B0I72DRAFT_135086 (RDW34205.1) 含有PH_Scd1 (cd13246)、CDC24 (pfam06395)、RhoGEF (pfam00621)和PB1(smart00666)結構域，參與調節(jié)胞內Rho蛋白的信號轉導過程；蛋白RDW34848.1、RDW40799.1、VBB79189.1和SEI34914.1參與胞內蛋白質的合成、修飾和穩(wěn)定等過程。綜合以上結果可知，菌株CA20赤蘚糖醇產(chǎn)量較高的原因可能與一些重要基因的移碼變異和突變有關，這些基因參與細胞信號傳遞、細胞分裂、細胞壁合成、蛋白質合成及穩(wěn)態(tài)維持。此外，誘變所引起的非同義突變可能帶來對應蛋白活性的改變，這可能是影響細胞代謝合成赤蘚糖醇的重要因素。

圖11 菌株CA20和WT5的比較基因組分析

A：樣本突變圈圖，由外至內依次為基因組信息、SNP在基因組上的密度分布、Indel在基因組上的密度分布、SV在基因組上的密度分布；B：SNP和Indel的位點數(shù)量；C：位點變化引起的非同義突變(nonsynonymous mutation，NSM)、同義突變(synonymous mutation，SM)和移碼變異(frameshift mutation，F(xiàn)SM)基因數(shù)量；D：染色體結構變異數(shù)量，包括染色體之間的易位(inter-chromosomal translocation，CTX)、插入(insertion，INS)、缺失(deletion，DEL)、倒位(inversion，INV)、染色體內部的易位(intra-chromosomal translocation，ITX)。

表4 SNP和Indel突變所引起的蛋白編碼序列變化

圖12 移碼變異基因的序列比較分析

3 討論

解脂亞羅酵母是目前工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)赤蘚糖醇所使用的唯一菌種，優(yōu)良菌株的分離和選育是降低赤蘚糖醇生產(chǎn)成本的基礎[7]。多年來，基于誘變選育技術，研究人員不斷獲得解脂亞羅酵母優(yōu)良菌株[13,14,20]。然而，對于誘變引起性狀改變的潛在機制尚不清楚，不同菌株之間性能差異的原因仍待探索。誘變所引起的基因位點的突變是菌株性狀改變的重要因素。因此，基因組水平的比較分析有助于理解和挖掘新的和菌株優(yōu)良性狀相關聯(lián)的位點。

本研究對赤蘚糖醇高產(chǎn)菌株解脂亞羅酵母CA20進行全基因組測序，結果表明CA20的基因組大小及GC含量與數(shù)據(jù)庫中的8株解脂亞羅酵母較接近，在20 Mb左右，預示著他們可能具有較近的進化距離。全基因組ANI分析顯示包括CA20在內的9個菌株具有高度同源性，進一步驗證了這一猜想。Walker等[21]對解脂亞羅酵母菌株CLIB122、CBS7504、YB567、YB566、YB420、YB419和YB392的基因組進行比較分析，發(fā)現(xiàn)這些菌株的基因組高度相似。該結果與本研究所獲結果類似。此外，雖然基因組序列高度同源，但全基因組進化樹分析表明菌株CA20和菌株H222以及IBT 446具有更近的親緣關系。菌株H222和IBT 446分離于泥土和奶酪，而其他菌株大都分離于廢水(表1)，表明生存環(huán)境對解脂亞羅酵母的遺傳進化具有一定影響。類似結果也發(fā)現(xiàn)于先前研究中，如Liu等[22]發(fā)現(xiàn)菌株PO1f的基因組序列雖然和CLIB122高度相似，但PO1f基因組中存在大片段序列的缺失。此外，基因組共線性分析以及基因突變位點分析數(shù)據(jù)表明菌株H222、IBT 446和CA20具有較好的基因組線性關系。同時，對比于CA20基因組，H222和IBT 446中SNP和Indel帶來的基因缺失數(shù)量均少于其他菌株。綜合可知，解脂亞羅酵母基因組進化相對保守，不同生存環(huán)境可能是引起基因組序列變化的主要因素。

在基因組水平，不同解脂亞羅酵母之間的性能差異可能與特有基因的存在有關。泛基因和核心基因分析表明不同菌株含有各自特有基因，數(shù)量在50～70個(除菌株CLIB122外)。然而，這些特有基因的功能大部分未得到注釋，其可能在各菌株中發(fā)揮特定作用，具體需要今后更深入的研究。在已注釋的特有基因中，不同菌株中基因的功能和參與的生物過程存在差異，如CA20中較多基因所編碼蛋白具有氧化還原酶活性，參與蛋白轉運和定位的基因數(shù)量遠高于其他菌株，預示著CA20可能具有更強的蛋白質合成和代謝能力。此外，對于碳水化合物的利用能力是評價菌株性能的重要指標。解脂亞羅酵母具有較廣泛的底物譜，可利用烷烴、烯烴、有機酸、脂肪酸、甘油三酯、葡萄糖、甘油和果糖等[23]。本研究發(fā)現(xiàn)解脂亞羅酵母基因組中含有豐富的碳水化合物活性酶，包括糖苷水解酶類(GHs)、糖基轉移酶類(GTs)、碳水化合物結合模塊類(CBMs)、碳水化合物酯酶類(CEs)和輔助模塊酶類(AAs)，這與其具有較廣泛底物譜相呼應。其中，菌株CA20、W29、DSM 3286和CLIB122具有更豐富的GHs、GTs、CBMs和AAs。GHs主要參與纖維素、半纖維素等多糖化合物的降解；CBMs可與其他家族的酶結合提高其催化活性；AAs與木質素的降解相關[18,24]。因此，這4個菌株可能具有更強的多糖降解能力。然而，需要指出的是，雖然解脂亞羅酵母基因組中含有豐富的與纖維素降解相關的GHs，但是其并不能直接利用纖維素[6]。這可能歸因于相應糖苷酶未被激活或是相關代謝途徑中關鍵元件的缺失[25,26]，因此，如果能有效激活和纖維素及半纖維素降解有關的糖苷酶以及補充缺少的元件，則可加速實現(xiàn)以富含纖維素的農作物廢棄物為原料生產(chǎn)赤蘚糖醇，降低生產(chǎn)成本。另外，值得注意的是，菌株CA20的碳水化合物活性酶數(shù)量(166個)遠高于其他8個菌株，其中AAs中的AA1和CEs相對于其他菌株更為豐富。AA1為漆酶 (laccase)，參與催化取代酚、苯胺和芳香族硫醇等酚類物質的氧化過程，已被用于去除木質纖維素水解液中的酚類物質，消除其對馬克斯克魯維酵母()的抑制作用[27]?；蚪M中豐富的AA1預示著菌株CA20對酚類物質具有較好的耐受能力。CEs可參與半纖維素、果膠和幾丁質的降解過程[28,29]，菌株CA20中豐富的CE1、CE4和CE9，以及特有的CE10、CE12、CE14和CE16可能和其分離環(huán)境有關，同時也預示著其具有更強的底物分解能力。綜合可知，基因組中特異基因的存在及碳水化合物活性酶的多樣性可能是不同解脂亞羅酵母性能差異的主要原因。

得益于良好的高滲壓耐受性和安全性，解脂亞羅酵母已被廣泛用于赤蘚糖醇的發(fā)酵生產(chǎn)。然而，不同菌株的產(chǎn)量差異明顯[1]。赤蘚糖醇的代謝途徑已得到揭示，除了赤蘚糖-4-磷酸激酶(E4PK)以外，代謝途徑中其他酶的序列可從數(shù)據(jù)庫中下載。本研究對葡萄糖轉運、磷酸戊糖途徑及赤蘚糖醇降解等過程中關鍵酶的序列進行比較分析。針對葡萄糖轉運，先前研究表明解脂亞羅酵母中葡萄糖轉運蛋白主要有6個(YHT1-YHT6)，其中YHT1和YHT4發(fā)揮主要作用[30,31]。本研究發(fā)現(xiàn)，6個糖轉運蛋白在9株菌中均高度保守(除了YHT6在PO1f發(fā)生丟失以外)。在赤蘚糖糖醇合成途徑中，除轉醛酶外，其他酶均高度保守(圖9)。此外，在赤蘚糖醇降解途徑中，相關酶同樣高度保守。這些結果預示著已知的解脂亞羅酵母均保留完整的赤蘚糖醇代謝與合成潛力，不同菌株間赤蘚糖醇合成能力的差異可能并非來自關鍵酶的突變或缺失。需要指出的是，本研究所選取的8株菌中，只有菌株W29和PO1f用于赤蘚糖醇合成研究[1,8,31]，其他文獻中報道的赤蘚糖醇高產(chǎn)菌如解脂亞羅酵母M53[20]、解脂亞羅酵母CGMCC7326[32]、解脂亞羅酵母BBE-17及[13,33]和CICC 1675[34]的基因組序列尚未公開。因此，未來通過分析這些高產(chǎn)菌株的基因組差異可進一步揭示赤蘚糖醇產(chǎn)量差異的機制。

高產(chǎn)菌株和原始菌株基因組序列的比較分析有助于闡明和赤蘚糖醇積累有關的機制。先前預測誘變可能導致蘚糖醇代謝途徑中關鍵酶的突變，從而改變酶的活性，進而引起產(chǎn)量的變化。然而，本研究發(fā)現(xiàn)，誘變并未引起相關酶編碼序列的變化，預示著CA20中赤蘚糖醇的代謝受到其他因素調控。進一步分析發(fā)現(xiàn)，菌株CA20中5個基因發(fā)生移碼變異，其中值得關注的是蛋白激酶SEI32238.1，含有PKc_like 結構域。蛋白激酶主要參與胞內信號傳遞過程，研究表明PKC(protein kinase C)-MAPK (mitogen-activated protein kinase)信號通路主要參與調控酵母細胞細胞壁的穩(wěn)定性和修復過程，與細胞從壓力環(huán)境恢復生長過程中肌動蛋白細胞骨架的復極化密切相關[35～37]。酵母細胞代謝合成赤蘚糖醇需要高滲環(huán)境，細胞壁的穩(wěn)定性與細胞在高滲環(huán)境中生存密切相關。因此，蛋白激酶SEI32238.1可能參與調控細胞在高滲環(huán)境中的生長和代謝，進而影響赤蘚糖醇的合成。序列比較分析發(fā)現(xiàn)SEI32238.1在其他解脂亞羅酵母菌株中高度保守，間接說明其對于酵母細胞代謝生長的重要性。此外，雖然赤蘚糖醇代謝途徑已得到揭示，但是該途徑的調控機制仍有待研究。本研究發(fā)現(xiàn)菌株CA20發(fā)生移碼變異的基因中含有1個轉錄調控因子(CAG78388.1)，該蛋白的功能未知，是否參與調控胞內赤蘚糖醇代謝需要進一步試驗驗證。除移碼變異外，本研究發(fā)現(xiàn)菌株CA20中存在眾多的非同義突變蛋白。雖然這些蛋白的突變位點只有1個，但仍有可能造成蛋白活性的變化，從而引起胞內代謝網(wǎng)絡的改變[38]。值得注意的是，發(fā)生非同義突變的15個蛋白中，大部分參與細胞分裂、細胞壁合成、蛋白質合成及穩(wěn)態(tài)維持等過程，表明胞內環(huán)境穩(wěn)態(tài)的維持對細胞合成赤蘚糖醇具有重要影響。綜合可知，誘變處理引起的非同義突變所帶來的細胞穩(wěn)定性的提升可能是促進細胞合成赤蘚糖醇的重要因素，其中蛋白激酶SEI32238.1可能發(fā)揮重要調控作用。

綜上所述，這些結果表明：(1)解脂亞羅酵母基因組在進化過程中保守，生存環(huán)境的不同是導致不同菌株基因組序列差異的主要因素；(2)基因組中CAZymes數(shù)量差異可能是不同解脂亞羅酵母性能差異的重要因素，而菌株CA20具有更豐富的碳水化合物活性酶，具備更強的工業(yè)應用潛力；(3)赤蘚糖醇代謝途徑在不同解脂亞羅酵母中保守，不同菌株產(chǎn)量差異可能并非只來自代謝途徑中有關酶的突變，同時與代謝途徑的調控有關；(4)菌株CA20高產(chǎn)赤蘚糖醇與其細胞結構及內環(huán)境穩(wěn)定性的提升有關，蛋白激酶SEI32238.1可能是重要的調控因子。未來可通過轉錄組及代謝組學的研究進一步闡明解脂亞羅酵母高產(chǎn)赤蘚糖醇的機制，為優(yōu)良菌株的定向選育提供新思路。

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Mechanism and evolutionary analysis ofCA20 capable of producing erythritol with a high yield based on comparative genomics

Kai Xia, Fangmei Liu, Yuqing Chen, Shanshan Chen, Chunying Huang, Xuequn Zhao, Ruyi Sha, Jun Huang

Combined mutagenesis is widely applied for the breeding of robustused in the production of erythritol. However, the changes of genome after mutagenesis remains unclear. This study aimed to unravel the mechanism involved in the improved erythritol synthesis of CA20 and the evolutionary relationship between differentby comparative genomics analysis. The results showed that the genome sizeofCA20 was 20,420,510 bp, with a GC content of 48.97%. There were 6330 CDS and 649 ncRNA (non-coding RNA) in CA20 genome. Average nucleotide identity (ANI) analysis showed that CA20 genome possessed high similarity (ANI > 99.50%) with otherstrains, while phylogenetic analysis displayed that CA20 was classified together withIBT 446 andH222. CA20 shared 5342 core orthologous genes with the 8 strains while harbored 65 specific genes that mainly participated in the substrate and protein transport processes. CA20 contained 166 genes coding for carbohydrate-active enzymes (CAZymes), which was more than that found in other strains (108－137). Notably, 4, 2, and 13 different enzymes belonging to glycoside hydrolases (GHs), glycosyltransferases (GTs), and carbohydrate esterases (CEs), respectively, were only found in CA20. The enzymes involved in the metabolic pathway of erythritol were highly conserved in, except for transaldolase (TAL1). In addition, the titer and productivity of erythritol by CA20 were 190.97 g/L and 1.33 g/L/h, respectively, which were significantly higher than that of WT5 wherein 128.61 g/L and 0.92 g/L/h were obtained (< 0.001). Five frameshift mutation genes and 15 genes harboring nonsynonymous mutation were found in CA20 compared with that of WT5. Most of these genes were involved in the cell division, cell wall synthesis, protein synthesis, and protein homeostasis maintenance. These findings suggested that the genome ofis conserved during evolution, and the variance of living environment is one important factor leading to genome divergence. The varied number of CAZymes existed inis one factor that contributes to the performance difference. The increased synthesis of erythritol byCA20 is correlated with the improvement of the stability of cell structure and internal environment. The results of this study provide a basis for the directional breeding of robuststrains used in erythritol production.

; erythritol; comparative genome; frameshift mutation; protein kinase

2023-06-08;

2023-08-11;

2023-08-23

浙江科技學院科研啟動基金(編號：F701103L11)，研究生科研創(chuàng)新基金項目(編號：2021yjskc11)和國家大學生創(chuàng)新訓練項目(編號：202211057026)資助[Supported by the Research Start-Up Foundation of Zhejiang University of Science and Technology (No. F701103L11), the Research Innovation Foundation of Postgraduate (No. 2021yjskc11), and the National Training Program for College Students’ Innovation (No. 202211057026)]

夏凱，博士，講師，研究方向：微生物遺傳與育種。E-mail: xiakai05@zust.edu.cn

黃俊，博士，教授，研究方向：蛋白質分子設計和定向進化以及合成生物學。E-mail: huangjun@zust.edu.cn

10.16288/j.yczz.23-139

(責任編委: 高海春)