大規(guī)模平行報告基因測定：一種分析基因表達調(diào)控的新技術(shù)

袁萌，李輝，王守志

綜 述

大規(guī)模平行報告基因測定：一種分析基因表達調(diào)控的新技術(shù)

袁萌1,2,3，李輝1,2,3，王守志1,2,3

1. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部雞遺傳育種重點實驗室，哈爾濱 150030 2. 黑龍江省普通高等學校動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，哈爾濱 150030 3. 東北農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院，哈爾濱 150030

大規(guī)模平行報告基因測定(massively parallel reporter assay，MPRA)是一種可以同時研究基因組數(shù)千個調(diào)控元件活性的高通量分析方法。該方法在傳統(tǒng)的熒光素酶報告基因載體上引入一段具有唯一標識的條形碼，通過二代測序技術(shù)對轉(zhuǎn)染前的DNA條形碼和轉(zhuǎn)染后的mRNA條形碼進行測序，用mRNA和DNA條形碼讀數(shù)的比值來分析順式調(diào)控元件的活性。自MPRA提出以來，已被廣泛應用于基因組順式調(diào)控元件和功能性變異的鑒定、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控對表型的影響等方面的研究。本文對MPRA的發(fā)展歷程、基本原理、實驗流程、統(tǒng)計分析方法以及在順式調(diào)控元件和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控方面的應用進行了綜述，并對其發(fā)展前景進行了展望，以期為相關(guān)領(lǐng)域研究人員了解與應用MPRA提供有益參考。

大規(guī)模平行報告基因測定；基因表達調(diào)控；順式調(diào)控元件；轉(zhuǎn)錄后調(diào)控

基因表達調(diào)控一直是現(xiàn)代分子生物學基礎研究的熱點之一，其過程十分復雜，可分為染色質(zhì)水平、轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平、翻譯水平和翻譯后水平等調(diào)控[1,2]。轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平上的調(diào)控是基因表達調(diào)控的重要部分，轉(zhuǎn)錄水平主要指特定順式調(diào)控元件(cis-regulatory elements，CREs)與反式作用因子(trans-acting factors)相互作用而調(diào)控基因的表達。CREs是一段可調(diào)節(jié)基因表達的DNA序列，主要包括啟動子、增強子和沉默子，它本身不編碼任何蛋白質(zhì)，但能夠提供與反式作用因子相互作用的位點，進而參與基因表達調(diào)控[3,4]。因此，CREs的變異可能會通過改變轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點來調(diào)控基因表達。轉(zhuǎn)錄后水平是指轉(zhuǎn)錄形成的前體信使核糖核酸(pre-mRNA)經(jīng)過加工修飾成為信使RNA (mRNA)的過程，其主要包括RNA剪切、RNA編輯等[5～8]。pre-mRNA在加工修飾的過程發(fā)生突變不僅會影響RNA剪切[9]、RNA編輯[10]等過程，還可能影響mRNA穩(wěn)定性[11]，從而影響基因表達。目前，大多采用傳統(tǒng)的雙熒光素酶報告基因檢測變異位點的調(diào)控活性，但每次只能檢測單個變異位點，無法做到高通量檢測[12～17]。

全基因組關(guān)聯(lián)研究(genome-wide association study，GWAS)已被廣泛用于檢測與人類疾病和動植物經(jīng)濟性狀相關(guān)的遺傳變異的篩選，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了大量的顯著相關(guān)變異位點，但大多數(shù)變異位點位于基因組非編碼區(qū)內(nèi)，通過影響CREs來調(diào)控基因表達[18～20]。由于變異位點間存在強烈的連鎖不平衡(linkage disequilibrium，LD)，使得從眾多變異位點中鑒別具有調(diào)控活性的變異位點(因果變異)具有很大的挑戰(zhàn)性[21,22]。大規(guī)模平行報告基因測定(massively parallel reporter assay，MPRA)是解決這一難題的有效方法，該技術(shù)能夠高通量檢測GWAS關(guān)聯(lián)信號區(qū)域中突變位點的等位基因活性差異，與基因編輯技術(shù)相結(jié)合能對功能性變異進行功能鑒定和驗證，以鑒定可能的因果變異[23]。自MPRA提出以來，已廣泛應用于人類疾病研究中，如鑒定與疾病相關(guān)調(diào)控元件的功能性變異，分析轉(zhuǎn)錄后調(diào)控對疾病的影響等[24～28]。本文對MPRA的發(fā)展歷程、基本原理、實驗流程、統(tǒng)計分析方法以及在CREs和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控方面中的應用進行了總結(jié)，并對其發(fā)展前景進行了展望，以期為相關(guān)研究及其應用提供參考。

1 MPRA發(fā)展歷程

從發(fā)展歷程來看，MPRA技術(shù)發(fā)展可分為兩類：第一類是基于有條形碼的常規(guī)MPRA及其改進方法；第二類是基于無條形碼的STARR-seq及其改進方法。表1總結(jié)了兩類MPRA技術(shù)及其改進方法的目標序列來源、載體、轉(zhuǎn)染方式、應用及其優(yōu)缺點等信息。

2009年，Patwardhan等[29]首次提出一種以單核苷酸為研究對象對啟動子進行高通量功能分析的方法，該方法需要大規(guī)模平行合成DNA序列并對其進行測序。在此基礎上，Melnikov等[30]于2012年在對兩種誘導型增強子(合成cAMP調(diào)節(jié)增強子和病毒誘導的干擾素β增強子)變異位點的研究中提出了MPRA這一技術(shù)。自此，隨著MPRA技術(shù)的普及和發(fā)展，適用于各種實驗的MPRA被不斷的開發(fā)出來。2013年，Arnold等[31]開發(fā)了一種可以在全基因組范圍內(nèi)直接定量評估數(shù)百萬候選增強子活性的技術(shù)——STARR-seq (self-transcribing active regulatory region sequencing)。與有條形碼的MPRA相比，STARR-seq技術(shù)通過調(diào)控序列與啟動子的相互作用來驅(qū)動報告基因和序列自身進行轉(zhuǎn)錄，調(diào)控序列的轉(zhuǎn)錄本作為標簽而不需要條形碼序列，使實驗操作更為簡便。在STARR-seq基礎上，Vanhille等[32]于2015年開發(fā)了CapSTARR-seq技術(shù)，該技術(shù)克服了STARR-seq在哺乳動物中由于基因組過于復雜而使文庫制備困難和測序深度過深的問題，為哺乳動物中增強子活性的研究提供了一種快速且經(jīng)濟的方法。至2016年為止，MPRA僅能在有限的細胞類型中檢測短CREs的活性差異。為此，Shen等[33]開發(fā)了AAV MPRA (adeno-associated virus MPRA)技術(shù)以擴大MPRA的應用范圍，該技術(shù)通過將DNA文庫包裝成AAV，使文庫可以轉(zhuǎn)導至廣泛的組織中，從而能對任何可被AAV感染的組織或器官進行MPRA；同年，Inoue等[34]開發(fā)出一種基于慢病毒的MPRA技術(shù)，即lentiMPRA(lentivirus-based MPRA)，該技術(shù)可用于任何被慢病毒有效感染的細胞，這使MPRA技術(shù)在生物學上的應用范圍進一步擴大[35]。2018年，Kalita等[36]開發(fā)了一種檢測調(diào)控序列內(nèi)等位基因特異性表達的簡化方法，稱為BiT-STARR-seq (biallelic targeted STARR-seq)。該方法在反轉(zhuǎn)錄中引入了單分子標簽(unique molecular identifiers，UMI)，使得克隆和轉(zhuǎn)化步驟中不會出現(xiàn)由于文庫的復雜性而導致的誤差，從而提高檢測等位基因特異性表達的能力；同年，Wang等[37]提出了基于ATAC-seq (assay for transposase accessible chromatin with high-throughput sequencing)和STARR-seq的ATAC-STARR-seq技術(shù)，該技術(shù)可直接從開放染色質(zhì)區(qū)域捕獲目標片段，無需進行寡核苷酸合成，可以分析較長目標片段的活性。有研究表明，轉(zhuǎn)錄因子對DNA甲基化水平的敏感性普遍存在差異，但這種差異敏感性是否會轉(zhuǎn)化為基因表達差異尚無定論[38]。因此，Lea等[38]于2018年開發(fā)了mSTARR-seq (methyl-STARR-seq)技術(shù)，主要用于研究DNA甲基化對數(shù)十萬個基因片段(數(shù)百萬個CpG位點)的調(diào)控作用，為分析DNA甲基化與基因表達水平之間的因果關(guān)系提供了有力工具。為了探索CREs和區(qū)域染色質(zhì)是否以復雜的序列相互作用，以及它們與基因表達是否存在因果關(guān)系，Maricque等[39]于2018年開發(fā)了patchMPRA (parallel targeting of chromosome positions by MPRA)技術(shù)，該技術(shù)的關(guān)鍵點在報告基因產(chǎn)生的mRNA有兩種不同的條形碼：一個是用于指定CREs的CREs條形碼(cBC)；另一個是用于指定報告基因位置的基因組條形碼(gBC)，這使patchMPRA能夠在不同的染色體位置測量同一組CREs，從而研究局部CREs和區(qū)域染色質(zhì)對基因表達的調(diào)控作用。2023年，Zhao等[40]基于patchMPRA技術(shù)[39]的兩種條形碼模型開發(fā)了一種scMPRA(single-cell MPRA)技術(shù)，可檢測具有細胞類型或細胞狀態(tài)特異性的CREs，解決了傳統(tǒng)的MPRA難以鑒定細胞類型或細胞狀態(tài)特異性的CREs這一難題。由于在單細胞中回收mRNA的效率較低，因此可以從mRNA回收效率方面改進scMPRA。

表1 不同MPRA技術(shù)的比較

2 MPRA基本原理、實驗流程及統(tǒng)計分析

2.1 MPRA基本原理

簡單來說，MPRA是一種升級版的熒光素酶報告基因分析法[41,42]。熒光素酶報告基因檢測是一種以熒光素(luciferin)為底物檢測螢火蟲熒光素酶(firefly luciferase)活性的研究系統(tǒng)，螢火蟲熒光素酶將熒光素催化氧化成氧化熒光素的過程中會產(chǎn)生生物熒光[43]，可用于啟動子結(jié)構(gòu)和活性分析、miRNA與靶基因的靶向互作研究、轉(zhuǎn)錄因子與啟動子調(diào)控機制研究以及其他信號轉(zhuǎn)導通路研究等；方法是將特定的目標調(diào)控元件(增強子、啟動子等)克隆到報告基因的載體中，構(gòu)建成熒光素酶報告載體，然后瞬時轉(zhuǎn)染至細胞中，培養(yǎng)48 h后回收細胞，用熒光測定儀(也稱化學發(fā)光儀)測定熒光素酶活性[43]。有條形碼的MPRA則是以熒光素酶報告基因為基礎，在報告基因的3′端添加遺傳條形碼(一種隨機寡核苷酸序列，可唯一標記匹配的目標序列)，使得同一時間內(nèi)可分析多個序列的調(diào)控活性[44]。一旦將構(gòu)建好的DNA文庫轉(zhuǎn)染至細胞中，啟動子就會驅(qū)動調(diào)控元件序列及其獨特的條形碼表達，通過二代測序技術(shù)量化條形碼的轉(zhuǎn)錄效率來分析目標序列的調(diào)控活性，而非量化熒光素酶的發(fā)光[42]。STARR- seq技術(shù)在報告基因的3′端引入目標序列，有調(diào)控活性的目標序列作用于啟動子使目標序列進行自轉(zhuǎn)錄，通過二代測序技術(shù)量化目標序列的轉(zhuǎn)錄效率以分析其調(diào)控作用[31]。就兩種技術(shù)相比而言，STARR-seq與MPRA的主要區(qū)別是條形碼的有無，STARR-seq不需要條形碼，因此實驗操作較簡便，但該技術(shù)中報告基因與目標序列之間的穩(wěn)定性可能會造成測序結(jié)果的偏差，而MPRA技術(shù)中的條形碼可以很好的解決這一問題，但該技術(shù)實驗操作較繁瑣[35,45]。

2.2 MPRA實驗流程

有條形碼的MPRA實驗流程主要由5部分構(gòu)成：(1)構(gòu)建DNA文庫。在微陣列中合成目標DNA序列和條形碼序列，將其連接后克隆至MPRA載體。之后，將通用啟動子和開放閱讀框(熒光素酶或綠色熒光蛋白等)克隆至目標DNA序列與條形碼之間形成最終的DNA文庫；(2)構(gòu)建輸入文庫。通過二代測序技術(shù)對DNA文庫中的條形碼進行測序形成輸入文庫(DNA-seq)；(3)轉(zhuǎn)染。將DNA文庫轉(zhuǎn)染至細胞后，開放閱讀框和條形碼進行轉(zhuǎn)錄表達；(4)構(gòu)建輸出文庫。轉(zhuǎn)染一段時間后，收集細胞中的mRNA，對條形碼進行測序形成輸出文庫(RNA-seq)；(5)統(tǒng)計分析。整理RNA-seq和DNA-seq結(jié)果，通過它們讀數(shù)的比值(RNA-seq/DNA-seq)反映目標DNA序列的相對表達量以分析其調(diào)控功能(圖1A)。

與有條形碼的MPRA相比，無條形碼的STARR-seq技術(shù)的實驗流程較為簡便，主要由以下5部分組成：(1)構(gòu)建DNA文庫。通過基因組剪切等技術(shù)獲得目標DNA片段，將其克隆至STARR-seq載體的開放閱讀框(熒光素酶或綠色熒光蛋白等)和PloyA尾之間形成DNA文庫；(2)構(gòu)建輸入文庫。通過二代測序技術(shù)對DNA文庫中的目標DNA序列進行測序形成輸入文庫(DNA-seq)；(3)轉(zhuǎn)染。將DNA文庫轉(zhuǎn)染至細胞中，有調(diào)控活性的目標DNA序列作用于啟動子而促進該目標序列的自轉(zhuǎn)錄；(4)構(gòu)建輸出文庫。轉(zhuǎn)染一段時間后，收集細胞中的mRNA，對目標DNA序列的轉(zhuǎn)錄本進行測序形成輸出文庫(RNA-seq)；(5)統(tǒng)計分析。整理RNA-seq和DNA-seq結(jié)果，通過它們讀數(shù)的比值(RNA-seq/DNA-seq)反映目標DNA片段的相對表達量以分析其調(diào)控功能(圖1B)。

A：常規(guī)MPRA實驗流程；B：常規(guī)STARR-seq實驗流程。

2.3 MPRA數(shù)據(jù)分析

MPRA是通過輸出文庫(RNA-seq)的mRNA與輸入文庫(DNA-seq)的DNA條形碼或目標DNA序列讀數(shù)的比值分析基因組中具有調(diào)控活性的序列和變異位點。最初，研究人員通常采用二項式檢驗[31]、差分峰值分析[46]、負二項式[47]及線性模型[48]等方法分析測序結(jié)果。隨著MPRA的廣泛應用，MPRA數(shù)據(jù)分析技術(shù)逐漸被開發(fā)出來，表2總結(jié)了相關(guān)分析方法的原理和優(yōu)缺點。2017年，Kalita等[49]基于等位基因特異性定量分析(quantitative allele-specific analysis of reads，QuASAR)[50]開發(fā)了QuASAR- MPRA，該方法用β-二項式分布對RNA和DNA讀數(shù)進行建模，提供了一種專門用于識別具有等位基因特異活性的調(diào)控序列的統(tǒng)計分析方法。QuASAR- MPRA雖然考慮了質(zhì)粒比例的不平衡和測序誤差等問題對測序結(jié)果的影響，簡化了重復試驗的統(tǒng)計分析，但不能通用于活性差異分析。為此，Myint等[51]于2019年開發(fā)出了一種通用于MPRA活性差異分析的方法，即mpralm。該方法基于voom方法使用線性模型進行活性差異分析[49]，為需要復雜的數(shù)據(jù)分析模型的實驗設計提供了靈活的分析方法。mpralm不僅功能全面，而且優(yōu)于目前存在的分析方法。雖然MPRA實驗技術(shù)越來越完善，但其數(shù)據(jù)分析還存在一定的不足，如：(1)忽略了數(shù)據(jù)中固有的噪音；(2)采用分析其他實驗的數(shù)據(jù)模型；(3)現(xiàn)存專用于MPRA的分析方法只能用于活性差異分析，并且依賴于RNA與DNA比率的統(tǒng)計匯總，限制了實驗數(shù)據(jù)的應用[48]。因此，Ashuach等[52]于2019年開發(fā)了MPRAnalyze分析框架，該方法使用圖形模型將DNA和RNA讀數(shù)聯(lián)系起來，將數(shù)據(jù)直接建模為結(jié)構(gòu)化數(shù)據(jù)。值得注意的是，MPRAnalyze內(nèi)嵌套的廣義線性模型使其能靈活應用于各種實驗設計。有研究表明，一些為特定MPRA技術(shù)定制的分析方法，因MPRA實驗設計的巨大差異、輸入文件的復雜性等原因，無法在各種實驗數(shù)據(jù)分析中相互轉(zhuǎn)換應用[53]。為此，Gordon等[53]于2020年開發(fā)了一種基于Nextflow[54]的MPRA數(shù)據(jù)分析方法，即MPRAflow。該方法用DNA和mRNA測序結(jié)果擬合廣義線性模型來分析每個被測CREs的轉(zhuǎn)錄效率。MPRAflow不僅可用Python、Bash和R語言自動運行MPRA處理代碼，而且兼容了高性能計算(HPC)集群和云計算等多種計算體系，這些計算體系擴大了一些數(shù)據(jù)分析技術(shù)的應用范圍[53]。同年，為解決由RNA二級結(jié)構(gòu)、熱力學穩(wěn)定性和文庫復雜性等對STARR-seq測序結(jié)果的影響，Lee等[45]開發(fā)了一個基于負二項式回歸模型的分析方法，稱之為STARRPeaker。該方法不僅可模擬基礎轉(zhuǎn)錄效率，而且考慮了潛在的干擾因素。為了識別MPRA實驗中的負調(diào)控元件(NRE)，He等[55]于2022年設計了第一個適用于NRE識別的程序——Fast-NR，它通過整合測序讀數(shù)和圖形特征，利用STARR-seq實驗產(chǎn)生的數(shù)據(jù)檢測NRE。Fast-NR的應用將加速沉默子功能機制和表觀遺傳學研究。為解決數(shù)據(jù)質(zhì)量和實驗設計問題，Gilliot等[56]于2023年又開發(fā)了一個Python包，即FORECAST，該方法通過基于最大似然法的推斷方法和Flow-seq實驗概率模型對實驗和分析參數(shù)進行系統(tǒng)的探索，有助于實驗開發(fā)和數(shù)據(jù)的充分利用。

表2 MPRA數(shù)據(jù)分析技術(shù)的比較

3 MPRA在順式調(diào)控元件及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中的應用

3.1 順式調(diào)控元件

3.1.1 啟動子

啟動子是調(diào)控基因表達的順式作用元件之一，它含有RNA聚合酶特異性結(jié)合和轉(zhuǎn)錄起始所需的保守序列，一般位于結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄起始位點的上游，通過與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合而調(diào)控基因表達[57～59]。因此，啟動子的突變可能會通過改變轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點而調(diào)控基因表達。Kircher等[60]采用飽和誘變MPRA分析與疾病相關(guān)的啟動子功能性變異，在人肝癌細胞(HepG2)中進行兩次生物學重復檢測低密度脂蛋白受體基因(low-density lipoprotein receptor，)啟動子的變異位點，在兩次實驗中均發(fā)現(xiàn)c.–152C>T和c.–142C>T突變使啟動子活性降低，而c.–217C>T突變使其活性增強。此外，在人胚胎腎239T細胞(HEK293T)和膠質(zhì)母細胞瘤中檢測端粒逆轉(zhuǎn)錄酶基因(telomerase reverse transcriptase，)啟動子的變異位點，發(fā)現(xiàn)c.–124C>T、c.–146C>T、c.–45G>T、c.–57A>C和c.–54C>A這5個變異位點均使啟動子活性增強。Koesterich等[61]用LentiMPRA在神經(jīng)干細胞中分析位于啟動子區(qū)與孤獨癥譜系障礙(autism spectrum disorder，ASD)相關(guān)的3600個新生突變(variant，DNV)對基因表達的調(diào)控作用，經(jīng)過MPRAflow和MPRAnalyze統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)487個野生型等位基因和473個突變型等位基因具有活性增強的趨勢，165個變異為高置信度變異，但未發(fā)現(xiàn)ASD疾病中DNV富集的明顯證據(jù)，也沒有證據(jù)表明來自ASD的DNV在所有變異中都增強轉(zhuǎn)錄活性，這可能與細胞類型、DNV數(shù)量、測序深度等有關(guān)。這為今后研究非編碼區(qū)DNV與神經(jīng)發(fā)育障礙之間的因果關(guān)系提供了參考。Jores等[62]使用STARR-seq分析核心啟動子的活性，選取18,329個擬南芥()、34,415個玉米()和27,094個高粱()核心啟動子構(gòu)成3種文庫，分別克隆至有35S增強子和無35S增強子的兩種載體中，分別轉(zhuǎn)染至煙草()和玉米原生質(zhì)體中，發(fā)現(xiàn)35S增強子可使核心啟動子的活性增強，且核心啟動子在煙草中具有更強的活性。此外，他們還發(fā)現(xiàn)雙子葉植物擬南芥的啟動子在雙子葉植物煙草中活性更強，而單子葉植物玉米和高粱的啟動子在單子葉植物玉米原生質(zhì)體中表現(xiàn)出更強的活性。該研究揭示了不同類型的啟動子與增強子之間的特定作用，為優(yōu)化啟動子提供了一種可行的實驗方法。

3.1.2 增強子

增強子是一段位于非編碼序列且具有增強基因表達功能的短DNA序列，其含有轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點，增強子通過與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合而提高靶基因的表達[63]。因此，增強子突變可能會通過影響轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點調(diào)控基因表達。目前，MPRA已被廣泛用于鑒定基因組中增強子序列以及其突變對基因表達的調(diào)控作用。Kalita等[36]通過BiT-STARR-seq對75,501個DNA片段進行活性差異分析，在人類淋巴母細胞系(lympho-blastoid cell line，LCL)中進行了9次生物學重復，通過QuASAR-MPRA分析鑒定出了2720個等位基因活性具有顯著性差異的SNPs。該研究表明了BiT-STARR-seq這種簡化的高通量報告基因檢測方法分析基因組等位基因特異性表達的可行性，為今后的相關(guān)研究提供了一種新技術(shù)。Cooper等[23]用MPRA在HEK293T細胞中分析5706個非編碼單核苷酸變異對基因轉(zhuǎn)錄活性的影響，這些變異位點來自阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)和進行性核上性麻痹(progressive supranuclear palsy，PSP)的GWAS區(qū)域，共發(fā)現(xiàn)了320個具有調(diào)控活性的變異，隨后利用CRISPR干擾或敲除鑒定并驗證了多個風險位點。該研究表明了MPRA和CRISPR在高LD的復雜位點上分析與疾病相關(guān)的非編碼區(qū)變異的有效性。Lu等[12]通過GWAS在系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)的91個風險位點中發(fā)現(xiàn)了3073個遺傳變異，將其與先前發(fā)表的20個遺傳變異構(gòu)建了DNA文庫，轉(zhuǎn)染至由EB(epstein-barr virus)病毒感染的B淋巴細胞(GM12878)中，發(fā)現(xiàn)了482個變異具有增強子活性，其中51個變異在27個風險位點顯示基因型依賴性增強子活性。為進一步探索具有細胞類型特異性的變異，將DNA文庫轉(zhuǎn)染至人T淋巴細胞瘤細胞(Jurkat)中，鑒定出92個等位基因變異，其中有25%變異在GM12878中被鑒定，這為今后的研究提供了寶貴的資源。該研究不僅為闡明SLE相關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制提供了見解，而且為剖析人類復雜疾病的病因提供了藍圖。Wu等[64]用STARR-seq鑒定豬()基因組中的增強子序列，將滇南小耳豬基因組進行隨機剪切構(gòu)成DNA文庫，轉(zhuǎn)染至豬腎細胞(PK15)和豬睪丸細胞(ST)量化增強子的活性，在PK15和ST細胞分別檢測到1015和2217個增強子，其中有601個增強子在兩個細胞系中均存在，這表明STARR-seq可用于在全基因組范圍內(nèi)量化豬增強子的活性。該研究首次應用于豬的全基因組增強子活性量化圖譜的繪制，它將促進豬復雜性狀因果突變的鑒定。Sun等[65]用STARR-seq鑒定水稻(L.)基因組中的增強子序列，用從2周齡日本晴水稻幼苗莖上提取的基因組構(gòu)建DNA文庫，轉(zhuǎn)染至原生質(zhì)體中，在兩次生物學重復試驗中，分別發(fā)現(xiàn)了15,208和12,210個具有增強子活性的序列，其中9642個序列在兩次重復中均顯現(xiàn)出增強子活性。該研究通過功能分析定量鑒定水稻的增強子，為在不同生物學背景下進一步開展機理研究提供了寶貴資源。

3.1.3 沉默子

在遺傳學中，沉默子是一段能夠結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子(阻遏蛋白)的DNA序列，與增強子對DNA轉(zhuǎn)錄的增強作用相反，沉默子會抑制DNA的轉(zhuǎn)錄過程[66]。DNA上的基因是信使RNA合成的模板，而信使RNA最終被翻譯成蛋白質(zhì)。當沉默子存在時，阻遏蛋白結(jié)合到沉默子DNA序列上，會阻礙RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄DNA序列，從而阻礙RNA翻譯為蛋白質(zhì)[67]。Doni等[68]開發(fā)了SSA (simple subtractive analysis)算法以識別人類基因組內(nèi)未鑒定的調(diào)控元件，用STARR-seq技術(shù)在K562細胞中分析7500個未鑒定的調(diào)控元件，發(fā)現(xiàn)41.5%具有沉默子活性。為進一步證實結(jié)果的可靠性，他們又用CRISPR-Cas9技術(shù)敲除鑒定的沉默子，發(fā)現(xiàn)其缺失使靶基因表達具有增強的趨勢，該研究為全基因組沉默子的鑒定提出了一種通用策略，初步解決了計算或?qū)嶒灧椒ㄔ谌蚪M范圍內(nèi)識別沉默子具有挑戰(zhàn)性這一問題。Mouri等[69]通過MPRAduo在全基因組范圍內(nèi)分析神經(jīng)元限制性沉默元件，用8436個有典型抑制元件1-沉默子轉(zhuǎn)錄因子(repressor element 1-silencing transcription factor，REST)結(jié)合位點的序列和4430個無典型REST結(jié)合位點的序列與5種增強子分別構(gòu)成ES(增強子-沉默子)文庫，將其轉(zhuǎn)染至GM12878、HepG2、K562和人神經(jīng)母細胞瘤細胞(SK-N-SH)中，發(fā)現(xiàn)2657個有典型REST結(jié)合位點的序列和486個無典型REST結(jié)合位點的序列表現(xiàn)出活性降低的趨勢，該研究結(jié)果表明MPRAduo能夠預測抑制元件1的活性及其變異對抑制元件1的影響，為轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點的全基因組功能鑒定提供了一個范例。Hussain等[70]通過CapSTARR-seq技術(shù)檢測小鼠()基因組內(nèi)的沉默子，用小鼠雙陽性胸腺細胞的28,055個DNA酶I超敏感位點(DHS)和437個非DHS區(qū)構(gòu)建DNA文庫，克隆至由3種不同啟動子構(gòu)成的STARR-seq載體，啟動子為超核心啟動子1 (SCP1)、人磷酸甘油酸激酶基因普遍存在的強啟動子(pPGK)和T細胞特異性啟動子增強子對pRag2-Eα(pR-Eα)，將文庫轉(zhuǎn)染至來源于小鼠T細胞的P5424細胞系中，在SCP1、pPGK和pR-Eα文庫分別檢測出1249、672和413個沉默子，其中有15個沉默子在3種文庫均被檢測到。該研究將STARR-seq方法用作一種新的高通量分析策略，以定量評估哺乳動物中沉默子的活性，為全基因組沉默子的鑒定和特征描述提供了一種通用策略。

3.2 轉(zhuǎn)錄后調(diào)控

3.2.1 pre-mRNA剪接

在真核生物中，大多數(shù)的蛋白質(zhì)編碼基因都是轉(zhuǎn)錄為pre-mRNA后，通過加工去除非編碼區(qū)(內(nèi)含子)成為mRNA后再翻譯成蛋白質(zhì)[71]。剪接是pre-mRNA加工過程中的關(guān)鍵步驟，由一個超大蛋白質(zhì)復合體(剪接體)催化，識別并作用于內(nèi)含子與外顯子連接處的特定序列(剪接位點)，是一個動態(tài)且可調(diào)控的過程[72,73]。一般情況下，pre-mRNA含有多個假定剪接位點，其中的任何一個都可能是剪接體的對接位點。有相關(guān)研究表明，內(nèi)含子和外顯子的突變會通過引起剪接位點的改變而調(diào)控基因表達，進而引發(fā)疾病或經(jīng)濟性狀差異[74～77]。隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，MPRA成為研究pre-mRNA剪接的一種日益流行的方法。Rosenberg等[9]用MPRA探究200多萬個基因的可變剪接位點，他們將黃色熒光蛋白衍生物的序列分成兩個外顯子，并在兩個外顯子之間引入具有簡并序列的內(nèi)含子，每個內(nèi)含子都設計兩個相互競爭的剪接位點，并在兩個相互競爭的位點之間或遠端位點的下游位置插入兩個長為25 bp的完全簡并序列，由此創(chuàng)建了兩個復雜性文庫，一個是由265,137個序列組成的5′端剪接位點文庫，另一個是由2,211,739個序列組成的3′端剪接位點文庫。將文庫轉(zhuǎn)染至細胞中，通過機器學習用RNA-seq的豐富數(shù)據(jù)建立剪接模型，預測人類SNP對剪接的影響。值得注意的是，雖然MPRA不包括外顯子跳躍文庫，但該模型能預測外顯子跳躍序列的變異。該研究提出了一個基于合成序列進行MPRA的框架，顯著提高了對pre-mRNA剪接的理解和預測人類自然遺傳變異影響的能力。Soemedi等[78]開發(fā)了一種大規(guī)模平行剪接測定(MaPSy)來篩選4964個外顯子致病突變對剪接的影響。實驗包括兩方面，一個是通過將文庫轉(zhuǎn)染細胞評估突變對體內(nèi)剪接的影響，另一個是在細胞核提取物中評估突變對體外剪接的影響。選擇長度小于或等于100 bp含突變位點的外顯子，合成為包含至少55 bp的上游內(nèi)含子和至少15 bp的下游內(nèi)含子的待測序列，根據(jù)測序獲得等位基因讀數(shù)，確定每對等位基因(突變型/野生型)的比率。雖然實驗系統(tǒng)不同，但兩種實驗得到的結(jié)果一致，約有10%的外顯子突變對剪接有影響。該研究首次提出一種對外顯子剪接突變進行大規(guī)模分析的新型技術(shù)，為大規(guī)模鑒定和描述外顯子剪接突變提供了便利。

3.2.2 RNA編輯

基因經(jīng)過轉(zhuǎn)錄后和翻譯后調(diào)控機制會產(chǎn)生不同的蛋白質(zhì)，使真核生物產(chǎn)生不同的性狀[79]。在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中，基因的pre-mRNA會經(jīng)歷各種加工修飾，如5′端加帽、剪接、3′端加尾等[80]。RNA編輯是轉(zhuǎn)錄后機制之一，它能通過編碼基因組序列改變RNA序列，進而調(diào)控基因表達。RNA編輯主要發(fā)生在非編碼區(qū)，少數(shù)發(fā)生在編碼區(qū)[81,82]。RNA編輯除了能改變蛋白質(zhì)序列外，還能影響剪接[83]、RNA穩(wěn)定性[84]、翻譯[85]等。相關(guān)研究表明，RNA編輯與多種疾病相關(guān)，如：癌癥與肌萎縮側(cè)索硬化癥(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)、帕金森病(Parkinson’s disease，PD)和AD等神經(jīng)退行性疾病[81,86]。因此，鑒定功能性編輯位點不僅有助于了解主要生物學作用，而且有助于闡明RNA編輯與疾病的關(guān)系。目前，MPRA已經(jīng)用于分析RNA編輯。Choudhury等[10]用MPRA篩選調(diào)控mRNA豐度的3′UTR功能性編輯位點，建立了一個包含770個位于3′UTR的A-to-G編輯位點的文庫，通過比較位點在DNA文庫和mRNA文庫中未編輯和編輯的相對富集度，共發(fā)現(xiàn)214個編輯位點導致報告基因活性的顯著變化，這表明相對較多的3′UTR編輯位點可能通過參與轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機制調(diào)控基因表達。Safra等[27]采用MPRA驗證假尿苷(Ψ)的位點，并分析導致其特異性的因素。該研究采用以Ψ為中心的65 bp序列和8 bp條形碼的模式設計了6411個序列，將序列克隆至編碼區(qū)(CDS)的下游形成文庫，將文庫轉(zhuǎn)染至細胞后，用一種通過作用于Ψ而阻止轉(zhuǎn)錄的物質(zhì)進行處理。因此，可通過高通量測序確定Ψ的確切堿基對位置，鑒定可導致尿苷轉(zhuǎn)化為Ψ的DNA序列和變異，從而破解RNA編輯的大部分未知調(diào)控密碼[42]。這為研究尿苷酸假尿苷化提供了一種高通量策略。

3.2.3 RNA穩(wěn)定性

眾所周知，儲存在DNA中的遺傳信息會通過mRNA傳遞給蛋白質(zhì)[87]，但該過程會受到多種水平上的調(diào)控，如：染色質(zhì)調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控和翻譯調(diào)控等。其中，轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中的mRNA穩(wěn)定性是影響蛋白質(zhì)豐度的關(guān)鍵性因素，其受3′UTR和5′UTR影響[88,89]。有研究表明，MPRA可用于研究3′UTR和5′UTR序列與mRNA穩(wěn)定性之間的關(guān)系[11,90,91]。Siegel等[92]基于fast-UTR(massively parallel functional annotation of sequences from 3′UTRs)技術(shù)分析人類3′UTR序列對mRNA穩(wěn)定性的影響，將由41,288個3′UTR序列構(gòu)建的文庫轉(zhuǎn)染至細胞中，發(fā)現(xiàn)mRNA穩(wěn)定性隨富含AU的元件(AU-rich element，ARE)的序列長度增加而顯著降低。基于這一發(fā)現(xiàn)，他們提出一個新的ARE分類系統(tǒng)來分析ARE對基因表達和mRNA穩(wěn)定性的影響，發(fā)現(xiàn)兩次實驗結(jié)果一致。通過進一步研究包括本構(gòu)衰變元件(constitutive decay element，CDE)在內(nèi)的其他基序，發(fā)現(xiàn)CDE莖環(huán)的長度對mRNA穩(wěn)定性有顯著影響，這表明該研究不僅可用于ARE，還可用于分析CDE。雖然該研究為解析人類3′UTR序列中的ARE與CDE提供了新策略，但其還有許多局限性，如：實驗分析的是3′UTR的一個子集，而不是整個基因組；該策略主要是針對ARE和CDE而設計的，對于研究其他序列的可行性未知[92]。Jia等[91]通過MPRA分析由100多萬個5′UTR變異組成的文庫，文庫轉(zhuǎn)染至HEK293細胞中，不僅發(fā)現(xiàn)上游開放閱讀框(uORF)和下游GFP之間的完全隨機化的10 bp序列會導致mRNA翻譯能力和穩(wěn)定性的差異，而且還發(fā)現(xiàn)了一個位于5′UTR中非結(jié)構(gòu)化的富含A的元件在沒有翻譯的情況下影響mRNA穩(wěn)定性。該研究結(jié)果不僅揭示了5′UTR在控制mRNA可翻譯性方面的多種序列特征，還揭示了依賴于核糖體和不依賴于核糖體的mRNA監(jiān)控途徑。

4 結(jié)語與展望

目前，MPRA已廣泛應用于人類疾病或復雜性狀的研究，但在動植物上的研究鮮有報道。盡管MPRA以其高通量的優(yōu)勢在人類疾病或復雜性狀的基因組轉(zhuǎn)錄調(diào)控和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等研究中得到廣泛的應用，并取得了顯著的進展，但其還有一些局限性，主要體現(xiàn)在如下幾個方面：(1)MPRA無法識別受調(diào)控元件影響的靶基因。MPRA需要與eQTL和Hi-C等功能基因組學技術(shù)結(jié)合使用以識別靶基因[42,93]。但當所用細胞為稀有細胞類型和遇到環(huán)境擾動時，獲得與生物學背景相匹配的數(shù)據(jù)是具有挑戰(zhàn)性的[42]。Perturb-seq能很好的解決這一問題，它針對MPRA驗證的調(diào)控元件設計一個與條形碼相關(guān)的gRNA文庫，條形碼能調(diào)控gRNA靶基因的表達[42]。將文庫轉(zhuǎn)染至可表達Cas9蛋白的細胞系中，gRNA擾亂感興趣的區(qū)域，通過scRNA-seq分析轉(zhuǎn)錄組的數(shù)據(jù)變化，進而驗證調(diào)控元件的功能[94]，并揭示調(diào)控元件的靶基因以及相關(guān)通路。(2)MPRA在檢測長目標序列受到限制。原因有兩點，一個是寡核苷酸序列的合成能力有限，序列大多在300 bp以內(nèi)，這使MPRA大多用于分析短目標序列的活性差異。雖然300 bp足夠用于分析特定的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點、局部序列的相互作用等[35]，但大部分完整的調(diào)控元件都大于300 bp。同時，相關(guān)研究表明MPRA結(jié)果受目標序列長度的影響最大，隨著目標序列的增長，MPRA檢測活性的能力也會增加[38,95]。Klein等[95]提出了一項用于合成長目標片段的新技術(shù)，即HMPA。未來，人們可以通過進一步的開發(fā)或改進HMPA等方法構(gòu)建復雜且統(tǒng)一的長目標序列文庫，擴大MPRA的應用領(lǐng)域和研究深度。另一個是STARR-seq雖然能通過隨機剪切和捕獲等方法來進行長目標序列的分析，但這些方法都需要大量的DNA樣本[30,96]。因此，在應用此種方法研究稀有樣本和瀕臨物種會面臨巨大的挑戰(zhàn)。(3)載體染色質(zhì)的不確定性。AAV MPRA載體進入細胞后，AAV基因組會由單鏈DNA轉(zhuǎn)為雙鏈DNA，然后以環(huán)化單體或共聚體外顯子的形式存在，從而獲得染色質(zhì)特性[97,98]。但人們不清楚衍生染色質(zhì)是否接受了全套的修飾，不能確定載體是否能完全再現(xiàn)調(diào)控元件的活性特征[44]。lentiMPRA的載體整合到宿主基因組中會被所有表觀遺傳修飾因子標記，但整合位置效應對檢測結(jié)果有影響[42]。將報告基因載體特異性插入至宿主基因組可以改善這一問題[99]，但該方法還沒有在MPRA中實現(xiàn)。(4)不同實驗設計的一致性。隨著MPRA的廣泛應用，其實驗策略越來越多樣化，各種策略之間的一致性也成為研究者需要考慮的因素。Klein等[95]基于經(jīng)典MPRA、STARR-seq和lentiMPRA設計了9種實驗策略，并分析實驗結(jié)果的一致性。結(jié)果表明，目標序列位于最小啟動子5′UTR而條形碼位于報告基因3′UTR的lentiMPRA、目標序列和條形碼分別位于最小啟動子和報告基因5′UTR的lentiMPRA、以ORI(the bacterial plasmid origin-of-replication)為啟動子的STARR-seq和經(jīng)典MPRA有良好的一致性，而與以HSS為啟動子的STARR-seq、目標序列和條形碼分別位于最小啟動子和報告基因3′UTR的lentiMPRA沒有良好的一致性。這表明實驗策略之間存在差異，要求研究者在制定研究策略時要考慮好各方面的因素，避免引起不必要的誤差。

MPRA不僅可以用于研究人類疾病，還能用于研究生物進化的問題。如，結(jié)合祖先序列重建法檢測調(diào)控元件在進化過程中的活性變化[100]；結(jié)合序列掃描法鑒定功能性等位基因并繪制精細圖譜[35]等?？傊?，隨著科學技術(shù)的不斷發(fā)展，新的研究方法以及技術(shù)會不斷出現(xiàn)，為基因組學研究帶來巨大的發(fā)展空間。MPRA作為一種高通量、應用范圍廣的研究基因表達調(diào)控的利器，未來在人類疾病、動植物重要性狀的遺傳機理解析等領(lǐng)域?qū)⒌玫礁鼜V泛的應用。

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Massively parallel reporter assay: a novel technique for analyzing the regulation of gene expression

Meng Yuan1,2,3, Hui Li1,2,3, Shouzhi Wang1,2,3

Massively parallel reporter assay (MPRA) is a high-throughput analysis method that can simultaneously investigate the activity of thousands of regulatory elements in the genome. MPRA introduces a uniquely identified barcode on a conventional luciferase reporter gene vector, sequences the DNA barcode before transfection and the mRNA barcode after transfection by next-generation sequencing technology, and uses the ratio of mRNA and DNA barcode reads to analyze the activity of cis-regulatory elements. Since MPRA was proposed, it has been widely used in the identification of genomic cis-regulatory elements and functional variants, the effect of post-transcriptional regulation on phenotypes and so on. In this review, we summarize the development history, basic principles, experimental procedures and statistical analysis methods of MPRA, and its applications in post-transcriptional regulation and cis-regulatory elements. It also provides prospects for its development and useful references for researchers in related fields to understand and apply MPRA.

massively parallel reporter assay; gene expression regulation; cis-regulatory elements; post-transcriptional regulation

2023-07-03;

2023-09-30;

2023-10-07

十四五國家重點研發(fā)計劃(編號：2022YFF1000201)，國家自然科學基金項目(編號：31572394)，國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項目(編號：CARS-41)和黑龍江省自然科學基金聯(lián)合引導項目(編號：LH2021C036)資助[Supported by the National Key Research and Development Program of China (No. 2022YFF1000201), the National Natural Science Foundation of China (No. 31572394), China Agriculture Research System of MOF and MARA (No. CARS-41), and the Joint Guidance Project of Heilongjiang Natural Science Foundation (No. LH2021C036)]

袁萌，碩士研究生，專業(yè)方向：動物遺傳育種與繁殖。E-mail: yuanmeng1501@163.com

王守志，博士，教授，博士生導師，研究方向：動物遺傳育種與繁殖。E-mail: shouzhiwang@neau.edu.cn

10.16288/j.yczz.23-180

(責任編委: 方向東)