茉莉酸甲酯對(duì)水稻紋枯病的誘導(dǎo)抗性及防御酶活性影響的研究

黃俊寶，陳立才，曹中盛，孫濱峰，李艷大

（江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)工程研究所/江西省農(nóng)業(yè)信息化工程技術(shù)研究中心，江西 南昌 330200）

水稻紋枯病是由立枯絲核菌（Rhizoctonia solaniKühn）引起的一種世界性土傳真菌病害，隨著矮稈多蘗品種的密植、高肥、高產(chǎn)栽培技術(shù)的推廣和管理方式的改變，紋枯病的發(fā)生日趨嚴(yán)重，嚴(yán)重時(shí)產(chǎn)量損失超30%，嚴(yán)重威脅著我國(guó)水稻生產(chǎn)的安全［1］。當(dāng)前，水稻抗紋枯病育種至今未發(fā)現(xiàn)對(duì)其免疫的資源材料，缺少高抗品種［2］，其防治措施仍以高效、快速、簡(jiǎn)便的化學(xué)防治為主［3］，但不合理使用化學(xué)農(nóng)藥所導(dǎo)致的環(huán)境污染、農(nóng)藥殘留、抗藥性問(wèn)題日益突出［4-5］。近年來(lái)，比較熱門的紋枯病生物防治雖然具有安全、無(wú)殘留、無(wú)抗藥性、環(huán)境兼容性好等優(yōu)點(diǎn)［6］，且已篩選到具有明顯防治效果的生防菌［5-9］，但其防效較慢，防治技術(shù)要求高，易受環(huán)境因素的影響，且難以應(yīng)對(duì)突發(fā)性病蟲害［10］，因而其實(shí)際應(yīng)用受到限制。因此，尋找更適宜的防治方法來(lái)控制水稻紋枯病顯得更為迫切。

植物誘導(dǎo)抗病性是植物抵御病害侵染的重要機(jī)制［11］，利用激發(fā)子可激活作物自身免疫系統(tǒng)，誘導(dǎo)作物產(chǎn)生系統(tǒng)、持久和廣譜的抗病性，為作物病害的綠色防治提供了新思路。茉莉酸類物質(zhì)（Jasmonates, JAs）是植物誘導(dǎo)抗病研究領(lǐng)域應(yīng)用較廣的一種高酶活性激發(fā)子［12］。研究表明，外源MeJA能提高植物過(guò)氧化物酶（Peroxidase,POD）、過(guò)氧化氫酶（Catalase, CAT）、超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase, SOD）、苯丙氨酸解氨酶（Phenylalnaine Ammonialyase, PAL）、多酚氧化酶（Polyphenoloxidase, PPO）、抗壞血酸過(guò)氧化物酶（Ascorbate Peroxidase, APX）等防御酶活性，顯著地減輕了巴西煙草病毒?。?3］、稻瘟?。?4］、水稻白葉枯?。?5］、辣椒青枯?。?6］等作物病害的發(fā)生，但關(guān)于MeJA誘導(dǎo)水稻抗紋枯病效應(yīng)的研究較少。為進(jìn)一步探索MeJA誘導(dǎo)水稻抗紋枯病的效應(yīng)，本研究擬以菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定MeJA對(duì)水稻紋枯病菌絲的抑菌效果，以外源MeJA噴施處理水稻幼苗的方式測(cè)定水稻紋枯病病情指數(shù)，篩選出具有較好誘抗效果的MeJA濃度，并測(cè)定適宜濃度的MeJA噴施誘導(dǎo)處理對(duì)水稻防御酶活性的影響，以期為綠色防控水稻紋枯病提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試水稻品種：中嘉早17，其種子經(jīng)消毒催芽后播種于塑料盆中，培養(yǎng)至4葉1心期。

水稻紋枯病菌：AG1-IA菌絲融合群，由江西農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理實(shí)驗(yàn)室提供。

PDA培養(yǎng)基：稱取去皮馬鈴薯200 g切成小塊，加蒸餾水1000 mL煮沸20~30 min，用紗布過(guò)濾后補(bǔ)加蒸餾水至1000 mL，加入葡萄糖20 g，瓊脂粉20 g，加熱溶化后分裝，121 ℃高壓滅菌20 min。

茉莉酸甲酯：購(gòu)自美國(guó)Merck公司，以少量二甲基亞砜（Dimethyl Sulfoxide，DMSO）溶解，再用含0.1% Tween-80的蒸餾水配成10.00 mmol/L溶液備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 MeJA對(duì)水稻紋枯病菌絲生長(zhǎng)的影響 采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定MeJA對(duì)水稻紋枯病菌絲生長(zhǎng)的影響。MeJA設(shè)置7個(gè)濃度，分別為0、0.01、0.05、0.10、0.50、1.00、2.00 mmol/L，其中對(duì)照添加含0.1% Tween-80的等量無(wú)菌水。將預(yù)培養(yǎng)48 h的病菌菌絲塊（直徑0.5 cm）移至含不同濃度MeJA的PDA平板中央，于25 ℃下培養(yǎng)，每個(gè)處理重復(fù)3次。48 h后用十字交叉法測(cè)定每個(gè)處理的菌落直徑，以3個(gè)重復(fù)的算術(shù)平均值為菌落直徑的測(cè)定結(jié)果，抑制率計(jì)算公式：抑制率（%）=［1-(處理菌落直徑-菌塊直徑)/(對(duì)照菌落直徑-菌塊直徑)］×100%［17］。

1.2.2 MeJA對(duì)水稻幼苗抗紋枯病的誘導(dǎo)效應(yīng) 參照Park等［18］的方法，將紋枯病菌轉(zhuǎn)接至PDA培養(yǎng)基正中央，置于25 ℃下培養(yǎng)48 h后，無(wú)菌條件下在菌落邊緣打孔，獲取直徑5 cm的菌塊備用。將濃度為0、0.01、0.05、0.10、0.50、1.00、2.00 mmol/L MeJA噴霧至4葉1心期的水稻幼苗上，使植株的全部葉片濕潤(rùn)滴液為止，對(duì)照（CK）為含0.1% Tween-80的無(wú)菌蒸餾水。處理12 h后，用無(wú)菌鑷子夾取直徑為5 cm菌塊接種在水稻葉鞘內(nèi)側(cè)，每株接種一塊，每個(gè)處理10株，重復(fù)3次，接種后立即用保鮮膜包裹，噴水保濕處理24 h。出現(xiàn)典型癥狀后，立即取下保鮮膜，保溫保濕處理7 d左右進(jìn)行病情指數(shù)調(diào)查［19］：病情指數(shù)=∑（各級(jí)病株數(shù)×各級(jí)代表值）/（調(diào)查總株數(shù)×最高級(jí)代表值）×100；誘抗效果（%）=（對(duì)照組病情指數(shù)-處理組病情指數(shù)）/對(duì)照組病情指數(shù)×100%。

1.2.3 MeJA對(duì)水稻幼苗防御酶活性的影響 水稻長(zhǎng)到4葉1心期時(shí)，設(shè)置4種方式處理：CK為對(duì)照；T-R：接種紋枯病菌絲塊；T-MeJA：用0.10 mmol/L MeJA噴霧處理；T-MeJA+R：用0.10 mmol/L MeJA噴霧處理12 h后，轉(zhuǎn)接紋枯病菌保濕處理。方法同1.2.2。每種處理方式3次重復(fù)。分別在處理0、24、48、72、96 h后，取水稻葉片2.00 g于液氮中冷凍保存，用于測(cè)定POD、CAT、SOD、PAL和PPO酶的酶活性。

POD、PAL、PPO酶活性測(cè)定參照Qin等［20］的方法，CAT、SOD酶活性測(cè)定參照陳利鋒等［21］的方法。

1.3 數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用Excel 2019軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和圖表繪制，應(yīng)用SPSS 25.0軟件中Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行處理之間的差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 MeJA對(duì)水稻紋枯病菌菌絲生長(zhǎng)的影響

由表1可知，將水稻紋枯病菌菌絲塊置于在含不同濃度MeJA的PDA平板上，菌絲生長(zhǎng)情況在數(shù)值上雖略有不同，但無(wú)明顯差異，說(shuō)明在0.01~2.00 mmol/L濃度范圍內(nèi)的MeJA對(duì)水稻紋枯病菌菌絲生長(zhǎng)無(wú)直接抑制作用。

表1 不同濃度MeJA對(duì)水稻紋枯病菌菌絲生長(zhǎng)的影響

2.2 MeJA對(duì)水稻幼苗抗紋枯病的誘導(dǎo)效應(yīng)

使用0.01~2.00 mmol/L MeJA誘導(dǎo)處理均能降低水稻紋枯病病情指數(shù)，尤以0.10 mmol/L MeJA處理后的紋枯病病情指數(shù)最低，為22.96，此時(shí)誘抗效果為51.56%；0.05 mmol/L MeJA的誘抗效果次之，為43.75%，但2種濃度MeJA的誘抗效果差異不顯著。此后，誘抗效果隨著MeJA濃度的增加而下降，當(dāng)濃度升高至2.00 mmol/L時(shí)，誘抗效果僅為7.81%，說(shuō)明MeJA能誘導(dǎo)水稻對(duì)紋枯病產(chǎn)生抗性作用，且具有濃度效應(yīng)（圖1）。

圖1 不同濃度MeJA對(duì)紋枯病的誘抗效果

2.3 MeJA對(duì)水稻防御酶活性的影響

2.3.1 過(guò)氧化物酶（POD）酶活性 如圖2所示，CK的葉片POD酶活性隨著處理時(shí)間的推移而逐漸升高，但24 h后葉片POD酶活性變化差異不顯著；T-R、T-MeJA、T-MeJA+R這3種處理方式均能顯著提高水稻葉片的POD酶活性；T-R處理在24 h達(dá)到峰值，比CK提高了8%，此后POD酶活性變化差異不顯著；T-MeJA、T-MeJA+R對(duì)POD酶活性的影響要遠(yuǎn)高于T-R處理，這3種處理方式均在48 h達(dá)到峰值，分別比CK提高了42%、32%和7%，3種處理對(duì)POD酶活性的影響差異顯著，此后其酶活性變化呈下降趨勢(shì)，但72 h后的POD酶活性變化趨于平緩；在48 h時(shí)，不同處理對(duì)POD酶活性的影響差異顯著，T-MeJA和T-MeJA+R處理對(duì)POD酶活性的影響顯著高于T-R處理；在96 h時(shí)，各處理后的POD酶活性仍顯著高于處理前，說(shuō)明外界刺激誘導(dǎo)效應(yīng)的可持續(xù)時(shí)間超過(guò)96 h。

圖2 不同處理對(duì)水稻葉片POD酶活性的影響

2.3.2 多酚氧化酶（PPO）酶活性 由圖3可知，與CK相比，T-MeJA、T-R和T-MeJA+R等3種處理均能顯著提升葉片PPO酶活性，葉片PPO酶活性隨著時(shí)間的推移而呈現(xiàn)明顯的先升后降的變化趨勢(shì)，CK的葉片PPO酶活性隨著時(shí)間的推移而逐漸升高，但48 h后的葉片PPO酶活性變化無(wú)顯著差異；T-MeJA+R處理的葉片PPO酶活性在24 h達(dá)到峰值，比CK增加了70%，此后隨著時(shí)間的推移而緩慢下降；T-R和T-MeJA處理的葉片PPO酶活性在48 h達(dá)到峰值，分別比CK增加了54%和64%，72 h后的葉片PPO酶活性變化趨于平緩。從整體上看，T-R處理接種紋枯病對(duì)葉片PPO酶活性的誘導(dǎo)效應(yīng)不低于T-MeJA噴霧處理。各處理后的葉片PPO酶活性與處理前的差異顯著，說(shuō)明外界刺激誘導(dǎo)效應(yīng)的可持續(xù)時(shí)間超過(guò)96 h。

圖3 不同處理對(duì)水稻葉片PPO酶活性的影響

2.3.3 苯丙氨酸解氨酶（PAL）酶活性 由圖4可知，CK的葉片PAL酶活性在48 h后達(dá)到峰值，此后酶活性變化差異不顯著；T-R、T-MeJA、T-MeJA+R等3種處理方式均能顯著提高水稻葉片PAL酶活性，葉片中PAL酶活性在48 h達(dá)到峰值后隨著時(shí)間的推移而呈下降的趨勢(shì)，T-R、T-MeJA、T-MeJA+R處理的葉片PAL酶活性峰值時(shí)分別比CK提高12%、27%和46%；48 h后T-R處理的葉片PAL酶活性變化差異不顯著，而T-MeJA與T-MeJA+R處理48 h后的葉片PAL酶活性呈明顯的下降趨勢(shì)；T-R處理方式對(duì)葉片PAL酶活性的誘導(dǎo)效應(yīng)明顯低于T-MeJA、T-MeJA+R。各處理的葉片PLA酶活性在不同時(shí)段內(nèi)保持相似的變化趨勢(shì)，在24~72 h之間，不同處理對(duì)葉片PAL酶活性的影響存在顯著差異，以T-MeJA+R的誘導(dǎo)效果最強(qiáng)，T-MeJA次之，T-R則最弱，外界刺激誘導(dǎo)效應(yīng)的可持續(xù)時(shí)間超過(guò)96 h。

圖4 不同處理對(duì)水稻葉片PAL酶活性的影響

2.3.4 過(guò)氧化氫酶（CAT）酶活性 由圖5可知，CK的葉片CAT酶活性隨著時(shí)間的變化而略有提高，但差異不顯著；T-R、T-MeJA、T-MeJA+R等3種處理方式均能顯著提高水稻葉片CAT酶活性，葉片中的CAT酶活性均呈先升后降的變化趨勢(shì)，CAT酶活性在48 h達(dá)到峰值，T-R、T-MeJA、T-MeJA+R處理的葉片CAT酶活性分別比CK提高39%、61%和78%，3種處理方式對(duì)葉片CAT酶活性的影響差異顯著；72 h時(shí)，T-MeJA+R處理的葉片CAT酶活性明顯降低，T-R和T-MeJA處理的葉片CAT酶活性的下降趨勢(shì)較為平緩。T-R處理后接種紋枯病對(duì)葉片CAT酶活性的誘導(dǎo)效應(yīng)低于T-MeJA、T-MeJA+R處理。在96 h后，T-R、T-MeJA、T-MeJA+R各處理的葉片CAT酶活性分別比CK提高20%、40%和29%，3種處理方式對(duì)葉片CAT酶活性的影響也存在顯著差異，外界刺激誘導(dǎo)效應(yīng)的可持續(xù)時(shí)間超過(guò)96 h。

圖5 不同處理對(duì)水稻葉片CAT酶活性的影響

2.3.5 超氧化物歧化酶（SOD）酶活性 由圖6可知，CK葉片的SOD酶活性隨時(shí)間波動(dòng)變化，T-R、T-MeJA與T-MeJA+R這3種處理方式均能顯著提高水稻葉片中SOD酶活性，葉片中SOD酶活性均呈先升后降的變化趨勢(shì)，在48 h達(dá)到峰值，T-R、T-MeJA、T-MeJA+R這3種處理的葉片SOD酶活性分別比CK提高了34%、56%和69%，3種處理方式對(duì)葉片SOD酶活性的影響差異顯著；T-R處理接種紋枯病對(duì)葉片SOD酶活性的誘導(dǎo)效應(yīng)明顯低于T-MeJA、T-MeJA+R，T-R、T-MeJA+R處理在72和96 h時(shí)的葉片SOD酶活性變化無(wú)顯著差異，但仍高于CK，說(shuō)明外界刺激誘導(dǎo)效應(yīng)的可持續(xù)時(shí)間超過(guò)96 h。

圖6 不同處理對(duì)水稻葉片SOD酶活性的影響

3 結(jié)論與討論

JAs是植物抗病信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的重要信號(hào)分子［22］，能激發(fā)植株體內(nèi)處于蟄伏狀態(tài)的防御系統(tǒng)，可誘導(dǎo)水稻對(duì)稻瘟病［14,23］、白葉枯病［15,24］、細(xì)菌性條斑?。?5］的抗性。目前的研究表明：茉莉酸（JA）、水楊酸（SA）和乙烯（ET）3種信號(hào)途徑均參與調(diào)控水稻紋枯病的抗性［3,26-30］。本研究結(jié)果顯示，0.01~2.00 mmol/L MeJA對(duì)水稻紋枯病菌的菌絲生長(zhǎng)無(wú)直接的抑制作用，但0.10 mmol/L MeJA噴霧處理可顯著降低水稻幼苗紋枯病病情指數(shù)，表明一定濃度的MeJA能誘導(dǎo)水稻對(duì)紋枯病產(chǎn)生抗性。

水稻幼苗接種紋枯病菌、用MeJA誘導(dǎo)處理后均能顯著提高幼苗葉片中POD、PPO、PAL、CAT和SOD酶活性。吳樣孫等［31］用3個(gè)對(duì)紋枯病抗性不同的品種接種水稻紋枯病，PAL、PPO、POD的酶活性水平均比未接種的對(duì)照高。鐘慶燕［32］用JA處理的水稻植株P(guān)AL、POD和β-1,3-葡聚糖酶活性顯著增加。向妙蓮等［24］用MeJA處理水稻植株后的葉片POD、CAT、SOD和PPO酶活性均有不同程度的提高，這與本研究結(jié)果一致，表明施用外源MeJA與接種紋枯病菌均能引起水稻相關(guān)防御酶活性顯著升高，以此增強(qiáng)水稻幼苗自身防御能力，從而提高水稻幼苗對(duì)紋枯病的抗性。鐘慶燕［32］用JA處理對(duì)葉片PPO酶活性卻無(wú)明顯的誘導(dǎo)作用，這可能與所用水稻的品種抗性差異有關(guān)。對(duì)同一時(shí)間內(nèi)不同處理之間的差異顯著性分析可知，用MeJA誘導(dǎo)處理或誘導(dǎo)處理后再接種紋枯病菌，對(duì)POD、PAL、SOD、CAT酶活性誘導(dǎo)效應(yīng)均顯著高于單獨(dú)接種紋枯病，但單獨(dú)接種紋枯病對(duì)葉片PPO酶活性的影響效應(yīng)要高于MeJA誘導(dǎo)或MeJA誘導(dǎo)后接種紋枯病；MeJA誘導(dǎo)再接種紋枯病對(duì)PAL、SOD、CAT酶活性的誘導(dǎo)效應(yīng)明顯高于MeJA誘導(dǎo)處理，而2種處理方式在葉片POD和PPO酶活性誘導(dǎo)效應(yīng)方面的差異不顯著。

本研究發(fā)現(xiàn)，MeJA對(duì)室內(nèi)苗期水稻紋枯病最佳誘抗效果達(dá)51.56%，誘抗持續(xù)時(shí)間超過(guò)96 h，說(shuō)明MeJA誘導(dǎo)水稻抗紋枯病應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)的前景較好，但用相同濃度MeJA處理大田環(huán)境下苗期的水稻紋枯病抗性誘導(dǎo)效果卻不明顯。MeJA誘導(dǎo)水稻自身產(chǎn)生的紋枯病抗性較弱，且田間環(huán)境復(fù)雜多變，眾多因素可以影響其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，或許是田間效應(yīng)不明顯的主要原因。為形成具有實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用價(jià)值的水稻紋枯病綠色防控產(chǎn)品，還需在水稻－紋枯病互作機(jī)制及其抗性調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的基礎(chǔ)上，對(duì)MeJA田間應(yīng)用的條件及其效果開(kāi)展進(jìn)一步的研究。