血漿長鏈非編碼RNA LOC146880作為預測晚期非小細胞肺癌患者免疫治療療效的生物標志物研究

戴隆妹 楊力寶

【摘要】? 目的? ? 探討長鏈非編碼RNA LOC146880是否可作為評估晚期非小細胞肺癌（NSCLC）患者接受腫瘤免疫治療的臨床預后生物標志物。方法? ? 納入接受腫瘤免疫治療的42例晚期NSCLC患者作為試驗組，根據(jù)ROC最佳截斷值將基線Inc RNA LOC146880表達分為高、低表達組，另外選擇同期42例肺部良性疾病患者作為對照組。研究終點是根據(jù)RECIST標準評估晚期NSCLC患者的緩解率（RR）、無進展生存期 （PFS） 和總生存期（OS）。結(jié)果? ? 試驗組的Inc RNA LOC146880表達水平顯著高于對照組；在臨床相關性分析中，Inc RNA LOC146880表達與腫瘤轉(zhuǎn)移部位的數(shù)量顯著相關；在納入的42例晚期NSCLC患者中，總體RR為39.2%；在20.5個月的中位隨訪之后，相較于Inc RNA LOC146880高表達組，Inc RNA LOC146880低表達組的RR顯著增高，PFS顯著增長，OS也顯著增長。結(jié)論? ? 接受腫瘤免疫治療的晚期NSCLC患者，Inc RNA LOC146880低表達預示著較好的臨床預后。血漿長鏈非編碼RNA LOC146880可作為預測晚期NSCLC免疫治療療效的生物標志物。

【關鍵詞】? 非小細胞肺癌； lnc RNA； 免疫治療

中圖分類號：R392；R734.2? ? ? ? 文獻標識碼：A

文章編號：1672-1721（2023）26-0044-03

DOI：10.19435/j.1672-1721.2023.26.014

腫瘤免疫治療是非小細胞肺癌（NSCLC）治療中最重要的突破之一，目前迫切需要篩選能預測NSCLC患者的腫瘤免疫治療療效的生物標志物。高突變的腫瘤負荷（TMB）曾被報告為潛在的預測免疫治療療效的生物標志物之一[1]。然而，缺乏標準化的檢測和評估手段限制了TMB作為常規(guī)臨床標志物的應用[2]。最近，由中性粒細胞與淋巴細胞比值（NLR）和乳酸脫氫酶（LDH）的聯(lián)合應用推出的肺免疫預后指數(shù)（LIPI）評分被提議作為免疫治療療效的血液生物標志物之一，但由于來自多中心的回顧性研究[3]和RCT研究[4]得出的相反結(jié)果，因此該評分仍存在爭議。在本研究中長鏈非編碼RNA （Inc RNA）評估了晚期NSCLC患者在接受免疫治療前血液LOC146880的表達水平與臨床獲益之間的關聯(lián)，旨在研究Inc RNA LOC146880是否可作為預測晚期NSCLC患者免疫治療療效的生物標志物。

1? ? 研究對象與研究方法

1.1? ? 研究對象和研究終點? ? 連續(xù)收集2018年12月—2021年12月期間就診于三明市第二人民醫(yī)院的腫瘤科且接受腫瘤免疫治療的NSCLC 晚期患者（n=42），作為試驗組，納入同期42例肺部良性疾病患者作為對照組。收集2組人群的外周血血漿樣本，以上84名研究對象均簽署知情同意書，本研究通過該院醫(yī)學倫理委員會審批。研究終點：主要終點為緩解率（response rate，RR），根據(jù)實體瘤療效評價新標準RECIST評估RR；次要終點為無進展生存期（progression-free survival， PFS）和總生存期（overall survival，OS）。

1.2? ? 試驗方法 試驗方法具體如下。

1.2.1? ? 血漿RNA提取 將2組研究對象的凍存血漿于4 ℃冰上自然融化，通過離心機（4 ℃，12 000 xg）離心沉淀血漿雜質(zhì)；750 μL TRIzol LS裂解液裂解后，靜置5 min，依據(jù)血漿RNA 提取試劑TRIzol LS （Life公司）的說明書，抽取10 μL RNA。

1.2.2? ? 引物合成? ? 通過在線數(shù)據(jù)庫NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）查詢Inc RNA LOC146880和GAPDH的序列，然后根據(jù)所獲得的序列在Primer 6.0中生成引物。Inc RNA LOC146880引物序列的正向為5'-AACTAAGGCACGGTCAACTATCA-3'，反向為5'-GGAAACTTTGGCTTTAAAACGA-3'；內(nèi)參基因為GAPDH，引物序列的正向為5'-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3'，反向為5'-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3'，以上引物均由上海生工生物公司合成。

1.2.3? ? 實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）檢測? ? Inc RNA LOC146880表達水平參照使用SuperScript Ⅱ逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒 （Invitrogen）說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板進行qRT-PCR擴增反應，使用SYBR Green方法在ABI 7500序列檢測系統(tǒng)（Applied Biosystems）上測量通過qRT-PCR確定的相對RNA水平。

1.3? ? 統(tǒng)計學方法? ? 采用SPSS 22.0統(tǒng)計學軟件分析數(shù)據(jù)，計數(shù)資料以百分比表示，采用χ2檢驗，Mann-Whitney 檢驗或Fisher 精確檢驗，計量資料以x±s表示，采用t檢驗，多因素分析采用COX回歸分析， P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2? ? 結(jié)果

2.1? ? 患者的基線特征? ? 連續(xù)入組42例接受腫瘤免疫治療的晚期NSCLC患者基本資料見表1?；颊吣挲g35～86歲，中位年齡70.5歲，其中24例患者（57%）≥65歲，18例患者（43%）<65歲；28例患者 （67%） 為男性，14例患者（33%）為女性；16例患者（38%）病理類型為鱗癌，26例患者（62%）病理類型為腺癌；22例患者（52%）出現(xiàn)1～2個肺外轉(zhuǎn)移部位，20例患者（48%）出現(xiàn)≥3個肺外轉(zhuǎn)移部位；27例患者（64%）有既往胸部放療史，15例患者（36%）無既往胸部放療史，見表1。

2.2? ? 血漿Inc RNA LOC146880的表達及與患者臨床病理特征的相關性分析? ? 與對照組比較，試驗組血漿Inc RNA LOC146880表達水平較高（P<0.05），見表2。進一步研究表明Inc RNA LOC146880表達僅與腫瘤轉(zhuǎn)移部位的數(shù)量有關（P<0.05），與年齡、性別、吸煙史、病理類型、BMI 、合并癥、腦轉(zhuǎn)移、肝轉(zhuǎn)移、胸腔積液、胸部放療史、類固醇使用史均無關（P>0.05），見表3。

2.3? ? 總體療效及不良反應、緩解率（RR）、無進展生存期（PFS）、總生存期（OS）? ? 研究發(fā)現(xiàn)，42例晚期NSCLC患者總體RR為39.2%，18個患者出現(xiàn)緩解（15個PD和3個CD）和7個患者出現(xiàn)SD。在47%（20/42）患者中觀察到免疫相關不良事件，其中常見的是肺炎（n=5，11.9%）、甲狀腺功能障礙（n=3，7.14%）、虛弱（n=3，7.14%）。在短期停止免疫治療和大劑量類固醇治療后，所有肺炎均治愈，但是出現(xiàn)1例3級肝炎與疾病進展同時發(fā)生，因此停止治療并給予類固醇直至消退。與Inc RNA LOC146880高表達組相比，Inc RNA LOC146880低表達組患者顯示出更高的RR，更長的PFS，更長的OS（P<0.05）。

3? ? 討論

肺癌是世界上最常見的癌癥（占總病例數(shù)的?11.6%），也是癌癥死亡的主要原因（占癌癥死亡總數(shù)的18.4%）[5]。NSCLC屬于肺癌的常見類型之一，近1/3肺癌患者為非小細胞肺癌[6]，對患者身心健康和家庭負擔影響較大，且由于臨床上尚缺乏有效的篩查手段和早診治的方法， 絕大多數(shù)患者確診時已是晚期[7]。20世紀90年代以來，隨著腫瘤免疫學和分子生物學的飛速發(fā)展，研究者發(fā)現(xiàn)肺癌的發(fā)生發(fā)展與腫瘤組織的基因突變以及患者的免疫失衡有著密切的聯(lián)系[8]。同時，腫瘤微環(huán)境中的免疫細胞和腫瘤細胞之間存在復雜“博弈”關系。肺癌的免疫治療成為肺癌多學科治療中新的研究方向和應用熱點，日益受到重視，值得進一步探索。然而，對于臨床上接受腫瘤免疫治療的患者，目前仍缺少有效的臨床療效預測生物標志物。因此需通過研究肺癌的免疫微環(huán)境，進而找到可靠的生物標志物，指導臨床上有效地篩選肺癌免疫治療適宜患者。lnc RNA是一類具有 200 個或更多核苷酸的非編碼轉(zhuǎn)錄物。lnc RNA作為一種新興的腫瘤標志物，在腫瘤的診斷和治療中具有重要價值。隨著高通量測序技術的發(fā)展，lnc RNA在人類腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的作用逐漸引起關注[9]。目前已有研究表明lnc RNA參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的一系列病理生理過程，包括細胞增殖、凋亡、細胞遷移侵襲、細胞周期等，有望作為腫瘤免疫治療新的有效生物標志物[10]。對于肺癌的研究，越來越多的證據(jù)也表明，lncRNA作為癌基因或抑癌基因表達的標志物而參與了肺癌的發(fā)生[11]。之前的研究表明，Inc RNA LOC146880作為染色體17q24.3上的一個lnc RNA，在腫瘤組織中的表達高于在鄰近正常組織中，高表達與NSCLC的預后不良有關[12]。有學者進一步研究發(fā)現(xiàn)NSCLC中Inc RNA LOC146880的表達與患者生存結(jié)果相關，機制可能與Inc RNA LOC146880在肺腫瘤細胞中的高表達導致KPNA2下調(diào)以及細胞增殖、遷移和侵襲的抑制有關；此外Inc RNA LOC146880的轉(zhuǎn)錄活性也受啟動子甲基化的影響[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，晚期NSCLC患者血漿LOC146880表達與腫瘤轉(zhuǎn)移部位的數(shù)量相關（P<0.05），說明Inc RNA LOC146880高表達參與晚期NSCLC癌變進展及轉(zhuǎn)移；Inc RNA LOC146880較低表達的NSCLC患者的腫瘤免疫治療效果較好，RR更高且有更長的PFS和OS。當Inc RNA LOC146880作為免疫治療有效的生物標志物評估時，相比于其他侵入性檢查如PD-L1和TMB，可能具有更好的臨床預測價值，因為僅通過簡單的血液樣本就可以篩選出腫瘤免疫治療中可能獲益更多的部分患者。

綜上所述，血漿Inc RNA LOC146880表達與NSCLC的發(fā)生密切相關，治療前檢測Inc RNA LOC146880表達水平有助于指導免疫治療NSCLC，從而為臨床治療提供一定參考。目前臨床對Inc RNA LOC146880在NSCLC發(fā)生發(fā)展中的分子機制仍然缺乏了解，今后需要對Inc RNA LOC146880在NSCLC進展過程中的分子機制進行深入探究，以支持抗Inc RNA LOC146880單克隆抗體的研發(fā)。另外，本研究樣本量較少，需要大范圍進行驗證，同時需要進行大樣本、多中心的臨床研究，以進一步證實本結(jié)論。

參考文獻

[1] NOIA V D，D'ARGENTO E，PILOTTO S，et al.Blood serum amyloid A as potential biomarker of pembrolizumab efficacy for patients affected by advanced non-small cell lung cancer overexpressing PD-L1： results of the exploratory"FoRECATT" study[J].Cancer Immunol Immunother，2021，70（6）：1583-1592.

[2] HELLMANN M D，PAZ-ARES L，CARO R B，et al.Nivolumab plus ipilimumab in advanced non-small-cell lung cancer[J].N Engl J Med，2019，381（21）：2020-2031.

[3] MEZQUITA L，AUCLIN E，F(xiàn)ERRARA R，et al.Association of the lung immune prognostic index with immune checkpoint inhibitor outcomes in patients with advanced non-small cell lung cancer[J].JAMA Oncol，2018，4（3）：351-357.

[4] KAZANDJIAN D，GONG Y，KEEGAN P，et al.Prognostic value of the lung immune prognostic index for patients treated for metastatic non-small cell lung cancer[J].JAMA Oncol，2019，5（10）：1481-1485.

[5] OSMANI L，ASKIN F，GABRIELSON E，et al.Current WHO guidelines and the critical role of immunohistochemical markers in the subclassification of non-small cell lung carcinoma （NSCLC）：moving from targeted therapy to immunotherapy[J].Semin Cancer Biol，2018，52（Pt 1）：103-109.

[6] 李武琴.三維調(diào)強放射治療同步多西他賽周方案化療對老年局部晚期NSCLC的臨床療效分析[J].基層醫(yī)學論壇，2020，24（14）：1940-1941.

[7] 趙平孫.臨床腫瘤學進展（精）[M].北京：中國協(xié)和醫(yī)科大學出版社，2006.

[8] 周畢軍.非小細胞肺癌的治療進展[J].基層醫(yī)學論壇，2009，13（7）：253-255.

[9] BHAN A，SOLEIMANI M，MANDAL S S.Long noncoding RNA and cancer：a new paradigm[J].Cancer Res，2017，77（15）：3965-3981.

[10] 王思偉，曹秀芳，徐玉鎮(zhèn)，等.lncRNA CDKN2B-AS1靶向miR-98-5p對肺癌A549細胞增殖、侵襲的影響[J].中華內(nèi)分泌外科雜志，2021，15（3）：299-303.

[11] CALLE A S，KAWAMURA Y，YAMAMOTO Y，et al.Emerging roles of long non-coding RNA in cancer[J].Cancer Sci，2018，109（7）：2093-2100.

[12] GUTSCHNER T，HMMERLE M，DIEDERICHS S.MALAT1-a paradigm for long noncoding RNA function in cancer[J].J Mol Med （Berl），2013，91（7）：791-801.

[13] FENG N N，CHING T，WANG Y，et al.Analysis of microarray data on gene expression and methylation to identify long non-coding RNAs in non-small cell lung cancer[J].Sci Rep，2016，6：37233.（收稿日期：2023-06-12）