槲皮素腹腔注射對大鼠視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷的影響及其機(jī)制

于雯，陳肖君，肖正霞，孫艷，夏飛，李娜

1 濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)院，山東濰坊 261000；2 濟(jì)南市第二人民醫(yī)院眼科

視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷（RIRI）是青光眼、糖尿病性視網(wǎng)膜病變及缺血性視神經(jīng)病變等眼科疾病的常見病理特征［1］，視網(wǎng)膜缺血后恢復(fù)血液供應(yīng)會(huì)進(jìn)一步導(dǎo)致組織受損，從而對患者的視力造成嚴(yán)重?fù)p傷。炎癥、氧化應(yīng)激及細(xì)胞凋亡在缺血再灌注這一過程中起著重要作用［2］。視網(wǎng)膜高度依賴氧，在發(fā)生低灌注時(shí)，視網(wǎng)膜缺血造成其對氧和其他營養(yǎng)物質(zhì)的超敏狀態(tài)，當(dāng)血液供應(yīng)恢復(fù)時(shí)活性氧大量增加，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致RIRI的發(fā)生［3］。研究顯示，RIRI能夠引起視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制涉及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase）的激活，其中Csapase-3 是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵酶［4］。槲皮素（QU）廣泛存在于多種植物的花和葉中，具有抗凋亡、抗癌和抗炎活性［5-6］。研究發(fā)現(xiàn)，QU 可以通過其抗細(xì)胞凋亡作用對心肌、腎臟和腦組織的缺血再灌注損傷發(fā)揮抑制作用［7-9］，但其對RIRI是否具有改善作用尚未可知。2021 年10 月—2022 年10 月，本研究通過建立大鼠視網(wǎng)膜缺血再灌注模型，觀察QU 對大鼠RIRI的影響并探討其機(jī)制，以期為RIRI的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 主要材料 SPF 級(jí)無眼疾的Sprague-Dawley 成年雄性大鼠96 只，體質(zhì)量（225 ± 25）g，購自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SCXK（魯）20190003。本研究通過濰坊醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理審查（2021SDL023），研究中對動(dòng)物的處理符合動(dòng)物倫理原則。QU粉末和二甲基亞砜（DMSO）購自美國Sigma 公司，HE 染液購自上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司，兔抗活性Caspase-3一抗購自三鷹生物技術(shù)有限公司，DAB 顯色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司，TUNEL試劑盒購自瑞士羅氏公司。

1.2 動(dòng)物分組及干預(yù)處理 96 只Sprague-Dawley大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為對照組6 只，RIRI組、QU 組及陰性對照組各30 只。QU 組在建模前連續(xù)7 d腹腔注射QU，每天1次，劑量為每只50 mg/kg，并于建模前10 min加注1次；RIRI組、陰性對照組分別腹腔注射等量生理鹽水及DMSO，方法同QU 組；對照組不作任何處理。

1.3 RIRI 模型建立 除對照組外，RIRI 組、QU 組及陰性對照組均采用升高眼壓法［10］建立RIRI 模型。腹腔注射100 g/L水合氯醛麻醉大鼠，生理鹽水垂直平面150 cm 處懸掛可產(chǎn)生14.67 kPa（110 mmHg）的眼內(nèi)壓力，將帶有小兒頭皮針的輸液器連接好后沿大鼠右眼顳側(cè)角鞏膜緣刺入前房并用膠帶固定針頭于鼠耳，打開輸液器開關(guān)，此時(shí)可見大鼠前房深度明顯增加且眼球變硬，使用直接檢眼鏡可見大鼠視網(wǎng)膜呈灰白色，提示已達(dá)缺血狀態(tài)，持續(xù)60 min后將輸液瓶降至眼平面高度，見大鼠眼底視網(wǎng)膜血供恢復(fù)，表示RIRI建模成功。

1.4 視網(wǎng)膜組織標(biāo)本制作 分別于建模后6、12、24、48、72 h給予各組大鼠腹膜內(nèi)注射過量水合氯醛（100 mg/kg）麻醉處死，摘除右眼眼球，4%多聚甲醛、通用型組織固定液固定眼球5 d 后取出，沿角膜緣環(huán)形剪除角膜并去除晶狀體，4%多聚甲醛再次固定剩余眼球組織24 h，將固定好的視網(wǎng)膜取出，放置于提前配制好的PBS液中浸泡2 h，經(jīng)過脫水透明后進(jìn)行石蠟包埋，置于切片機(jī)上平行于視神經(jīng)進(jìn)行切片，所選切片均取自于視乳頭顳上方2 mm 處，厚度為4 μm。

1.5 視網(wǎng)膜組織形態(tài)觀察及內(nèi)層厚度測量 采用HE 染色觀察大鼠視網(wǎng)膜組織形態(tài)變化。將制作好的視網(wǎng)膜切片經(jīng)過脫蠟與水化后，蘇木素染色3～5 min，自來水沖洗干凈；鹽酸水溶液分化視網(wǎng)膜組織后滴加氨水水溶液返藍(lán)，沖洗干凈；伊紅染色5～10 min，沖洗干凈后繼續(xù)沖洗5 min；脫水封片后，在光學(xué)顯微鏡下觀察視網(wǎng)膜組織的結(jié)構(gòu)并拍照。采用計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)測量視乳頭顳上方2 mm 動(dòng)脈下從內(nèi)界膜到外叢狀層內(nèi)層的厚度。

1.6 視網(wǎng)膜組織細(xì)胞凋亡情況觀察 采用TUNEL法。視網(wǎng)膜組織切片脫蠟脫水、修復(fù)與破膜后，將TUNEL 試劑盒內(nèi)的TdT 試劑和dUTP 試劑按照1∶9的比例均勻混合后滴加在視網(wǎng)膜組織表面，置于37 ℃的水浴鍋孵育2 h，在阻斷內(nèi)源性過氧化物酶后加試劑3和DAB顯色，經(jīng)過復(fù)染、脫水及封片后在顯微鏡下觀察各組各時(shí)點(diǎn)的凋亡細(xì)胞數(shù)。

1.7 視網(wǎng)膜組織Caspase-3 檢測 采用免疫組織化學(xué)染色。視網(wǎng)膜組織石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟、無水乙醇脫水后放置于檸檬酸抗原修復(fù)緩沖液的修復(fù)盒中加熱進(jìn)行抗原修復(fù)，經(jīng)過阻斷內(nèi)源性過氧化物酶、血清封閉后加入兔抗活性Caspase-3（1∶200），4 ℃孵育過夜，滴加山羊抗兔IgG 聚合物（HRP 標(biāo)記）置于室溫中孵育50 min，經(jīng)過DAB 顯色、復(fù)染、脫水及封片后在光鏡下觀察各組各時(shí)點(diǎn)Caspase-3 陽性細(xì)胞數(shù)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS26.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料采用Shapiro-Wilk 進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，當(dāng)資料符合正態(tài)性且方差齊時(shí)，數(shù)據(jù)以-x±s表示，組間兩兩比較采用Bonferroni檢驗(yàn)，多組比較采用單因素方差分析；當(dāng)方差不齊時(shí)，組間兩兩比較采用Tamhane's T2法，多組比較采用近似F檢驗(yàn)的Welch法，重復(fù)測量數(shù)據(jù)采用重復(fù)測量的方差分析；計(jì)數(shù)資料以n（%）表示，組間比較行χ2檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組視網(wǎng)膜形態(tài)比較 對照組大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞形態(tài)及各層分界均正常。RIRI 組、陰性對照組大鼠建模6 h后視網(wǎng)膜呈高度水腫，水腫主要表現(xiàn)在神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層、神經(jīng)纖維層及內(nèi)叢狀層，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞呈空泡化；12 h后視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)目減少，空泡化加重，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞及內(nèi)核層細(xì)胞排列紊亂，各層分界模糊，細(xì)胞間隙增寬；24 h后視網(wǎng)膜水腫較前有所減輕，但細(xì)胞結(jié)構(gòu)遭到進(jìn)一步破壞，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、內(nèi)核層細(xì)胞、外核層細(xì)胞排列雜亂、細(xì)胞空泡化嚴(yán)重；48 h 后可見視網(wǎng)膜水腫基本消失且神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)、內(nèi)核層細(xì)胞數(shù)減少。QU組在各時(shí)點(diǎn)視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)較RIRI 組及陰性對照組更完整，細(xì)胞損傷程度更輕。見OSID碼圖1。

2.2 各組視網(wǎng)膜內(nèi)層厚度比較 建模后6、12 h視網(wǎng)膜內(nèi)層厚度RIRI組、陰性對照組＞QU組＞對照組，建模后24 h視網(wǎng)膜內(nèi)層厚度QU組＞RIRI組、陰性對照組＞對照組，建模后48、72 h視網(wǎng)膜內(nèi)層厚度對照組＞QU組＞RIRI組、陰性對照組（P均＜0.05）。見表1。

表1 建模后不同時(shí)點(diǎn)各組視網(wǎng)膜內(nèi)層厚度比較（μm，-x ± s）

2.3 各組視網(wǎng)膜組織細(xì)胞凋亡情況比較 對照組視網(wǎng)膜組織偶見凋亡細(xì)胞表達(dá)；RIRI 組、陰性對照組視網(wǎng)膜組織凋亡細(xì)胞數(shù)在建模6、12、24 h 逐漸升高，于建模24 h 至高峰，并于建模48、72 h 逐漸降低；QU 組各時(shí)點(diǎn)視網(wǎng)膜組織凋亡細(xì)胞數(shù)變化趨勢與RIRI 組、陰性對照組相同，但均低于同時(shí)點(diǎn)RIRI 組、陰性對照組（P均＜0.05）。見表2。

表2 建模后不同時(shí)點(diǎn)各組視網(wǎng)膜組織凋亡細(xì)胞數(shù)比較（個(gè)/毫米2，-x ± s）

2.4 各組視網(wǎng)膜組織Caspase-3 表達(dá)比較 對照組視網(wǎng)膜組織偶見Caspase-3 陽性細(xì)胞表達(dá)；RIRI 組、陰性對照組視網(wǎng)膜組織Caspase-3 陽性細(xì)胞數(shù)在建模6、12、24 h 逐漸升高，于建模24 h 至高峰，并于建模48、72 h 逐漸降低；QU 組各時(shí)點(diǎn)視網(wǎng)膜組織Caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)變化趨勢與RIRI組、陰性對照組相同，但均低于同時(shí)點(diǎn)RIRI 組、陰性對照組（P均＜0.05）。見表3。

表3 建模后不同時(shí)點(diǎn)各組視網(wǎng)膜組織Caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)比較（個(gè)/毫米2，-x ± s）

3 討論

RIRI 是青光眼、糖尿病性視網(wǎng)膜病變及缺血性視神經(jīng)病變等相關(guān)眼部疾病的共同病理基礎(chǔ)，可導(dǎo)致視力不同程度的下降甚至致盲。RIRI 發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制復(fù)雜，研究顯示氧自由基損害、鈣超載、炎癥反應(yīng)、基因調(diào)控變化等多種因素介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是其主要病理機(jī)制［11］?，F(xiàn)階段，臨床上對于RIRI的治療方法較少，因此尋找有效的防治方案具有重要意義。

細(xì)胞凋亡是一個(gè)程序化的細(xì)胞自我破壞過程，需要蛋白質(zhì)合成及特定的細(xì)胞信號(hào)參與，特別是Caspases 信號(hào)級(jí)聯(lián)［12］。在缺血時(shí)，線粒體的通透性轉(zhuǎn)換孔開放，細(xì)胞色素C從線粒體中釋放出來，與凋亡蛋白激活因子1、Caspase-9 前體及ATP 組合形成凋亡復(fù)合物，該復(fù)合物激活Caspase-9 前體，造成Caspase-9 活化，活化的Caspase-9 使下游Caspase-3、Caspase-7 在dATP 存在下裂解，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［13］。Caspase 的激活是細(xì)胞凋亡早期和晚期最好的生化標(biāo)志，與Caspases 家族的其他成員比較，Caspase-3位于Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)的末端，是一種凋亡執(zhí)行蛋白酶［14］，被認(rèn)為是凋亡的關(guān)鍵蛋白。檢測細(xì)胞和組織中活性Caspase-3 是觀察凋亡信號(hào)誘導(dǎo)凋亡的重要方法，因此，我們將Caspase-3 作為本次研究的測量指標(biāo)［15］。

QU 是黃酮類化合物，具有抗凋亡作用，在多種植物中以糖苷的形式大量存在［5］。既往研究表明，QU 具有抗凋亡及細(xì)胞保護(hù)作用。WANG 等［16］研究發(fā)現(xiàn)，在心肌缺血再灌注損傷中，QU 可以通過降低Caspase-3 活性發(fā)揮抗凋亡作用。而在蛛網(wǎng)膜下腔出血大鼠腦缺血再灌注損傷的研究中發(fā)現(xiàn)，早期給予QU 處理可抑制大鼠腦組織Caspase-3 活性，使腦水腫得到改善［17］。此外，ZHOU 等［18］采用鞏膜上靜脈電凝法制備慢性青光眼大鼠模型，發(fā)現(xiàn)QU 可逆轉(zhuǎn)慢性青光眼所致的光性陰性反應(yīng)下降，并可通過增加對視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的抑制性神經(jīng)傳遞、減少興奮性神經(jīng)傳遞減輕視網(wǎng)膜細(xì)胞損傷。在純化的原代大鼠神經(jīng)節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)物及人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞培養(yǎng)物中發(fā)現(xiàn)，QU對凋亡和壞死途徑中的Caspase-3活性有抑制作用［19-20］，抑制Caspase-3 活化是減輕缺血再灌注后細(xì)胞凋亡的有效途徑。由上可見，QU可以在心腦組織缺血再灌注損傷中起到改善作用，本研究進(jìn)一步探討QU 預(yù)處理是否對RIRI 具有改善作用。

本研究結(jié)果顯示，RIRI 早期大鼠視網(wǎng)膜高度水腫，視網(wǎng)膜內(nèi)層厚度增加，RIRI 晚期視網(wǎng)膜細(xì)胞數(shù)量減少且視網(wǎng)膜萎縮變薄，視網(wǎng)膜水腫及組織損傷主要集中在內(nèi)層視網(wǎng)膜，外層視網(wǎng)膜受損較輕；陰性對照組各時(shí)點(diǎn)的視網(wǎng)膜組織病理改變與RIRI 組相似，提示陰性對照溶劑DMSO 對RIRI 影響不大；而經(jīng)QU 干預(yù)的大鼠在再灌注后6、12 h 這兩個(gè)時(shí)點(diǎn)視網(wǎng)膜細(xì)胞水腫程度輕于RIRI 組，在24、48、72 h 視網(wǎng)膜萎縮變薄程度輕于RIRI 組，提示QU 可以改善缺血再灌注后的視網(wǎng)膜細(xì)胞形態(tài)，尤其是可以減輕由于視網(wǎng)膜內(nèi)層受損而引起的視網(wǎng)膜萎縮，對保護(hù)視網(wǎng)膜細(xì)胞及維持視網(wǎng)膜厚度有一定的作用。RIRI組大鼠視網(wǎng)膜缺血再灌注后6 h 有少量凋亡細(xì)胞和Caspase-3陽性細(xì)胞表達(dá)，12 h較前凋亡增多，24 h到達(dá)峰值，隨后凋亡細(xì)胞數(shù)逐漸下降，這與相關(guān)文獻(xiàn)［21-22］報(bào)道結(jié)果吻合。QU 組在RIRI 模型建立后各個(gè)時(shí)點(diǎn)凋亡細(xì)胞數(shù)及Caspase-3 陽性細(xì)胞均少于RIRI 組，提示視網(wǎng)膜細(xì)胞缺血后可能是通過激活Caspase-3 蛋白從而啟動(dòng)細(xì)胞凋亡，而QU 可以通過下調(diào)Caspase-3 陽性表達(dá)以減少RIRI 引起的細(xì)胞凋亡。

綜上所述，我們初步認(rèn)為QU 對于RIRI 具有一定的抑制作用，其機(jī)制可能與下調(diào)Caspase-3表達(dá)抑制細(xì)胞凋亡有關(guān)，這為擴(kuò)展QU 在RIRI 的臨床應(yīng)用提供了新思路。本研究的不足之處是未進(jìn)行QU 預(yù)處理后視網(wǎng)膜電生理實(shí)驗(yàn)，另外本研究只探討了QU通過減少細(xì)胞凋亡改善RIRI的機(jī)制，對于RIRI的其他機(jī)制還需進(jìn)一步研究。