4個品種草莓莖尖組培快繁體系的構建

王曉芳,宗曉娟,常元勝,姜莉莉,田中 一久,武沖*

(1.山東省果樹研究所,山東泰安 271000;2.徂汶景區(qū)化馬灣鄉(xiāng)政府,山東泰安 271042)

草莓種苗質量是影響草莓產業(yè)化發(fā)展的關鍵因素之一[1]。傳統(tǒng)自繁自育的育苗方式導致草莓種苗種性退化、繁殖系數(shù)降低、易感病、產量降低等問題,且因連作和長期營養(yǎng)繁殖導致植株體內積累各種病毒,生長速度慢,抗逆、抗病蟲害能力減弱,果實產量和品質嚴重下降[2]。植物組培快繁技術具有不受季節(jié)限制、培養(yǎng)周期短、易于規(guī)模化生產等優(yōu)點,尤其在解決植物脫毒方面具有顯著的優(yōu)勢。采用組培快繁技術培育的草莓種苗具有長勢強、產量高等優(yōu)點[3]。

紅顏、章姬、香野和粉玉是當前生產上的主栽的草莓品種或是發(fā)展前景比較好的品種,產量高、品質好、抗逆、抗病蟲害能力強。雖然有關草莓莖尖組培的研究比較多,但關于篩選這4個品種最佳快繁條件的報道相對較少,因此,本研究以前期篩選比較適宜草莓莖尖生長的培養(yǎng)基為基礎,研究4個品種草莓在培養(yǎng)基上的生長表現(xiàn)及馴化移栽表現(xiàn),確定最佳的組織培養(yǎng)和移栽基質,以期為草莓組培快繁生產提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料來源

供試草莓品種為紅顏、章姬、香野、粉玉,匍匐莖莖尖取自山東省果樹研究所金牛山試驗基地草莓大棚。露地栽培可于5～6月進行取材,7月雨季之后取材接種時易被污染。設施栽培有匍匐莖時都可取材。

剪取選擇生長健壯無病蟲害侵染的草莓匍匐莖,長度保留8～10 cm左右,采后用濕報紙包裹,裝入封口袋中,標記好品種,放入帶冰袋的盒子中,及時帶回試驗室,如不能及時接種,將濕報紙包裹的匍匐莖置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?不超過2 d。

1.2 培養(yǎng)基配制

前期篩選的培養(yǎng)基配方為MS+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA,pH值5.6±0.05,每升培養(yǎng)基添加25 g蔗糖和6 g瓊脂,121 ℃滅菌30 min,配方根據(jù)前人試驗結果適當調整[4]。此培養(yǎng)基用做初代培養(yǎng)基和繼代增殖培養(yǎng)基,初代培養(yǎng)使用培養(yǎng)皿(直徑9 cm),每皿倒入20 mL左右培養(yǎng)基;繼代培養(yǎng)使用帶蓋玻璃組培瓶(高9.5 cm、直徑6.6 cm),每皿倒入50 mL左右培養(yǎng)基。在試驗過程中發(fā)現(xiàn)紅顏和粉玉在此培養(yǎng)基上誘導培養(yǎng)時易發(fā)生玻璃化,對6-BA的濃度進行調整,初代培養(yǎng)基為MS+0.3 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA,繼代增殖培養(yǎng)基為MS+0.2 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA,pH值5.6±0.05,每升培養(yǎng)基添加25 g蔗糖和6 g瓊脂。

生根培養(yǎng)基配方為1/2 MS培養(yǎng)基,不添加植物生長調節(jié)劑,pH值5.6,每升培養(yǎng)基添加25 g蔗糖和6 g瓊脂,參考前人方法略有調整[5]。

1.3 外植體消毒處理

所取匍匐莖保留莖尖剪成長約3 cm的小段(圖1),先用洗潔精輕輕搓洗30 s,再用流動的自來水持續(xù)沖洗30 min,之后在超凈工作臺中用75%的酒精消毒30 s,無菌水沖洗3次,再用1%次氯酸鈉浸泡滅菌7～10 min,無菌水沖洗5次[6]。經試驗證明這樣可以將污染率控制在2%以內,實際操作過程中清洗和消毒時間長短可視莖段幼嫩程度適當增減,但要掌握好消毒時間,時間太短滅菌效果不理想,接種后易造成大量污染;時間太長易接種后易發(fā)生褐化,影響接種成活率。

圖1 做外植體的草莓匍匐莖莖尖

1.4 莖尖培養(yǎng)

將滅菌后的莖段放在滅過菌的濾紙上,置于培養(yǎng)皿中,吸收多余水分。將消毒的莖段放到滅菌的培養(yǎng)皿上,一只手用鑷子固定莖段,另一只手使用消毒的解剖針先剝去外面較大的幼葉,在電子顯微鏡下將幼嫩的幼葉逐層剝去,直至露出半圓球形頂端分生組織,切取0.3～0.4 mm大小莖尖接種于初代培養(yǎng)基上進行培養(yǎng),每皿接種8～10個莖尖,5個培養(yǎng)皿為1組,重復3次。接后密封,放置在組培架上培養(yǎng)。組培室保持溫度(25±2) ℃,濕度45%～50%,接種后先暗培養(yǎng)1～2 d,隨后在光照強度2 000～3 000 lx,光照時長12～16 h/d條件下培養(yǎng)。初代培養(yǎng)15 d后統(tǒng)計成活率,30 d后統(tǒng)計誘芽率。

1.5 增殖繼代培養(yǎng)

在培養(yǎng)皿上用消毒的解剖刀將莖尖誘導出的叢生不定芽分割成小的芽叢,轉接到繼代培養(yǎng)基上進行增殖培養(yǎng),3～5叢/瓶,計算增殖系數(shù)。5瓶為1組,重復3次。放置到組培架上光照下培養(yǎng),培養(yǎng)溫度、光照強度和光照周期等其他培養(yǎng)條件與初代培養(yǎng)相同,每隔25～30 d繼代1次。培養(yǎng)1個月左右,按需要生根或二次繼代。一般繼代次數(shù)不超過5次,否則幼苗生長弱化。

1.6 生根培養(yǎng)

挑選繼代培養(yǎng)的高度3～5 cm、長勢較好的組培苗在超凈工作臺中轉入生根培養(yǎng)基。放置到組培架上光照下培養(yǎng)(環(huán)境條件與1.4所述一樣) ,在培養(yǎng)室培養(yǎng)30 d左右,觀察各品種幼苗根部生長情況,計算生根率。

1.7 煉苗及移栽

組培苗在移栽前需要進行鍛煉,以適應外部環(huán)境。組培瓶空間小,遇較強的光照容易使其內部溫度快速升高,會導致草莓葉片發(fā)生灼燒枯干。因此要采取恰當?shù)臒捗绱胧?煉苗時逐漸打開培養(yǎng)瓶蓋,使幼苗逐步適應外部環(huán)境。

生根30 d后準備煉苗移栽,煉苗時先擰開瓶蓋但不打開,放置1 d,第2 d天半敞開瓶蓋,放置2 d,第4 d全部打開瓶蓋煉苗2 d,組培小苗莖稈由綠色變?yōu)槁詭Ъt色,栽植成活率高。移栽時(室內溫度23 ℃)將根系發(fā)達、生長健壯的生根苗從組培瓶中取出,清洗去除根部多余的培養(yǎng)基,將其栽入穴盤中,提前將蛭石填入草莓專用32孔育苗穴盤,穴盤下放置托盤,提前在托盤中澆水,使蛭石濕潤,利于組培苗成活。栽植后先扣帶孔的塑料蓋2 d,然后揭開適應5 d,期間保持基質濕潤,利于萌發(fā)新根。緩苗結束后統(tǒng)計移栽成活率。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

成活率(%)=接種成活的外植體數(shù)/接種的總外植體數(shù)× 100

誘芽率(%)=誘導出不定芽的外植體數(shù)/接種成活的總外植體數(shù)× 100

增殖系數(shù)=增殖的不定芽數(shù)/接種的不定芽總數(shù)

生根率(%)=生根苗數(shù)/接種苗數(shù)×100

移栽成活率(%)=移栽成活的植株數(shù)/移栽植株的總數(shù)×100

試驗所得數(shù)據(jù)采用Microsoft Office Excel 2010處理并制表; 運用SPSS 19.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。結果差異性顯著分析是通過單變量方差分析(ANOVO) 結合鄧肯檢驗在P<0. 05的顯著水平上實現(xiàn)。

2 結果與分析

2.1 誘導培養(yǎng)基對4個品種草莓莖尖培養(yǎng)的影響

生長30 d左右統(tǒng)計莖尖培養(yǎng)情況,從圖2可看出,在MS+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA培養(yǎng)基上,4個品種均能夠成活,成活率差異不明顯,章姬、香野成活率較高,分別為86.7%、87.5%,且長勢較旺,誘芽率分別為84.9%、79.9%,不定芽生長較健壯。紅顏、粉玉成活率分別為80.8%、80.0%,誘芽率分別為76.3%、72.8%,誘導形成的不定芽多,但生長較弱,出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象。

圖2 同一培養(yǎng)基對4個品種草莓莖尖誘導成活率及誘芽率的影響

2.2 增殖培養(yǎng)基對4個品種草莓幼苗增殖的影響

由表1可看出,4個品種在與接種培養(yǎng)基配方一樣的培養(yǎng)基上(MS+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA)增殖表現(xiàn)差異較大。紅顏和粉玉莖尖增殖系數(shù)高,平均分別為6.7和6.9,與章姬和香野差異明顯。但其株高較矮,生長弱,顯著低于章姬和香野?？傮w生長情況看,此培養(yǎng)基更適合章姬和香野,增殖系數(shù)分別為5.4、4.6,且組培幼苗株高在5 cm左右,生長健壯。

2.3 紅顏和粉玉在新培養(yǎng)基上的生長表現(xiàn)

在MS+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA培養(yǎng)基上,紅顏和粉玉兩個品種表現(xiàn)不定芽產生較多,但生長弱,出現(xiàn)玻璃化,更換培養(yǎng)基后,在誘導培養(yǎng)基上MS+0.3 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA表現(xiàn)不定芽分化正常,生長健壯,無玻璃化發(fā)生(表2)。在繼代增殖培養(yǎng)基上MS+0.2 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA二者的增殖系數(shù)分別為5.2、4.6,株高在5 cm以上,生長健壯。

2.4 生根培養(yǎng)基對4個品種草莓幼苗生根的影響

在繼代培養(yǎng)基上培養(yǎng)30 d左右進行生根培養(yǎng)。在不添加植物生長調節(jié)劑的1/2 MS培養(yǎng)基上培養(yǎng),培養(yǎng)條件與增殖培養(yǎng)時相同,生根30 d左右,觀察各品種生根情況。從表3可看出,此培養(yǎng)基對4個品種草莓組培苗的根系誘導效果都比較好,生根率均在83%以上,以章姬生根率最高,為90.83%(圖3)。平均生根條數(shù)為4～6條,根長在9～13 cm左右,且根系生長健壯,各品種間無明顯差異。

表3 同一培養(yǎng)基對4個品種草莓組培苗生根的影響

圖3 章姬草莓生根1個月后的根系生長情況

2.5 4個品種草莓幼苗煉苗移栽效果

從圖4可看出,采用蛭石作為基質進行移栽,4個品種草莓移栽成活率均在95%以上,章姬的成活率最高,為98.6%;紅顏最低,為95.5%。

圖4 4個品種草莓的移栽成活率

3 小結與討論

本研究結果表明,在同一莖尖誘導培養(yǎng)基中,4個品種草莓的莖尖成活情況差異較大,MS+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA培養(yǎng)基適合章姬、香野,紅顏、粉玉莖形成不定芽化較多,但生長較弱,有玻璃化情況發(fā)生,二者在MS+0.3 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA培養(yǎng)基上更為適宜,不定芽生長正常,無玻璃化,說明不同草莓品種莖尖對植物生長調節(jié)劑的需求稍有差異。李志強等研究發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基MS+0.5 mg/L 6-BA+0.02 mg/L NAA 適宜紅顏、章姬草莓莖尖生長[7]。韓如春等研究發(fā)現(xiàn)僅添加6-BA情況下,莖尖也可以萌發(fā),但誘芽率低,當6-BA質量濃度為0.3 mg/L時,紅顏品種的誘芽率較高,隋珠品種則是在6-BA質量濃度為0.5 mg/L時誘芽率最高[4],與本研究結果一致。本研究中章姬和香野適宜的增殖培養(yǎng)基為MS+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA,這與張玲等[8]的研究結果一樣。紅顏和粉玉適宜的增殖培養(yǎng)基為MS+0.2 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA。說明不同品種草莓增殖所需的植物生長調劑有差異。

本研究中4個品種草莓采用1/2 MS培養(yǎng)基均較易生根,與前人研究結果一致,張建盈等[9]研究發(fā)現(xiàn),不添加IBA的1/2 MS是白雪公主草莓最適宜的生根培養(yǎng)基,生根率達100%,平均生根數(shù)為10條,平均根長為5.00 cm。顏昌敬[10]表示草莓試管苗比較容易生根,在無植物生長調節(jié)劑的培養(yǎng)基上就能長出大量根系,添加0.1 mg/L NAA后發(fā)根量反而減少。這說明在組培苗生根階段培養(yǎng)基中過多的基本元素和生長調節(jié)劑可能會影響根部的正常生長。采用蛭石進行移栽,4個品種草莓組培苗的成活率均在95%以上,無污染情況發(fā)生,生長健壯,是適宜草莓組培苗移栽馴化的良好基質。

本研究中對培養(yǎng)基配方進行了調整,蔗糖和瓊脂加入量減少,能夠保證組培苗正常生長的同時,降低組培快繁的成本,同時在保證正常生長的情況下添加植物生長調節(jié)劑的濃度盡量降低,降低成本及遺傳變異的風險。有研究表明,當6-BA的濃度為0.2～0.5 mg/L時有利于草莓的不定芽增殖[11,12],濃度過高會導致植株玻璃化和畸形生長[13,14],大于1.0 mg/L時容易引起植株的表型和遺傳變異[15],給草莓生產帶來風險。因此,下一步要對草莓莖尖快繁組培苗的遺傳變異及病毒檢測進行深入研究。