枯草芽孢桿菌Ya-1對(duì)辣椒枯萎病的防治及其對(duì)根際真菌群落的影響

趙志祥 王殿東 周亞林 王培 嚴(yán)婉榮 嚴(yán)蓓 羅路云 張卓

（1.海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與標(biāo)準(zhǔn)研究中心，海南省植物病蟲(chóng)害防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海口 571100；2.長(zhǎng)江師范學(xué)院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生物工程學(xué)院，重慶 408100；3.麻陽(yáng)縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局植保植檢站，懷化 419400；4.湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，園藝作物病蟲(chóng)害治理湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)沙 410125；5.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，長(zhǎng)沙 410128）

辣椒（Capsicum annuum L.）是一種重要的蔬菜，在中國(guó)種植面積超過(guò)130萬(wàn)hm2。辣椒枯萎病是由尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）侵染引起，在許多國(guó)家均有發(fā)生［1-3］，在我國(guó)陜西、甘肅、湖南等地相繼發(fā)生，發(fā)病率一般為15%-30%，嚴(yán)重時(shí)50%以上，甚至絕產(chǎn)［4］。化學(xué)防治是目前使用最多、最有效、最易讓人接受的防治方法。但是長(zhǎng)期大量使用單一化學(xué)藥劑，易誘導(dǎo)病菌產(chǎn)生抗藥性，并且對(duì)土壤生物群落造成較大的影響，導(dǎo)致土壤肥力下降［5-6］。因此減少或取代化學(xué)藥劑在防治辣椒枯萎病中的應(yīng)用，在降低健康危害、環(huán)境破壞和污染等方面顯得尤為迫切。根際是土壤、植物和微生物三者相互作用的生態(tài)環(huán)境［7］，而根際微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)中最為活躍的組成部分，在植物生長(zhǎng)過(guò)程中起著重要作用，能把土壤中的有機(jī)物和一些難分解的物質(zhì)分解轉(zhuǎn)化，為植物生長(zhǎng)提供肥沃的土壤［8］。通過(guò)調(diào)控根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)抑制土壤病原菌，將逐步取代傳統(tǒng)的化學(xué)防治手段，具有較為廣闊的應(yīng)用前景。

利用生防細(xì)菌、真菌及放線(xiàn)菌等拮抗微生物的寄生、抗生作用，及其與病原菌的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、生態(tài)位的競(jìng)爭(zhēng)效應(yīng)，抑制和消滅病原菌是防治辣椒枯萎病的有效措施之一。芽孢桿菌已被證明對(duì)尖孢鐮刀菌具有較強(qiáng)的拮抗作用，是重要的辣椒枯萎病生防細(xì)菌。本研究中拮抗細(xì)菌Ya-1，經(jīng)鑒定為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），來(lái)源于海南五指山熱帶雨林土壤，對(duì)辣椒枯萎病菌具有較好的抑制效果。Xu等［9］發(fā)現(xiàn)解淀粉芽孢桿菌SQR9分泌的脂肽類(lèi)化合物芽孢菌霉素D對(duì)尖孢鐮刀菌等土傳病原生物具有較強(qiáng)的抑制活性。吳月等［10］報(bào)道芽孢桿菌或假單胞桿菌等對(duì)辣椒枯萎病菌有較好的抑制作用。郭珺等［11］報(bào)道芽孢桿菌pb-4能明顯抑制辣椒枯萎病菌孢子的萌發(fā)。Jamal等［12］研究發(fā)現(xiàn)施用B.amylliquefaciens Y1可以提高辣椒葉片的葉綠素含量，同時(shí)顯著提高土壤全氮、可培養(yǎng)細(xì)菌和產(chǎn)幾丁質(zhì)酶細(xì)菌的數(shù)量以及幾丁質(zhì)酶和脫氫酶的活性。Cao等［13］分離出高拮抗活性的芽孢桿菌菌株2株，B.velezensis Y6和F7，其對(duì)辣椒枯萎病菌和茄科青枯病菌在室內(nèi)和盆栽條件下均有較好的抑菌活性，其活性物質(zhì)Iturin對(duì)辣椒枯萎病菌具有持續(xù)的抑菌效果。Chowdhury等［14］發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌LBF-01對(duì)辣椒尖孢鐮刀枯萎病菌有較好地抑菌活性，同時(shí)促進(jìn)辣椒生長(zhǎng)，田間實(shí)驗(yàn)?zāi)芙档?.04倍的枯萎病發(fā)生率，減少50%的多菌靈使用，并能增加種子的萌發(fā)率。Ben等［15］研究發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌V26能溶解無(wú)機(jī)磷酸鹽、固氮，產(chǎn)生吲哚乙酸、鐵載體和水解酶，并對(duì)尖孢鐮刀菌具有較好的抑菌活性。

根據(jù)生態(tài)學(xué)原理，通過(guò)對(duì)辣椒根區(qū)土壤接種外來(lái)菌，調(diào)節(jié)植株根區(qū)的微生物群落結(jié)構(gòu)，有可能從根本上控制辣椒枯萎病。枯草芽孢桿菌Ya-1作為辣椒枯萎病的生防微生物，其對(duì)罹病枯萎病辣椒根際土壤真菌群落的影響仍然未知。本研究以枯草芽孢桿菌Ya-1為材料，采用高通量測(cè)序技術(shù)重點(diǎn)研究接種生防菌對(duì)罹病辣椒根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)、關(guān)鍵種群的影響及動(dòng)態(tài)變化，從微生物角度為芽孢桿菌調(diào)控微生態(tài)環(huán)境來(lái)抑制辣椒枯萎病的新途徑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)地點(diǎn)位于海南省農(nóng)科院植物保護(hù)研究所，試驗(yàn)辣椒品種為‘乾隆一號(hào)’。供試病原菌為辣椒枯萎病菌鐮刀尖孢菌（Fusarium oxysporum f.sp.capsici），供試生防菌為枯草芽孢桿菌Ya-1（B.subtilis），來(lái)源于海南五指山熱帶雨林土壤，其具有廣譜抗性，對(duì)辣椒枯萎病菌有較好的抑制效果。

1.2 方法

1.2.1 樣地概況和根際土壤采集 試驗(yàn)土壤采集自健康辣椒土壤，首先將采集的土壤經(jīng)過(guò)80目過(guò)篩后，再與營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)8∶1比例混勻后裝盆。使用1%次氯酸鈉溶液對(duì)‘乾隆一號(hào)’感病辣椒種子表面消毒，無(wú)菌水沖洗3遍，將種子放置在帶有無(wú)菌濾紙的120 mm玻璃培養(yǎng)皿，加入無(wú)菌水使種子沒(méi)過(guò)濾紙片，保濕催芽5 d，待80%以上的種子露白后，播種到事先準(zhǔn)備好的盆中，每盆3顆。待辣椒苗長(zhǎng)出2片真葉時(shí)，使用1 000倍液的腐殖酸澆灌，4-5 d/次，每次30 mL/盆，連續(xù)澆灌3次。保證辣椒苗長(zhǎng)勢(shì)均勻、茁壯。待苗長(zhǎng)到6葉1芯時(shí)開(kāi)始處理。

試驗(yàn)共設(shè)置4個(gè)處理，A: 100 mL無(wú)菌水浸根10 min后澆灌；B: 100 mL枯草芽孢桿菌Ya-1發(fā)酵液（1×107CFU/mL）浸根10 min后澆灌；C: 100 mL辣椒枯萎病菌（F.oxysporum）孢子懸浮液（1×107CFU/mL）浸根10 min后澆灌；D:先接種100 mL枯草芽孢桿菌Ya-1發(fā)酵液，24 h后接種100 mL F.oxysporum孢子懸浮液。分別于接種前、接種后10 d、接種后20 d采集土壤樣本，接種前因各盆處理均一致，因而隨機(jī)取5份樣本，每個(gè)處理設(shè)置5個(gè)重復(fù)。采集辣椒根放入裝有100 mL 0.05 mol/L磷酸緩沖液的250 mL錐形瓶中，晃動(dòng)錐形瓶充分清洗辣椒根系，13 000 r/min對(duì)洗脫液進(jìn)行離心，高速離心3 min。離心后棄上清，對(duì)沉淀土壤多次重復(fù)離心洗滌后，將土壤樣品收集至離心管，冷凍干燥［16］。冷凍干燥后將根際土壤放入-80℃冷凍箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 土壤總DNA提取、PCR擴(kuò)增和測(cè)序 每個(gè)土壤樣品稱(chēng)取0.5 g土樣，用FastDNA? Spin Kit for Soil試劑盒提取土壤總DNA。提取的土壤DNA用NanoDrop 2000測(cè)定總DNA濃度和純度。A260/A280值在1.8-2.0之間為合格。將合格樣品DNA進(jìn)行擴(kuò)增前基因組DNA濃度定量。定量后終濃度稀釋為30 ng/μL。以樣品DNA為模板，真菌DNA擴(kuò)增ITS2區(qū)引物序列：ITS3-2024F：GCATCGATGAAGAACGCAGC；ITS4-2409R：TCCTCCGCTTATTGATATGC［17］。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行2% 瓊脂糖電泳，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用Qubit4.0熒光計(jì)進(jìn)行定量，然后將產(chǎn)物送至武漢天一華煜公司HiSeq平臺(tái)進(jìn)行PE250測(cè)序。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理 原始下機(jī)數(shù)據(jù)的上游分析主要采用Mothur和usearch完成。其流程主要如下：對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行嚴(yán)格質(zhì)控，將小于200 bp的序列進(jìn)行去除，剔除模糊堿基序列“N”和序列平均質(zhì)量Q值＜20的低質(zhì)量序列，最終獲得effective tags。利用 Mothur軟件包對(duì) tag 序列進(jìn)行了去冗余處理，小于200 bp的序列被丟棄，從中挑選出 unique tag 序列。用 Uparse 軟件對(duì)所有樣品的全部 Effective Tags 序列聚類(lèi)，默認(rèn)提供以97%的一致性將序列聚類(lèi)成為OTUs（Operational Taxonomic Units）［18］。使用RDP-Classifier軟件注釋時(shí)，采用Fungal ITS（unite database 7.2 version）數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)真菌OTU代表序列進(jìn)行序列注釋?zhuān)罱K得到OTU代表序列［19］。將OTU表抽平后獲得75 514條序列，計(jì)算α多樣性指數(shù)。使用R軟件中的Vegan包計(jì)算樣本間Bray-Cutis距離矩陣。采用主坐標(biāo)分析方法分析不同處理下各樣本微生物群落結(jié)構(gòu)差異。同時(shí)，使用R軟件中的Vegan包進(jìn)行非參數(shù)多反應(yīng)置換法、相似性分析和非參數(shù)多變量置換法方差分析來(lái)鑒定兩組間的群落差異［20-21］，對(duì)微生物種群進(jìn)行相關(guān)性分析。

1.2.4 土壤微生物共發(fā)生模式分析 使用抽平的OTU表，取相對(duì)豐度排名前500的OTU進(jìn)行土壤真菌微生物共發(fā)生網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建。利用分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)分析（MENA，http://ieg4.rccc.ou.edu/mena/login.cgi），基于Spearman秩相關(guān)矩陣構(gòu)建了真菌4個(gè)類(lèi)群的系統(tǒng)發(fā)育分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)（pMENs），只保留高于特定閾值（真菌：0.82）的相關(guān)性來(lái)計(jì)算網(wǎng)絡(luò)特征值［22-24］。最后采用Gephi（https://gephi.org/）軟件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)的可視化操作，得到network網(wǎng)絡(luò)圖，并在Gephi軟件里面進(jìn)行模塊化分析。

1.2.5 辣椒枯萎病發(fā)病率和防治效果 按照參考文獻(xiàn)［25］發(fā)病情況，并計(jì)算辣椒枯萎病發(fā)病率以及相對(duì)防效。統(tǒng)計(jì)方法如下：

2 結(jié)果

2.1 拮抗枯草芽孢桿菌Ya-1對(duì)辣椒枯萎病發(fā)病率和病害指數(shù)的影響

辣椒枯萎病的發(fā)病率和病害指數(shù)結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果表明，單獨(dú)接種病原菌FOC處理（C）第10天和第20天的發(fā)病率分別為32.08%和45.83%，而接種Ya-1+FOC處理（D）的發(fā)病率分別為7.08%和10.42%。接種Ya-1+FOC處理（D）與單獨(dú)接種病原菌FOC處理（C）在第10天和第20天的發(fā)病率差異極顯著（P＜ 0.01，表1），前者比后者發(fā)病率分別降低了25%和35.41%。另CK處理（A）和單獨(dú)接種Ya-1處理（B）在第10和第20天時(shí)未見(jiàn)發(fā)病植株，僅有少量自然枯死植株（莖基部不變褐色），因而不做防治效果統(tǒng)計(jì)。與單獨(dú)接種病原菌FOC處理（C）相比，接種Ya-1+FOC處理（D）在第10和第20天的相對(duì)防治效果分別為77.93%和77.26%。

表1 拮抗菌Ya-1在不同時(shí)間點(diǎn)辣椒枯萎病發(fā)病率和防治效果Table 1 Incidence rate and control effect of pepper Fusarium wilt with antagonist Ya-1 at different time points

2.2 根際真菌群落α多樣性

測(cè)序共獲得4 639 049條OTU，每個(gè)樣品OTU數(shù)在75 514和149 265之間。經(jīng)過(guò)抽平后所有OTU條數(shù)為75 514。對(duì)不同處理組和對(duì)照組在不同時(shí)間點(diǎn)的辣椒根際真菌群落進(jìn)行α多樣性分析，結(jié)果如表2。辣椒根際土壤真菌群落的α多樣性指數(shù)（Shannon指數(shù)）和豐富度指數(shù)（Chao1）呈不同的變化趨勢(shì)（表2）。接種枯草芽孢桿菌Ya-1組（B）和對(duì)照（A）真菌shannon指數(shù)均先升高后降低，接種辣椒枯萎病菌（C）組先降低后升高，同時(shí)接種枯草芽孢桿菌Ya-1和辣椒枯萎病菌組（D）真菌Shannon指數(shù)逐漸降低。10 d時(shí)接種辣椒枯萎病菌組Shannon指數(shù)顯著低于對(duì)照，接種枯草芽孢桿菌Ya-1組、同時(shí)接種枯草芽孢桿菌Ya-1和辣椒枯萎病菌組與對(duì)照無(wú)顯著差異，同時(shí)接種枯草芽孢桿菌Ya-1和辣椒枯萎病菌組Shannon指數(shù)顯著高于接種辣椒枯萎病菌組；20 d時(shí)接種枯草芽孢桿菌Ya-1組、接種辣椒枯萎病菌、同時(shí)接種枯草芽孢桿菌Ya-1和辣椒枯萎病菌組Shannon指數(shù)均與對(duì)照無(wú)顯著差異，同時(shí)接種枯草芽孢桿菌Ya-1和辣椒枯萎病菌組與接種辣椒枯萎病菌組Shannon指數(shù)之間也無(wú)顯著差異。

忽然，十六師第四十六團(tuán)團(tuán)長(zhǎng)謝士炎電話(huà)報(bào)告，守西門(mén)的連長(zhǎng)報(bào)告，信安江上游浮來(lái)一個(gè)老百姓，說(shuō)有事要見(jiàn)師長(zhǎng)。

表2 辣椒根際真菌α多樣性指數(shù)Table 2 Fungal α diversity indices around pepper rhizosphere soil

接種枯草芽孢桿菌Ya-1組（B）和對(duì)照（A）真菌Chao1值均先升高后降低，接種辣椒枯萎病菌（C）組以及同時(shí)接種枯草芽孢桿菌Ya-1和辣椒枯萎病菌組（D）真菌Chao1值均逐漸升高。10 d時(shí)接種枯草芽孢桿菌Ya-1組、接種辣椒枯萎病菌、同時(shí)接種枯草芽孢桿菌Ya-1和辣椒枯萎病菌組Chao1值均與對(duì)照無(wú)顯著差異，同時(shí)接種枯草芽孢桿菌Ya-1和辣椒枯萎病菌組與接種辣椒枯萎病菌組Chao1值之間也無(wú)顯著差異；20 d時(shí)接種枯草芽孢桿菌Ya-1組Chao1值均與對(duì)照無(wú)顯著差異，接種辣椒枯萎病菌、同時(shí)接種枯草芽孢桿菌Ya-1和辣椒枯萎病菌組Chao1值顯著高于對(duì)照，同時(shí)接種枯草芽孢桿菌Ya-1和辣椒枯萎病菌組Chao1值顯著高于接種辣椒枯萎病菌組。

2.3 枯草芽孢桿菌Ya-1對(duì)辣椒根際真菌群落組成的影響

在門(mén)分類(lèi)水平上，子囊菌門(mén)（Ascomycota）、捕蟲(chóng)霉門(mén)（Zoopagomycota）和擔(dān)子菌門(mén)（Basidiomycota）在每個(gè)接種時(shí)間點(diǎn)處理組和對(duì)照組土壤樣品中均占據(jù)真菌群落的優(yōu)勢(shì)地位，其相對(duì)豐度在36.58%-74.11%，如圖1。其中子囊菌門(mén)（Ascomycota）在所有處理中均屬于優(yōu)勢(shì)菌群（相對(duì)豐度＞4%）。在第10天時(shí)，子囊菌門(mén)（Ascomycota）在對(duì)照組土壤樣品中的相對(duì)豐度最低，在接種辣椒枯萎病菌組土壤樣品中相對(duì)豐度最高（28.79%，66.53%）；20 d時(shí)，子囊菌門(mén)（Ascomycota）在接種枯草芽孢桿菌Ya-1組土壤樣品中的相對(duì)豐度最低，同時(shí)接種枯草芽孢桿菌Ya-1和病原菌處理土壤樣品中相對(duì)豐度最高（26.03%，60.39%）。在10 d時(shí)，捕蟲(chóng)霉門(mén)（Zoopagomycota）在接種辣椒枯萎病菌組土壤樣品中相對(duì)豐度最低，接種枯草芽孢桿菌Ya-1組處理土壤樣品中相對(duì)豐度最高（3.71%，10.09%）；20 d時(shí)，捕蟲(chóng)霉門(mén)（Zoopagomycota）在同時(shí)接種枯草芽孢桿菌Ya-1和病原菌組相對(duì)豐度最低，對(duì)照組土壤樣品中的相對(duì)豐度最高（2.40%，10.70%）。在10 d時(shí)，擔(dān)子菌門(mén)（Basidiomycota）在接種病原菌處理土壤樣品中相對(duì)豐度最低，同時(shí)接種枯草芽孢桿菌Ya-1和病原菌組土壤樣品中相對(duì)豐度最高（2.98%，4.31%）；20 d時(shí)，擔(dān)子菌門(mén)（Basidiomycota）在接種辣椒枯萎病菌組土壤樣品中相對(duì)豐度最低，接種枯草芽孢桿菌Ya-1處理土壤樣品中相對(duì)豐度最高（5.09%，6.20%）。

圖1 門(mén)分類(lèi)水平上辣椒根際土壤真菌優(yōu)勢(shì)種群Fig.1 Dominant fungal population of pepper rhizosphere soil at phylum level

進(jìn)一步將接種后10 d和20 d的top10真菌屬進(jìn)行了組間差異分析，發(fā)現(xiàn)不同處理之間優(yōu)勢(shì)菌屬群落發(fā)生顯著變化（圖2）。在10 d時(shí)，與對(duì)照相比，接種枯草芽孢桿菌Ya-1處理土壤樣品中被孢霉菌（Mortierella）的相對(duì)豐度顯著升高（P＜0.05），Boothiomyces、周刺座霉屬（Volutella）的相對(duì)豐度顯著降低（P＜0.05）；接種辣椒枯萎病原菌處理土壤樣品中鐮刀霉（Fusarium）、木霉屬（Trichoderma）的相對(duì)豐度顯著升高（P＜0.05），Boothiomyces、周刺座霉屬（Volutella）的相對(duì)豐度顯著降低（P＜0.05）；其他組對(duì)比均無(wú)顯著差異。與接種辣椒枯萎病原菌處理相比，同時(shí)接種枯草芽孢桿菌Ya-1和病原菌處理土壤樣品中Fusarium的相對(duì)豐度顯著降低（P＜0.05），被孢霉菌（Mortierella）的相對(duì)豐度升高，但差異不顯著。在20 d時(shí)，與對(duì)照相比，接種枯草芽孢桿菌Ya-1處理土壤樣品中top10屬在兩者之間無(wú)顯著差異；接種辣椒枯萎病原菌處理土壤樣品中鐮刀菌屬（Fusarium）、木霉菌屬（Trichoderma）的相對(duì)豐度顯著升高（P＜0.05）；其他組對(duì)比均無(wú)顯著差異。與接種辣椒枯萎病原菌處理相比，同時(shí)接種枯草芽孢桿菌Ya-1和病原菌處理土壤樣品中的被孢霉菌（Mortierella）的相對(duì)豐度顯著升高（P＜0.05）。

圖2 辣椒接種10 d和20 d相對(duì)豐度最高的10個(gè)真菌屬Fig.2 Top 10 fungi genera with the highest relative abundance at 10 d and 20 d

對(duì)篩選的相對(duì)豐度為1%以上的OTU進(jìn)行鑒定分析，OTU_1經(jīng)過(guò)NCBI鑒定為病原菌F.oxysporum，其序列與接種病原菌序列相似度在97%以上，在不同處理相對(duì)豐度如圖3。在10 d和20 d同時(shí)接種枯草芽孢桿菌Ya-1和病原菌處理土壤樣品中OTU_1相對(duì)豐度顯著高于接種辣椒枯萎病原菌處理（P ＜ 0.05）；同時(shí)接種枯草芽孢桿菌Ya-1和病原菌處理土壤樣品在10 d時(shí)相對(duì)豐度顯著高于20 d。

圖3 OTU_1總相對(duì)豐度Fig. 3 Total relative abundance of OTU_1

2.4 辣椒根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)分析

利用基于 Bray_Curtis距離算法 PCoA 分析對(duì)辣椒根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果表明，接種不同時(shí)間點(diǎn)土壤真菌的群落結(jié)構(gòu)存在差異，PCoA1和PCoA2共解釋了29.7%的變異，其中第一軸和第二軸分別解釋了22.8%和6.9%的變異（圖4）?；?Bray_curtis 算法的相似性分析（ANOSIM）結(jié)果，0 d與10 d、20 d根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)間具有顯著差異（R=0.3198，P=0.001；R=0.2697，P=0.031），10 d和20 d之間差異不顯著（R=0.0281，P=0.143）（表3）?；贐ray_curtis 算法的非參數(shù)多元統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)（MRPP和PERMANOVA）與上述結(jié)果一致。

圖4 辣椒不同時(shí)期不同處理根際間真菌群落主坐標(biāo)分析Fig.4 PCoA analysis of fungal community in pepper rhizosphere at different time points under different treatments

表3 不同時(shí)期兩組間辣椒根際真菌群落相異性分析Table 3 Dissimilarity test of pepper rhizosphere soil fungal community between two groups at different time points

基于 Bray_curtis 算法的相似性分析（ANOSIM）可知，在10 d時(shí)，接種枯草芽孢桿菌Ya-1發(fā)酵液處理、接種辣椒枯萎病菌處理和同時(shí)接種枯草芽孢桿菌Ya-1發(fā)酵液和辣椒枯萎病菌處理與對(duì)照處理的根際真菌群落結(jié)構(gòu)差異顯著（R=0.432，P=0.011；R=1，P=0.009；R=0.996，P=0.015）；接種辣椒枯萎病菌處理和同時(shí)接種枯草芽孢桿菌Ya-1發(fā)酵液和辣椒枯萎病菌處理根際真菌群落結(jié)構(gòu)也具有顯著差異（R=1，P=0.006）。在20 d時(shí)，接種枯草芽孢桿菌Ya-1發(fā)酵液處理、接種辣椒枯萎病菌處理、同時(shí)接種枯草芽孢桿菌Ya-1發(fā)酵液與辣椒枯萎病菌處理與對(duì)照處理的根際真菌群落結(jié)構(gòu)差異顯著（R=0.256，P=0.029；R=0.528，P=0.01；R=0.684，P=0.01）。接種辣椒枯萎病菌處理和同時(shí)接種枯草芽孢桿菌Ya-1和辣椒枯萎病菌處理根際真菌群落結(jié)構(gòu)也具有顯著差異（R=0.604，P=0.007）。此外，基于Bray_curtis 算法的非參數(shù)多元統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)（MRPP和PERMANOVA）進(jìn)一步表明驗(yàn)證了上述處理之間的差異（表4）。

表4 不同時(shí)間點(diǎn)不同處理間辣椒根際真菌群落相異性分析Table 4 Dissimilarity analysis of pepper rhizosphere soil fungal community at different time points among different treatments

2.5 分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)分析

基于不同時(shí)期土壤樣品500個(gè)OTU進(jìn)行分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，采用快速模塊化優(yōu)化方法對(duì)模塊進(jìn)行識(shí)別，構(gòu)建的真菌群落系統(tǒng)發(fā)育分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)（pMENs）顯示了OTUs之間的相互作用（表5，圖5）。處理組和對(duì)照組的節(jié)點(diǎn)和連接數(shù)分別為：A（290，443）、B（292，416）、C（311，406）和D（309，346）。其中，對(duì)照組土壤樣品擁有最少的節(jié)點(diǎn)數(shù)和最多的連接數(shù)。4個(gè)處理的真菌網(wǎng)絡(luò)均以正相關(guān)關(guān)系為主（A：77.20%，B：60.10%，C：61.58%，D：54.05%），相比較對(duì)照，其他三組的正連接比例更低；相比較接種辣椒枯萎病菌處理，同時(shí)接種枯草芽孢桿菌Ya-1和辣椒枯萎病原菌處理的正連接比例更低。接種枯草芽孢桿菌Ya-1和接種辣椒枯萎病菌處理的平均度低于對(duì)照；同時(shí)接種枯草芽孢桿菌Ya-1和辣椒枯萎病原菌處理的平均度低于接種辣椒枯萎病菌處理。

表5 不同處理下真菌種群的經(jīng)驗(yàn)網(wǎng)絡(luò)和隨機(jī)網(wǎng)絡(luò)性質(zhì)Table 5 Empirical network and random network properties of fungal populations under different treatments

同時(shí)分析4個(gè)處理的經(jīng)驗(yàn)網(wǎng)絡(luò)，相比較對(duì)照，接種枯草芽孢桿菌Ya-1和接種辣椒枯萎病菌處理的平均路徑距離、平均聚類(lèi)系數(shù)和模塊化值更高；相比較接種辣椒枯萎病菌處理，同時(shí)接種枯草芽孢桿菌Ya-1和辣椒枯萎病原菌處理的平均聚類(lèi)系數(shù)更低，平均路徑距離和模塊化值更高（表5）。對(duì)隨機(jī)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，相比較對(duì)照，接種枯草芽孢桿菌Ya-1組和接種辣椒枯萎病菌處理的平均聚類(lèi)系數(shù)更低，平均路徑距離和模塊化值更高；相比較接種辣椒枯萎病菌處理，同時(shí)接種枯草芽孢桿菌Ya-1和辣椒枯萎病原菌處理的平均聚類(lèi)系數(shù)更低，平均路徑距離、模塊化值更高（表5）。

3 討論

辣椒枯萎病是由尖孢鐮刀菌侵染引起的一類(lèi)頑固性土傳病害，梁建根等［26］研究表明，生防菌株B-3枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis的發(fā)酵液及其濾液對(duì)辣椒枯萎病的盆栽與大田試驗(yàn)的防效分別為73.6%和64.8%，顯著優(yōu)于100 mg/L多菌靈，對(duì)辣椒枯萎病菌均表現(xiàn)出較好的抑制作用。郭珺等［11］發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌Pb-4菌株對(duì)辣椒、番茄、黃瓜枯萎病及辣椒疫霉病等具有較好的防效。本研究中與單獨(dú)接種辣椒枯萎病菌的處理（C）相比，復(fù)合接種的Ya-1+FOC處理（D）在10 d和20 d的防治效果分別為77.93%和77.26%（表1），表明枯草芽孢桿菌Ya-1 對(duì)辣椒枯萎病同樣具有較好的防治效果。其盆栽防效甚至高于梁建根等［26］對(duì)生防枯草芽孢桿菌B-3的報(bào)道。究其因可能與不同來(lái)源的菌株活性差異、對(duì)周?chē)锖头巧锃h(huán)境等的影響，尤其是土壤微生物組的影響有關(guān)。

土壤微生物組在調(diào)控植物生長(zhǎng)、抗逆、抗病等方面起重要作用，微生物組受植物種類(lèi)以及植物生長(zhǎng)狀態(tài)影響［27-28］。受到生物和非生物脅迫后，植物可通過(guò)調(diào)整根際微生物組而緩解脅迫所造成的危害［29］。本研究中，接種枯草芽孢桿菌Ya-1處理組和對(duì)照真菌香農(nóng)指數(shù)均先升高后降低，而接種辣椒枯萎病菌組先降低后升高，同時(shí)接種枯草芽孢桿菌Ya-1和辣椒枯萎病菌組真菌香農(nóng)指數(shù)均逐漸降低，同時(shí)接種枯草芽孢桿菌Ya-1和辣椒枯萎病菌組真菌α多樣性在10 d和20 d時(shí)真菌香農(nóng)指數(shù)均高于接種辣椒枯萎病菌組，該結(jié)果表明單獨(dú)接種枯草芽孢桿菌Ya-1處理對(duì)真菌α多樣性指數(shù)的影響較小，在接種辣椒枯萎病菌后同時(shí)接種枯草芽孢桿菌Ya-1能有效降低根際真菌α多樣性。

核心微生物組是影響植物生長(zhǎng)、穩(wěn)定微生物組的關(guān)鍵組成，只有改變核心微生物組，才能徹底改變根際微生物組的群落結(jié)構(gòu)［27］。芽孢桿菌作為一類(lèi)有益微生物菌群，可以產(chǎn)生多種抑菌活性物質(zhì)，抑制病原菌的生長(zhǎng)，提高植物的抗病能力，有些芽孢桿菌具有解磷、固氮和產(chǎn)生植物激素的能力，通過(guò)改變微生物組的結(jié)構(gòu)可影響植物的生長(zhǎng)和抗逆性［11,13,15］。Qiao等［30］研究發(fā)現(xiàn)，外源施用生防枯草芽孢桿菌可以短暫改變番茄根際微生物組。樊祖清等［31］研究表明，施用解淀粉芽孢桿菌菌劑改善了煙田土壤微生物結(jié)構(gòu)，增加了有益菌數(shù)量，尤其是鞘氨醇單胞菌屬的數(shù)量，促進(jìn)煙株吸收根際土壤營(yíng)養(yǎng)、釋放根際分泌物。本研究發(fā)現(xiàn)相比較接種辣椒枯萎病菌組，同時(shí)接種辣椒枯萎病菌和枯草芽孢桿菌Ya-1組中被孢霉屬相對(duì)豐度均升高，而被孢霉屬其中一些有益菌可能與植物形成共生關(guān)系［32-33］，對(duì)于改善土壤性質(zhì)、促進(jìn)植物的生長(zhǎng)起一定的作用，該結(jié)果表明在辣椒枯萎病發(fā)病后添加枯草芽孢桿菌Ya-1后提高了土壤中有益菌數(shù)量。本研究在辣椒枯萎病病原菌Fusarium oxysporum和生防菌枯草芽孢桿菌Ya-1處理 10 d和20 d 后分析了辣椒根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)接種外源菌株處理后對(duì)根際微生物的結(jié)構(gòu)影響較大。通過(guò)基于Bray-Curtis距離對(duì)不同處理的辣椒根際土壤真菌群落組成進(jìn)行PCoA分析，發(fā)現(xiàn)接種前處理和接種10 d、20 d處理真菌群落組成距離較遠(yuǎn)，接種10 d、20 d相聚較近，同時(shí)相異性分析也展示相同的結(jié)果，該結(jié)果表明在進(jìn)行處理后真菌群落組成發(fā)生了顯著變化，但是接種10 d、20 d樣品整體差異較小。分別比較接種10 d和20 d處理組和對(duì)照組真菌群落，同一時(shí)間點(diǎn)處理組和對(duì)照組真菌群落具有顯著差異，接種辣椒枯萎病菌組和同時(shí)接種辣椒枯萎病菌和枯草芽孢桿菌Ya-1組也具有顯著差異，該結(jié)果表明接種辣椒枯萎病菌組和枯草芽孢桿菌Ya-1均能改變辣椒根際真菌群落，而在接種辣椒枯萎病原菌后接種枯草芽孢桿菌Ya-1也改變了接種辣椒枯萎病菌組辣椒根際真菌群落。

對(duì)不同處理根際土壤真菌群落結(jié)果分析表明，在該試驗(yàn)中，各處理土壤優(yōu)勢(shì)種群分別為子囊菌門(mén)（Ascomycota）、接合菌門(mén)（Zygomycota）、擔(dān)子菌門(mén)（Basidiomycota）。與單接辣椒枯萎病菌相比，同時(shí)接種枯草芽孢桿菌Ya-1和病原菌在10 d時(shí)均提高了捕蟲(chóng)霉門(mén)（Zoopagomycota）和擔(dān)子菌門(mén)（Basidiomycota）的相對(duì)豐度，降低了子囊菌門(mén)（Ascomycota）的相對(duì)豐度；在20 d時(shí)，提高了子囊菌門(mén)（Ascomycota）和擔(dān)子菌門(mén)（Basidiomycota）的相對(duì)豐度，降低了捕蟲(chóng)霉門(mén)（Zoopagomycota）的相對(duì)豐度。子囊菌門(mén)是主要優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，有研究表明子囊菌門(mén)引起植物病害，多引起根腐、莖腐、果（穗）腐、枝枯和葉斑等癥狀［34］，在該試驗(yàn)中不同處理子囊菌門(mén)相對(duì)豐度為26.03%-66.53%，占主導(dǎo)地位。擔(dān)子菌多為土壤腐生真菌, 在土壤木質(zhì)素含量較高的環(huán)境中為優(yōu)勢(shì)菌, 是復(fù)雜化合物及有機(jī)質(zhì)的重要分解者，在養(yǎng)分循環(huán)中擔(dān)任著重要角色［35-36］。擔(dān)子菌可高效分解木質(zhì)化植被碎屑，其滑銹傘屬（Hebeloma）、絲膜菌屬（Cortinarius）可與植物共生形成菌根，增強(qiáng)植株抗性［37-38］。

尖孢鐮刀菌是最重要的植物病原真菌之一，可引起多種植物發(fā)生病害［39-41］，同時(shí)也是引發(fā)辣椒枯萎病的病原菌。本研究中，相比較對(duì)照（A），接種辣椒枯萎病菌處理（C）后連接數(shù)減少，而在加入枯草芽孢桿菌Ya-1處理后，節(jié)點(diǎn)數(shù)變化較小，但是正連接數(shù)降低，表明同時(shí)接種枯草芽孢桿菌Ya-1和辣椒枯萎病原菌處理（D）降低了真菌群落的復(fù)雜度。同時(shí)在10 d和20 d，OTU_1（NCBI鑒定為本實(shí)驗(yàn)接種病原菌菌F.oxysporum）相對(duì)豐度在接種辣椒枯萎病原菌組和同時(shí)接種辣椒枯萎病菌組和枯草芽孢桿菌Ya-1組間具有顯著差異，相比較接種辣椒枯萎病原菌組，OTU_1相對(duì)豐度在10 d和20 d時(shí)分別降低了19.03%和6.99%，該結(jié)果表明同時(shí)在接種辣椒枯萎病菌組后接種枯草芽孢桿菌Ya-1顯著降低了根際土壤中病原菌F.oxysporum的相對(duì)豐度，并且在10 d時(shí)效果更加顯著。表明施枯草芽孢桿菌菌劑后有益真菌比例增加，病原菌比例減少，驅(qū)動(dòng)了真菌群落的生態(tài)演替，降低了真菌群落多樣性，進(jìn)而導(dǎo)致土壤中鐮刀菌豐度顯著下降，有效防控辣椒枯萎病發(fā)生。

4 結(jié)論

枯草芽孢桿菌Ya-1處理對(duì)辣椒枯萎病有較好的防治效果，同時(shí)它也改變了接種病原菌辣椒根際真菌群落多樣性和結(jié)構(gòu)，降低了真菌群落的復(fù)雜度和根際土壤中病原菌的豐度。