啟動(dòng)子RD29A對(duì)轉(zhuǎn)雪蓮SikCDPK1基因煙草抗逆性的影響

劉玉玲 王夢(mèng)瑤 孫琦 馬利花 朱新霞

（1.石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 綠洲城鎮(zhèn)與山盆系統(tǒng)生態(tài)兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石河子 832032；2.烏魯木齊職業(yè)大學(xué) 烏魯木齊 830000）

干旱與低溫是影響植物生長(zhǎng)、制約作物產(chǎn)量的重要非生物因素。當(dāng)受到極端逆境影響時(shí)，植物形態(tài)結(jié)構(gòu)與胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)發(fā)生變化，進(jìn)而影響植物正常的生長(zhǎng)代謝［1］。在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中，植物形成了復(fù)雜且精細(xì)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，來(lái)適應(yīng)不斷變化的外界環(huán)境。Ca2+作為重要的第二信使介導(dǎo)逆境信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程，當(dāng)植物感受到刺激信號(hào)時(shí)，胞質(zhì)游離Ca2+濃度發(fā)生短暫而復(fù)雜的變化，將信號(hào)向下游傳遞，形成刺激-信使-細(xì)胞反應(yīng)偶聯(lián)系統(tǒng)啟動(dòng)防御機(jī)制［2］。鈣依賴性蛋白激酶CDPKs是Ca2+信號(hào)通路中關(guān)鍵的逆境傳感蛋白，多以基因家族形式存在，廣泛參與逆境脅迫響應(yīng)過(guò)程，提高植物非生物脅迫耐受性［3］。

啟動(dòng)子是調(diào)控基因表達(dá)的重要元件，決定轉(zhuǎn)錄的方向和效率。組成型啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)目的基因表達(dá)時(shí)，目的基因在植物各組織持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)，造成受體體內(nèi)的物質(zhì)和能量過(guò)度消耗，繼而影響目的基因的精準(zhǔn)時(shí)空表達(dá)。而誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，在未受到誘導(dǎo)時(shí)不會(huì)表現(xiàn)出轉(zhuǎn)錄活性，只有在誘導(dǎo)后才會(huì)驅(qū)動(dòng)下游目的基因的轉(zhuǎn)錄，對(duì)植物造成的副作用較?。?］。RD29A啟動(dòng)子作為誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，其序列中包含保守的 DRE（TACC-GACAT）、C repeat DER 等逆境響應(yīng)元件，這些基序可在干旱、低溫脅迫響應(yīng)中發(fā)揮作用，激活下游相關(guān)抗逆基因轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，減輕惡劣環(huán)境帶來(lái)的損傷［5］。在大豆（Glycine max L.Merr）中監(jiān)測(cè)RD29A啟動(dòng)子活性時(shí)發(fā)現(xiàn)，其干旱響應(yīng)元件可以靶向調(diào)控目的基因表達(dá)來(lái)減輕非生物脅迫對(duì)大豆的傷害［6］。在RD29A啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)AtCDPK1轉(zhuǎn)化馬鈴薯（Solanum tuberosum L.）的研究中發(fā)現(xiàn)，無(wú)脅迫時(shí)，AtCDPK1表達(dá)水平很低，但在干旱脅迫后AtCDPK1可持續(xù)高效表達(dá)，且RD29A∷AtCDPK1轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出一定的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)［7］。RD29A啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)AtDREB1A/CBF3在番茄（Lycopersicon esculentum Mill.）中表達(dá)時(shí)，目的基因可通過(guò)調(diào)節(jié)SOD與CAT活性，提高番茄干旱耐受性［8］。RD29A啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)LeNCED1基因轉(zhuǎn)化矮牽牛（Petunia hybrida），可使轉(zhuǎn)基因植株NCED轉(zhuǎn)錄水平增加，抗旱性顯著增強(qiáng)［9］。RD29A啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)AtDREB1a轉(zhuǎn)化鷹嘴豆（Cicer arietinum），可增強(qiáng)鷹嘴豆的耐旱性［10］。RD29A啟動(dòng)表達(dá)Ta-Ub2基因，可使二穗短柄草（Brachypodium distachyon）耐旱性與耐寒性有所提高［11］。RD29A啟動(dòng)表達(dá)RdreB1BI，轉(zhuǎn)基因草莓（Fragaria ananassa）表現(xiàn)出更強(qiáng)的耐寒性［12］。

天山雪蓮（Saussurea involucrata Kar.et Kir.）是典型的極端生境植物，也是重要的抗逆資源。實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)天山雪蓮SikCDPK1，可以增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因煙草抗低溫和干旱脅迫耐受能力［13］，為探究逆境誘導(dǎo)型啟動(dòng)子RD29A在低溫、干旱脅迫后，是否會(huì)提高轉(zhuǎn)基因煙草的低溫、干旱脅迫耐受性，本研究構(gòu)建SikCDPK1基因與RD29A啟動(dòng)子融合的植物表達(dá)載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤(pán)法轉(zhuǎn)化煙草，經(jīng)過(guò)干旱與低溫誘導(dǎo)后，將其表型變化和葉綠素含量、POD、SOD活性、MDA含量與細(xì)胞膜透性變化等逆境生理指標(biāo)相結(jié)合，分析RD29A啟動(dòng)子對(duì)SikCDPK1抗逆性的影響，為SikCDPK1基因在植物遭遇低溫、干旱時(shí)更好發(fā)揮抗逆功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 煙草（Nicotiana tabacum L.）NC89（由本實(shí)驗(yàn)室保存），用75%的酒精對(duì)種子表面消毒1 min，0.1% HgCl2（體積質(zhì)量分?jǐn)?shù)）溶液消毒7 min，無(wú)菌水沖洗3-4次，用無(wú)菌濾紙吸去種子表面多余的水分后，將種子均勻散播于1/2 MS 固體培養(yǎng)基表面，培養(yǎng)在25℃光照強(qiáng)度為 60 μmol/（m2·s）16 h光照/8 h黑暗的條件下。

1.1.2 主要試劑 普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、RNA提取試劑盒、Revert-Aid First Strand cDNA Synthesis Kit、qPCR 試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)自北京天根生物科技有限公司，T4 DNA ligase、限制性內(nèi)切酶EcoR I、Xma I、BamH I、Sal I購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司，植物表達(dá)載體35S∷SikCDPK1及pMD19T-RD29A質(zhì)粒均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方法

1.2.1 植物表達(dá)載體RD29A∷SikCDPK1的構(gòu)建 用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Xma I分別酶切pCAMBIA2300∷35S∷SikCDPK1與pMD19T-RD29A質(zhì)粒，酶切產(chǎn)物回收純化后用T4 DNA連接酶16℃過(guò)夜連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，在Kan抗性的LB培養(yǎng)基篩選后，分別使用引物RD29A-F、RD29A-R與SikCDPK1-F、SikCDPK1-R（表1）進(jìn)行PCR檢測(cè)，將檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性的重組質(zhì)粒命名為RD29A∷SikCDPK1。

表1 引物序列信息Table 1 Primers information

1.2.2 煙草遺傳轉(zhuǎn)化與轉(zhuǎn)基因煙草鑒定 將RD29A∷SikCDPK1與35S∷SikCDPK1質(zhì)粒轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）GV3101感受態(tài)細(xì)胞，在含Kan（50 μg/mL）與Rif（30 μg/mL）抗性的培養(yǎng)基中篩選后，將PCR檢測(cè)為陽(yáng)性的農(nóng)桿菌菌液采用葉盤(pán)法侵染無(wú)菌煙草葉片，暗培養(yǎng)2 d后，分別在含有Kan抗性的分化培養(yǎng)基與生根培養(yǎng)基篩選，選取生根狀況良好的煙草幼苗移入營(yíng)養(yǎng)土，栽培溫室培養(yǎng)生長(zhǎng)2個(gè)月后，采用CTAB法提取煙草葉片的基因組DNA，用SikCDPK1-F 與 SikCDPK1-R對(duì)轉(zhuǎn)35S∷SikCDPK1基因煙草PCR鑒定，用RD29A-F、RD29A-R與SikCDPK1- F、SikCDPK1-R對(duì)轉(zhuǎn) RD29A∷SikCDPK1 煙草進(jìn)行 PCR 鑒定。

1.2.3 干旱、低溫處理 選取長(zhǎng)勢(shì)良好，生長(zhǎng)狀態(tài)無(wú)明顯差異的非轉(zhuǎn)基因煙草和轉(zhuǎn)基因煙草株系（line1、line2），分別進(jìn)行（1）干旱處理：自然干旱30 d，觀察并記錄煙草葉片萎蔫程度與形態(tài)變化；（2）低溫處理：人工氣候箱4℃處理48 h，觀察并記錄煙草的表型變化。（3）取干旱與低溫脅迫前后的煙草葉片，液氮速凍后保存于-80℃。

1.2.4 生理指標(biāo)測(cè)定 參照《基礎(chǔ)生物化學(xué)》（第2版）［14］的方法，采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定POD活性，采用氮藍(lán)四唑（NBT）光還原法測(cè)定SOD活性，采用分光光度法測(cè)定葉片葉綠素含量，采用TBA法測(cè)定MDA含量，采用電導(dǎo)儀測(cè)定葉片相對(duì)電導(dǎo)率。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 采用SPSS18.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行LSD多重方差分析，顯著性檢測(cè)設(shè)定為P＜0.05（顯著水平）和P＜0.01（極顯著水平），用Excel制作圖表。

2 結(jié)果

2.1 RD29A∷SikCDPK1融合表達(dá)載體鑒定

采用EcoR I和Xma I雙酶切pCAMBIA2300∷RD29A∷SikCDPK1重組質(zhì)粒，獲得了預(yù)期大小為824 bp的RD29A啟動(dòng)子片段（圖1-A），用BamH I和Sal I雙酶切pCAMBIA2300∷RD29A∷SikCDPK1重組質(zhì)粒，獲得了預(yù)期大小為1 716 bp的SikCDPK1目的基因片段（圖1-B），表明RD29A啟動(dòng)子與SikCDPK1基因都整合到pCAMBIA2300載體上，融合表達(dá)載體RD29A∷SikCDPK1構(gòu)建成功。

圖1 RD29A∷SikCDPK1重組質(zhì)粒雙酶切鑒定Fig.1 Double enzyme digestion of RD29A∷SikCDPK1 recombinant plasmid

2.2 轉(zhuǎn)基因煙草分子鑒定

采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將RD29A∷SikCDPK1與35S∷SikCDPK1重組載體轉(zhuǎn)化煙草，Kan抗性篩選后，提取煙草基因組DNA，用SikCDPK1-F與Sik-CDPK1-R引物進(jìn)行轉(zhuǎn)35S∷SikCDPK1煙草分子鑒定，擴(kuò)增出大小為1 716 bp 的SikCDPK1目的基因片段（圖2-A）；用RD29A-F、RD29A-R與SikCDPK1-F、SikCDPK1-R引物進(jìn)行RD29A∷SikCDPK1轉(zhuǎn)基因煙草分子鑒定，擴(kuò)增出大小為1 716 bp SikCDPK1目的基因片段（圖2-B）與824 bp RD29A啟動(dòng)子序列（圖2-C）。

圖2 轉(zhuǎn)基因煙草PCR鑒定Fig.2 Identification of transgenic tobacco by PCR

2.3 轉(zhuǎn)SikCDPK1基因煙草抗逆性分析

2.3.1 干旱脅迫后煙草表型分析 干旱處理前非轉(zhuǎn)基因煙草與轉(zhuǎn)基因煙草均長(zhǎng)勢(shì)良好，生長(zhǎng)狀態(tài)無(wú)明顯差異（圖3-A）；斷水30 d后（圖3-B），非轉(zhuǎn)基因煙草幾乎所有葉片變黃、萎蔫嚴(yán)重，而35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的轉(zhuǎn)基因煙草只輕微黃化、葉片萎蔫彎曲，RD29A啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的轉(zhuǎn)基因煙草幾乎無(wú)黃化，葉片只輕度失水萎蔫、生長(zhǎng)點(diǎn)中心葉挺立，生長(zhǎng)狀況較為良好，受脅迫影響不太明顯。說(shuō)明RD29A∷SikCDPK1轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)干旱的耐受性優(yōu)于35S∷SikCDPK1轉(zhuǎn)基因煙草。

圖3 非轉(zhuǎn)基因煙草與轉(zhuǎn)基因煙草逆境脅迫前后表型變化Fig.3 Phenotypic characteristics of WT tobacco and transgenic tobacco under stress

2.3.2 低溫脅迫后煙草表型分析 非轉(zhuǎn)基因煙草與轉(zhuǎn)基因煙草在低溫脅迫處理前長(zhǎng)勢(shì)一致，生長(zhǎng)狀態(tài)良好（圖3-C），48 h 低溫處理后（圖3-D），非轉(zhuǎn)基因煙草表現(xiàn)出脫水癥，葉片嚴(yán)重下垂，并向下卷曲，顏色變?yōu)樯罹G色，葉緣周圍水漬成片，有明顯冷害癥狀；35S 啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的轉(zhuǎn)基因煙草葉片萎縮，表面出現(xiàn)水漬狀斑點(diǎn)，自葉緣向葉脈處柔弱卷曲，葉基部顏色變暗。RD29A啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的轉(zhuǎn)基因煙草葉片基本舒展，只有少許葉片受傷顏色變深，葉片輕微翻卷，受低溫脅迫影響不大。說(shuō)明RD29A∷SikCDPK1轉(zhuǎn)基因煙草的低溫耐受性優(yōu)于35S∷SikCDPK1轉(zhuǎn)基因煙草。

2.3.3 逆境脅迫相關(guān)生理指標(biāo)分析 POD與SOD是防御系統(tǒng)中重要的保護(hù)酶，能與活性氧、自由基等發(fā)生氧化反應(yīng)，清除植物在新陳代謝過(guò)程中產(chǎn)生的有害物質(zhì)，降低植物受傷害程度。脅迫處理前非轉(zhuǎn)基因煙草與轉(zhuǎn)基因煙草的POD、SOD活性無(wú)明顯差異，干旱、低溫脅迫后，非轉(zhuǎn)基因煙草與轉(zhuǎn)基因煙草POD、SOD活性均上升，但非轉(zhuǎn)基因煙草POD、SOD活性升高不及轉(zhuǎn)基因煙草酶活性升高明顯，RD29A∷SikCDPK1轉(zhuǎn)基因煙草POD、SOD活性升高的最多，極顯著高于35S∷SikCDPK1轉(zhuǎn)基因煙草與非轉(zhuǎn)基因煙草（圖4-A，B）。35S∷SikCDPK1轉(zhuǎn)基因煙草的POD活性與SOD活性與非轉(zhuǎn)基因煙草相比均達(dá)到極顯著水平，但是SOD活性升高沒(méi)POD活性升高明顯。

圖4 非轉(zhuǎn)基因煙草與轉(zhuǎn)基因煙草脅迫處理前后生理指標(biāo)測(cè)定Fig.4 Physiological indexes of non-transgenic tobacco and transgenic tobacco determined before and after stress

葉綠素是參與光合作用的主要色素，葉綠素含量高低能反映植株光合作用強(qiáng)弱。干旱、低溫處理前，非轉(zhuǎn)基因煙草與轉(zhuǎn)基因煙草葉綠素含量相差不大，干旱、低溫處理后，非轉(zhuǎn)基因煙草與轉(zhuǎn)基因煙草葉綠素含量均下降，但非轉(zhuǎn)基因煙草的葉綠素含量下降明顯多于轉(zhuǎn)基因煙草，RD29A∷SikCDPK1轉(zhuǎn)基因煙草葉綠素含量下降得最少，其葉綠素含量極顯著高于35S∷SikCDPK1轉(zhuǎn)基因煙草與非轉(zhuǎn)基因煙草（圖4-C）。

MDA是細(xì)胞膜脂過(guò)氧化的產(chǎn)物。逆境脅迫能刺激葉片產(chǎn)生更多的自由基，加速細(xì)胞膜脂過(guò)氧化，導(dǎo)致體內(nèi)MDA 含量增加，其含量可以反映植物遭受逆境傷害的程度。干旱、低溫處理前，非轉(zhuǎn)基因煙草與轉(zhuǎn)基因煙草的MDA含量無(wú)明顯差異，干旱與低溫脅迫后，非轉(zhuǎn)基因煙草與轉(zhuǎn)基因煙草MDA含量均上升，但非轉(zhuǎn)基因煙草MDA含量升高的最快，增加幅度顯著大于35S∷SikCDPK1轉(zhuǎn)基因煙草，極顯著高于RD29A∷SikCDPK1轉(zhuǎn)基因煙草（圖4-D）。

相對(duì)電導(dǎo)率能反映質(zhì)膜系統(tǒng)受損的程度，與植物的耐受性呈負(fù)相關(guān)。干旱與低溫脅迫前非轉(zhuǎn)基因煙草與轉(zhuǎn)基因煙草的相對(duì)電導(dǎo)率差異不大，脅迫處理后非轉(zhuǎn)基因煙草與轉(zhuǎn)基因煙草電導(dǎo)率均上升，且非轉(zhuǎn)基因煙草電導(dǎo)率上升速率均極顯著高于35S∷SikCDPK1轉(zhuǎn)基因煙草與RD29A∷SikCDPK1轉(zhuǎn)基因煙草（圖4-E），35S∷SikCDPK1轉(zhuǎn)基因煙草相對(duì)電導(dǎo)率上升速率也極顯著高于RD29A∷SikCDPK1轉(zhuǎn)基因煙草。

3 討論

3.1 SikCDPK1基因可提高植物逆境耐受性

植物維持正常的生理活動(dòng)需要一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境、膜系統(tǒng)和氧化酶系統(tǒng)。長(zhǎng)期處于逆境的植物會(huì)出現(xiàn)葉片皺縮、細(xì)胞受損破裂、氣孔運(yùn)動(dòng)降低、線粒體和葉綠體中的電子傳遞系統(tǒng)遭到破壞、活性氧（reactive oxygen species, ROS）誘導(dǎo)積累、各種重要的酶系統(tǒng)紊亂、細(xì)胞膜通透性增大、胞內(nèi)物質(zhì)外滲增多、葉綠體降解速率加快、光合速率減慢、光合作用減弱、丙二醛含量升高、植物自身過(guò)氧化物酶與超氧化物歧化酶的活性降低、抗逆性減弱、正常的生長(zhǎng)代謝受阻［15］。在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中植物已經(jīng)形成了一個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑網(wǎng)絡(luò)，以控制其代謝并適應(yīng)其環(huán)境。在這些途徑中，鈣在各種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中扮演著重要的信使角色［16］。

Ca2+作為植物信號(hào)系統(tǒng)中的第二信使，在植物生長(zhǎng)和發(fā)育中發(fā)揮著重要作用。當(dāng)植物受到溫度、光照、鹽分、滲透壓等外部因素引發(fā)的刺激，會(huì)引發(fā)Ca2+濃度發(fā)生變化，這些變化可以被特定的鈣傳感器/受體識(shí)別和感知［17］。CDPKs是植物中重要的Ca2+信號(hào)感知蛋白，CDPKs已被證明在各種生理過(guò)程中具有重要作用，包括植物的非生物和生物脅迫反應(yīng)。可通過(guò)EF-hands基序結(jié)構(gòu)與Ca2+相結(jié)合，解除自我抑制，激活激酶結(jié)構(gòu)域，向下游傳遞各種環(huán)境刺激觸發(fā)的鈣信號(hào)，調(diào)節(jié)植物的生理變化、免疫反應(yīng)和脅迫響應(yīng)［18-19］。AtCPK10和HSP1通過(guò)ABA和Ca2+信號(hào)通路參與氣孔運(yùn)動(dòng)的調(diào)節(jié)，提高植物耐旱能力［20］，OsCPK4通過(guò)減緩膜脂過(guò)氧化程度提高植物耐鹽和耐干旱能力［21］，ShCDPK6與ShCDPK26通過(guò)激活抗氧化系統(tǒng)產(chǎn)生SOD和POD，有效去除細(xì)胞中的活性氧，減輕低溫和干旱對(duì)植物的損傷［22］。本研究發(fā)現(xiàn)RD29A∷SikCDPK1和35S∷SikCDPK1轉(zhuǎn)基因煙草在低溫、干旱處理后的生長(zhǎng)狀況都優(yōu)于非轉(zhuǎn)基因煙草，進(jìn)一步分析葉綠素、POD、SOD、MDA、相對(duì)電導(dǎo)率等逆境相關(guān)的生理指標(biāo)發(fā)現(xiàn)，干旱和低溫脅迫后，轉(zhuǎn)基因煙草與非轉(zhuǎn)基因煙草相比，葉綠素含量增加，POD和SOD活性升高，丙二醛含量與相對(duì)電導(dǎo)率降低，說(shuō)明SikCDPK1基因在逆境脅迫中可通過(guò)減緩葉綠體降解、提高過(guò)氧化物酶活性與活性氧清除能力、減小膜脂過(guò)氧化程度來(lái)減輕逆境引起的活性氧積累、膜通透性改變、細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)交換失衡等不良癥狀，使轉(zhuǎn)基因煙草的抗逆性增強(qiáng)。

3.2 RD29A啟動(dòng)子可調(diào)控外源基因表達(dá)

啟動(dòng)子是調(diào)控基因表達(dá)的重要元件。組成型35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)耐逆基因表達(dá)時(shí)雖能提高植物的耐逆性［22］，但因其不受時(shí)間與空間的約束，會(huì)持續(xù)、高效、過(guò)量地表達(dá)外源基因，和植物維持自身正常的生長(zhǎng)代謝競(jìng)爭(zhēng)利用能源物質(zhì)，導(dǎo)致植物體 mRNA 轉(zhuǎn)錄受阻，相關(guān)蛋白合成量降低，使植物出現(xiàn)發(fā)育不良，或者轉(zhuǎn)基因種子休眠等情況。如35S∷TaFBA1轉(zhuǎn)基因煙草在抗旱性提高的同時(shí)，出現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株發(fā)育不良，轉(zhuǎn)基因植株種子休眠，發(fā)芽遲緩等現(xiàn)象［23］；35S∷AtDREB1C轉(zhuǎn)基因丹參（Salvia miltiorrhiza）在抗旱性提高的同時(shí)，出現(xiàn)了矮化現(xiàn)象［24］；35S∷AtCBF轉(zhuǎn)基因馬鈴薯在提高植株抗寒性的同時(shí)，出現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株開(kāi)花延遲，馬鈴薯產(chǎn)量減少現(xiàn)象［25］。35S∷TaEXPB23轉(zhuǎn)基因煙草抗旱性增強(qiáng)，但植株苗期生長(zhǎng)速度快，花期提前［26］。因此在提高植物抗逆性的同時(shí)，選擇適合的驅(qū)動(dòng)外源基因表達(dá)的啟動(dòng)子顯得尤為重要。RD29A啟動(dòng)子不僅含有 DRE 等干旱、鹽脅迫響應(yīng)元件，還含有生理節(jié)律調(diào)控元件Circadian，可以對(duì)干旱、低溫、鹽脅迫產(chǎn)生特異響應(yīng)，無(wú)誘導(dǎo)時(shí)，啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄活性特別低或者不啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，克服了組成型啟動(dòng)子無(wú)誘導(dǎo)時(shí)也表達(dá)的缺陷，還能在調(diào)控外源基因表達(dá)增強(qiáng)植物耐逆性的同時(shí)不影響植物的正常生長(zhǎng)發(fā)育。

本研究中RD29A∷SikCDPK1轉(zhuǎn)基因煙草在低溫、干旱處理后的生存狀況優(yōu)于35S∷SikCDPK1轉(zhuǎn)基因煙草，POD活性、SOD活性、葉綠素含量顯著高于35S∷SikCDPK1轉(zhuǎn)基因煙草，相對(duì)電導(dǎo)率與MDA含量顯著低于35S∷SikCDPK1轉(zhuǎn)基因煙草，表明與35S啟動(dòng)子相比，RD29A啟動(dòng)子能更有效調(diào)控轉(zhuǎn)基因煙草通過(guò)減緩葉綠素降解速率、提高抗氧化系統(tǒng)酶活性和減小膜通透性，減緩低溫、干旱對(duì)煙草造成的損傷，增強(qiáng)煙草的低溫、干旱耐受性。

4 結(jié)論

與35S啟動(dòng)子相比，啟動(dòng)子RD29A可明顯提高轉(zhuǎn)雪蓮SikCDPK1基因煙草的干旱、低溫耐受性，使雪蓮SikCDPK1基因耐低溫、干旱效果發(fā)揮得更好。