抗、感品種棉花根系分泌物對尖孢鐮刀菌生長及基因表達(dá)的影響

婁慧 朱金成 楊洋 張薇

（石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院 新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)綠洲生態(tài)農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石河子 832003）

棉花（Gossypium spp.）是我國最重要的纖維經(jīng)濟(jì)作物之一，同時也是重要的油料作物，2022年全國植棉面積為3 000.3千hm2。新疆是中國最大的棉花生產(chǎn)地區(qū)，2022年占全國棉花總種植面積的83.22%（國家統(tǒng)計公報，http://www.stats.gov.cn/sj/zxfb/202302/t20230203_1901689.html）。棉花生產(chǎn)是新疆農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的主要產(chǎn)業(yè)，隨著新疆棉花種植面積的擴(kuò)大和連作年限的延長，棉花枯萎病的發(fā)生日趨加重，已成為影響新疆棉花生產(chǎn)可持續(xù)發(fā)展的一大難題［1］。

棉花枯萎病是棉花的一種常見土傳性的植物真菌病害，病原菌是尖孢鐮刀菌萎蔫?；驼婢‵usarium oxysporum f.sp.vasinfectum, Fov），由于其病原菌頑強(qiáng)、傳播迅速，危害極大，一旦發(fā)生難以治愈［2］。尖孢鐮刀菌通常從棉花的根尖或根部傷口入侵，在入侵棉花的過程中，孢子或微菌核受到棉花根系分泌物的刺激萌發(fā)，因此棉花根系分泌物與尖孢鐮刀菌致病密切相關(guān)［2-3］。Jia等［4］研究發(fā)現(xiàn)，連作馬鈴薯（Solanum tuberosum L.）根系分泌物會促進(jìn)尖孢鐮刀菌菌絲生長和孢子繁殖，同時增強(qiáng)其致病性，導(dǎo)致連作馬鈴薯枯萎病發(fā)生。Yang等［5］通過比較抗、感香蕉（Musa nana Lour.）品種培養(yǎng)液對香蕉枯萎病菌Foc4根系定殖的影響發(fā)現(xiàn)，抗、感品種根系分泌物中有機(jī)酸組分存在明顯差異，分析表明抗病品種具有促進(jìn)拮抗菌生長，且抑制病原菌定殖的作用。Li等［6］通過對不同抗性西瓜［Citrullus lanatus（Thunb.）Matsum.］品種根系分泌物研究發(fā)現(xiàn)，感病品種根系分泌物可促進(jìn)尖孢鐮刀菌菌絲生長、孢子萌發(fā)，抗病品種根系分泌物則具有抑制作用。

轉(zhuǎn)錄組學(xué)是一門在整體水平上研究細(xì)胞中基因轉(zhuǎn)錄的情況及轉(zhuǎn)錄調(diào)控規(guī)律的學(xué)科，從RNA水平研究基因的表達(dá)情況。目前已被應(yīng)用于尖孢鐮刀菌生長發(fā)育和致病過程中的基因表達(dá)分析［7-8］。Yang等［5］通過對香蕉尖孢鐮刀菌（F.oxysporum f.sp.cubense）的轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，氨基糖代謝通路對于厚垣孢子的形成具有關(guān)鍵作用。Lu等［9］通過高通量轉(zhuǎn)錄組測序分析發(fā)現(xiàn)，磷脂酶D信號通路受到抑制，可能會導(dǎo)致黏團(tuán)?；图怄哏牭毒?號小種（F.oxysporum f.sp.conglutinans）菌絲生長緩慢、致病力減弱。Sun等［10］研究發(fā)現(xiàn)，番茄尖孢鐮刀菌（F.oxysporum f.sp.lycopersici）轉(zhuǎn)錄因子FolCZF1的轉(zhuǎn)錄水平在分生孢子和早期侵染階段上調(diào)表達(dá)，進(jìn)一步通過基因敲除獲得的FolCZF1突變體菌株在生長速度、產(chǎn)孢、分生孢子形態(tài)以及致病力等方面均表現(xiàn)出缺陷，表明FolCZF1為其生長發(fā)育所必需。雖然這些研究在一定程度上揭示了尖孢鐮刀菌生長發(fā)育及其致病的分子機(jī)制，但關(guān)于不同棉花品種的根系分泌物對尖孢鐮刀菌基因表達(dá)的影響仍未見報道。

本研究通過抗、感棉花品種根系分泌物與枯萎病菌的共培養(yǎng)，探究根系分泌物對棉花枯萎病菌生長的影響，同時對差異表達(dá)基因（DEGs）進(jìn)行GO功能注釋和KEGG富集分析，從轉(zhuǎn)錄水平對其相互作用機(jī)制進(jìn)行探討，為篩選潛在的關(guān)鍵致病基因及棉花枯萎病的防治奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

棉花感病品種新海14號（XH-14）和抗病品種新海41號（XH-41），枯萎病菌株（F327）均由石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院棉花分子育種實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方法

1.2.1 棉苗的種植 將棉花種子浸泡在75%酒精中消毒10 min，用蒸餾水沖洗3次。將其鋪至有3層紗布的發(fā)芽盒內(nèi)生長至脫殼，用海綿包裹棉花根系穿過35孔泡沫板，防止根系受到傷害，然后將泡沫板放于裝有5 L霍格蘭營養(yǎng)液的塑料盆中，同時使用氧氣泵連續(xù)通氧。45 d后獲得根系分泌物粗收集液，經(jīng)定容、過濾后調(diào)整濃度為0.2 g/mL（指每mL收集液中含0.2 g鮮根重的根系分泌物）。

1.2.2 尖孢鐮刀菌樣本的制備 采用查氏培養(yǎng)基培養(yǎng)Fov分生孢子，在25℃、220 r/min黑暗條件下培養(yǎng)5 d后，進(jìn)行過濾，收集新鮮的分生孢子用于根系分泌物的培養(yǎng)。稱取0.5 g分生孢子懸浮在10 mL根系分泌物水溶液中，在25℃、220 r/min條件下進(jìn)行培養(yǎng)，于培養(yǎng)后6、12、24和48 h分別離心收集菌體。液氮速凍后于-80℃冰箱保存，用于轉(zhuǎn)錄組測序。選取0 h的Fov樣本，標(biāo)記為F0；感病品種XH-14根系分泌物培養(yǎng)的Fov，分別標(biāo)記為G6、G12、G24和G48；抗病品種XH-41根系分泌物培養(yǎng)的Fov，分別標(biāo)記為K6、K12、K24和K48；水培養(yǎng)的Fov，分別標(biāo)記為W6、W12、W24和W48。共13個樣本，每個處理2個生物學(xué)重復(fù)，共構(gòu)建26個文庫。

1.2.3 根系分泌物對尖孢鐮刀菌生長的影響

1.2.3.1 根系分泌物對菌絲生長的影響 將馬鈴薯培養(yǎng)基倒入玻璃培養(yǎng)皿中，冷卻凝固，將2 mL根系分泌物水溶液在培養(yǎng)基表面涂抹均勻。待分泌物浸入培養(yǎng)基表面后，用滅菌的5 mm打孔器在菌落上制作菌餅，接種于培養(yǎng)基中心位置，每皿1個菌餅，每個處理3個重復(fù)，以不加根系分泌物的培養(yǎng)基作為對照（CK），每個處理組設(shè)置3個重復(fù)。倒置于人工氣候箱中（溫度28℃，相對濕度75%）暗培養(yǎng)3、5、7 d，利用十字劃線法測定菌落直徑。

1.2.3.2 根系分泌物對孢子萌發(fā)的影響 將0.5 mL孢子混懸液與等量根系分泌物水溶液滴于凹玻片，放于恒溫箱（28℃）培養(yǎng)2、4、6、8和10 h，并統(tǒng)計孢子萌發(fā)數(shù)，以無菌水為對照（CK），每個處理組設(shè)置3個重復(fù)。

1.2.3.3 根系分泌物對菌生物量的影響 將直徑5 mm同齡等量的菌餅分別接種于抗、感品種根系分泌物培養(yǎng)基上，每個處理組設(shè)置6次重復(fù)。將培養(yǎng)皿倒置于恒溫箱（28℃）培養(yǎng)3、5、7 d，干重比色法測定菌的生物量。

1.2.4 根系分泌物培養(yǎng)尖孢鐮刀菌的轉(zhuǎn)錄組分析

1.2.4.1 RNA的提取 采用Tiagen公司RNA simple total RNA提取試劑盒提取Fov中的總RNA。

1.2.4.2 RNA測序文庫的創(chuàng)建 測序RNA測序文庫的創(chuàng)建和測序工作均由北京百邁客生物科技有限公司完成，使用Illumina HiSeq TM 4000測序儀進(jìn)行測序。

1.2.4.3 RNA測序數(shù)據(jù)的分析及差異表達(dá)基因的篩選 通過HISAT軟件將Clean reads比對Fov的參考基因組（https://fungi.ensembl.org/Fusarium_oxysporum_f_sp_vasinfectum_25433_gca_000260175/Info/Index），統(tǒng)計Reads在參考基因組上的分布和覆蓋率，并對其進(jìn)行FPKM轉(zhuǎn)換，從而獲得全部基因的表達(dá)水平。再用DEGseq進(jìn)行差異分析，篩選閾值為qvalue＜0.005且|log2.Fold_change|＞1。然后，對DEGs（上調(diào)和下調(diào)）進(jìn)行GO功能富集分析及KEGG代謝通路富集分析。

1.2.4.4 利用RT-qPCR對DEGs進(jìn)行驗(yàn)證 為驗(yàn)證RNA-seq結(jié)果的可靠性，選擇12個DEGs進(jìn)行RT-qPCR驗(yàn)證。通過Primer Premier 5.0設(shè)計特異性引物，使用SYBR Green Mix在羅氏LightCycler?480上進(jìn)行分析，按照2-ΔΔct法計算基因的相對表達(dá)量，以Fov微管蛋白基因（β-tubulin-F: 5′-CGTCTAGAGGTACCCATACCGGCA-3′, β-tubulin-R: 5′-GCTCTAGACTGCTTTCTGGCAGACC-3′）為內(nèi)參基因（表1）。引物均由上海捷瑞生物工程有限公司合成。實(shí)驗(yàn)參數(shù)為94℃ 1 min；94℃ 15 s，58℃ 20 s，72℃ 20 s；40次循環(huán)，設(shè)置3次重復(fù)。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.2.5 數(shù)據(jù)處理及作圖 用Graphpad Prism 8軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和繪圖。

2 結(jié)果

2.1 根系分泌物對尖孢鐮刀菌生長的影響

通過抗、感品種根系分泌物對尖孢鐮刀菌的處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著萌發(fā)時間的延長，XH-41根系分泌物處理組的孢子萌發(fā)率顯著低于XH-14根系分泌物處理組和CK對照組，其中XH-41處理組在第10小時時孢子萌發(fā)率為72.10%，與CK對照組相比顯著降低，降低了27.21%（圖1-A）。在培養(yǎng)第7天時，XH-14和XH-41根系分泌物處理組菌的生物量分別為101.31和68.51 mg，與CK對照組相比，XH-14根系分泌物處理組提高了10.94%，而XH-41根系分泌物處理組降低了24.98%（圖1-B）。XH-14根系分泌物處理組的孢子萌發(fā)率，顯著高于XH-41根系分泌物組和CK對照組，其中XH-14處理組在10 h時孢子萌發(fā)率為98.61%，與CK對照組相比有所增加，提高了0.62%。XH-41根系分泌物處理組抑菌圈顯著小于其他兩組處理，在7 d時菌落直徑為5.4 cm，相比XH-14根系分泌物處理組和CK對照組，分別降低了12.52%和3.41%。而在培養(yǎng)3-7 d的XH-14根系分泌物處理組菌落直徑為3.4-6.4 cm，顯著大于CK對照組（圖1-C, D）。以上結(jié)果表明，感病品種XH-14根系分泌物促進(jìn)尖孢鐮刀菌的生長，抗病品種XH-41根系分泌物抑制尖孢鐮刀菌的生長。

圖1 根系分泌物對尖孢鐮刀菌生長的影響Fig.1 Effects of root exudates on the growth of Fusarium oxysporum

2.2 轉(zhuǎn)錄組分析

2.2.1 RNA-seq質(zhì)量評估和轉(zhuǎn)錄組模式分析 通過對抗、感棉花根系分泌物培養(yǎng)的尖孢鐮刀菌26個樣本進(jìn)行RNA-seq，共獲得175.85 Gb Clean data，各樣品Clean data均達(dá)到5.70 Gb，Q30堿基百分比在91.94%及以上。Clean reads比對到Fov參考基因組上的reads數(shù)Mapped reads占86.71%-94.79%（表2和圖2）。每個樣本的兩個生物學(xué)重復(fù)間FPKM分布的皮爾遜相關(guān)系數(shù)R2均在0.945-0.987之間（P＜0.001），表明RNA-seq數(shù)據(jù)可靠，具有較好的重復(fù)性。

圖2 尖孢鐮刀菌樣本間相關(guān)性分析Fig.2 Correlation analysis among the samples of F.oxysporum

表2 測序數(shù)據(jù)評估統(tǒng)計表Table 2 Evaluation statistics of sequencing data

2.2.2 尖孢鐮刀菌差異表達(dá)基因分析 此次分析共檢測到表達(dá)基因20 419個，已知基因18 905個，新基因1 514個。基于表達(dá)量定量結(jié)果，進(jìn)行DEGs篩選（圖3）。感病品種XH-14根系分泌物處理組樣本與同時間水處理樣本（W6、12、24、48 h）相比，培養(yǎng)6、12、24和48 h后分別鑒定到1 583個（744個上調(diào)和839個下調(diào)）、1 117個（708個上調(diào)和409個下調(diào)）、1 611個（765個上調(diào)和846個下調(diào)）和1 715個（945個上調(diào)和770個下調(diào)）DEGs（圖4-A,D）。抗病品種XH-41根系分泌物處理組樣本與同時間水處理樣本（W6、12、24、48 h）相比，培養(yǎng)6、12、24和48 h后分別鑒定到926個（550個上調(diào)和376個下調(diào)）、589個（318個上調(diào)和271個下調(diào)）、1 920個（891個上調(diào)和1 029個下調(diào)）和1 653個（790個上調(diào)和863個下調(diào)）差異表達(dá)基因（圖4-B,D）。（G vs W）vs（K vs W）共獲得DEGs數(shù)量為4 248個，G vs W的DEGs數(shù)量為1 277個，K vs W的DEGs數(shù)量為716個，二者共同富集的DEGs數(shù)量為2 255個（圖4-C）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抗、感品種根系分泌物培養(yǎng)的樣本均存DEGs，其中在感病品種XH-14根系分泌物培養(yǎng)的樣本中上調(diào)的DEGs多于抗病品種XH-41根系分泌物培養(yǎng)的樣本，與培養(yǎng)24、48 h相比，培養(yǎng)6、12 h的DEGs顯著上調(diào)。表明Fov對不同抗性品種的根系分泌物均能夠產(chǎn)生響應(yīng)，但對感病品種根系分泌物的響應(yīng)較為強(qiáng)烈。

圖3 尖孢鐮刀菌的差異表達(dá)基因統(tǒng)計Fig.3 Statistics of differentialy expressed genes of F.oxysporum

圖4 尖孢鐮刀菌的差異表達(dá)基因Fig.4 Differentially expressed genes of F.oxysporum

2.2.3 尖孢鐮刀菌的DEGs功能注釋 對已注釋的DEGs進(jìn)行GO功能富集和KEGG通路分析，GO功能富集結(jié)果顯示，感病品種XH-14根系分泌物處理樣本中，在生物過程方面，DEGs主要富集在氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)（amino acid transport, GO:0006865）、跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)（transmembrane transport, GO:0055085）、脂肪酸生物合成過程（fatty acid biosynthetic process,GO:0006633）等條目上；在細(xì)胞組分方面，主要富集在膜的組成部分（integral component of membrane,GO:0016021）條目上；在分子功能方面，主要富集在陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)ATP酶活性（cation-transporting ATPase activity, GO:0019829）、轉(zhuǎn)移酶活性、轉(zhuǎn)移酰基（transferase activity, transferring acyl groups,GO:0016746）、離子通道活性（ion channel activity,GO:0005216）等條目上（圖5-A）?？共∑贩NXH-41根系分泌物處理樣本中，結(jié)果（圖5-B）顯示，在生物過程方面，DEGs主要富集在跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)（transmembrane transport, GO:0055085）、三羧酸循環(huán)（tricarboxylic acid cycle, GO:0006099）、氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)（amino acid transport, GO:0006865）過程等條目上；在細(xì)胞組分方面，主要富集膜的組成部分（integral component of membrane, GO:0016021）條目上；在分子功能方面，主要富集在陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)ATP酶活性（cation-transporting ATPase activity, GO:0019829）、ATP酶活性（ATPase activity, GO:0016887）、磷酸二酯水解酶活性（phosphoric diester hydrolase activity,GO:0008081）等條目上。

圖5 XH-14（A）和XH-41（B）差異表達(dá)基因GO功能富集Fig.5 GO functional enrichment of XH-14（A）and XH-41（B）differentially expressed genes

KEGG富集分析結(jié)果顯示，感病品種XH-14根系分泌物處理樣本中，共有988個差異基因注釋在125個通路上，富集較為顯著的有檸檬酸循環(huán)（TCA循環(huán)，citrate cycle（TCA cycle）），涉及20個基因；類胡蘿卜素生物合成（carotenoid biosynthesis），涉及3個基因；核黃素代謝（riboflavin metabolism），涉及10個基因；谷胱甘肽代謝（glutathione metabolism），涉及21個基因；淀粉和蔗糖代謝（starch and sucrose metabolism）涉及40個基因（圖6-A）?？共∑贩NXH-41根系分泌物處理樣本中，共有882個差異基因注釋在123個通路上，富集較為顯著的有碳代謝（carbon metabolism）、類胡蘿卜素生物合成（carotenoid biosynthesis），涉及68個基因；其他聚糖降解（other glycan degradation），涉及11個基因；ABC運(yùn)輸工具（ABC transporters），涉及36個基因；脂肪酸代謝（lipoic acid metabolism），涉及2個基因；角質(zhì)、木栓素和蠟的生物合成（cutin, suberine and wax biosynthesis），涉及3個基因（圖6-B）。

圖6 XH-14（A）和XH-41（B）差異表達(dá)基因KEGG代謝通路富集Fig.6 Enrichment of KEGG metabolic pathway of XH-14（A）and XH-41（B）differentially expressed gene

2.2.4 細(xì)胞壁降解相關(guān)基因的分析 Fov從穿透根細(xì)胞壁到在宿主植物定殖期間內(nèi)，會分泌多種細(xì)胞壁降解相關(guān)的酶，在植物細(xì)胞壁的降解和宿主-病原體互作中起重要作用。本研究對抗、感病品種XH-14和XH-41根系分泌物處理樣本的基因相對表達(dá)水平，進(jìn)行聚類分析。共有24個DEGs富集到細(xì)胞壁降解相關(guān)通路，14個水解酶活性，水解O-糖基化合物（hydrolase activity, hydrolyzing O-glycosyl compounds, H）、2個α-L-葡糖苷酶活性（alpha-L-fucosidase activity, A）、3個β-半乳糖苷酶（betagalactosidase activity, B）、2個甘露糖寡糖葡萄糖苷酶活性（mannosyl-oligosaccharide glucosidase activity, M）、1個果膠裂解酶活性（pectate lyase activity, PL）、1個聚半乳糖醛酸酶活性（polygalacturonase activity, P）、1個纖維素酶活性（cellulase activity, C）。其中“水解酶活性、水解O-糖基化合物”基因富集最多，與K6、12、24、48 h處理相比，在G6、12、24、48 h處理下顯著上調(diào)，其中G6 h處理上調(diào)基因數(shù)目達(dá)到10個（圖7）。結(jié)果表明，在感病品種XH-14根系分泌物處理下，尖孢鐮刀菌中存在更多與細(xì)胞壁降解相關(guān)的基因，參與到Fov致病的相關(guān)代謝通路中使棉花感病。

圖7 細(xì)胞壁降解酶相關(guān)基因的聚類分析Fig.7 Cluster analysis of genes related to cell wall degrading enzymes

2.2.5 尖孢鐮刀菌的RNA-seq數(shù)據(jù)驗(yàn)證 隨機(jī)選取12個DEGs進(jìn)行RT-qPCR驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DEGs的表達(dá)趨勢與RNA-seq結(jié)果相一致，表明RNA-seq數(shù)據(jù)可信度高（圖8）。

圖8 尖孢鐮刀菌的差異表達(dá)基因的RT-qPCR驗(yàn)證Fig.8 Validation of differentially expressed genes in F.oxysporum by RT-qPCR

3 討論

3.1 根系分泌物對尖孢鐮刀菌生長的影響

根系分泌物是植物與土壤及土傳病菌相互作用的橋梁，不僅可以通過改變土壤環(huán)境間接抑制土傳病菌，還可以通過自身作用直接抑制土傳病菌［11-13］。眾多學(xué)者對植物根系分泌物進(jìn)行了研究，Liang等［14］研究結(jié)果表明，西瓜枯萎病菌在不同抗性水稻（Oryza sativa L.）品種的根系分泌物處理下會產(chǎn)生不同的響應(yīng)，其中ELIO和4007品種的根系分泌物會抑制枯萎病菌孢子的萌發(fā)和菌的生長，顯著減少了西瓜枯萎病的發(fā)生。Chen等［15］研究發(fā)現(xiàn)，因抗病黃瓜（Cucumis sativus L.）品種的根系分泌物中含糖類物質(zhì)較少，對尖孢鐮刀菌產(chǎn)生抑制作用；感病、中抗品種的根系分泌物中含糖類物質(zhì)較多，能夠促進(jìn)病原菌的生長。Lyu等［16］研究發(fā)現(xiàn)，抗病品種的根系分泌物抑制枯萎病菌絲生長、孢子萌發(fā)和產(chǎn)孢，未接菌與對照相比，提高抑制率，并在接菌后抑制作用增強(qiáng)；感病品種的根系分泌物則表現(xiàn)出促進(jìn)作用。這與本研究結(jié)果一致，抗病品種XH-41的根系分泌物對棉花枯萎病病原菌生長發(fā)育具有一定的抑制作用，XH-41根系分泌物處理的菌落直徑明顯小于CK和感病品種XH-14根系分泌物處理的菌落直徑，并且其孢子萌發(fā)率和菌生物量均較低。由此推測抗病品種根系分泌物中可能存在某些物質(zhì)，對尖孢鐮刀菌的生長起到抑制作用，而具體分子機(jī)制有待進(jìn)一步地探究。

3.2 尖孢鐮刀菌與根系分泌物共培養(yǎng)的轉(zhuǎn)錄組分析

Fov能夠在土壤和死亡的植物殘體中存活多年，防治困難，引發(fā)的病害已成為農(nóng)業(yè)上限制作物生產(chǎn)力的重要因素之一，目前人們對于其致病分子機(jī)制的了解還很有限［17-18］。Formela-Luboińska等［19］通過探究根腐病致病菌尖孢鐮刀菌PkF01孢子萌發(fā)的分子機(jī)制，對萌發(fā)孢子進(jìn)行RNA-seq，在GO功能富集和KEGG通路分析中發(fā)現(xiàn)，與核糖體相關(guān)的DEGs顯著富集。Li等［20］為了揭示岷江百合（Lilium brownii var.viridulum Baker）抗枯萎病菌防衛(wèi)反應(yīng)的分子機(jī)制，從岷江百合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中挖掘了一個響應(yīng)尖孢鐮刀菌侵染的病程相關(guān)蛋白（PR）4基因，通過RT-PCR和染色體步移擴(kuò)增得到LrPR4的DNA序列及其啟動子片段，并初步分析其功能。徐麗嬌等［21］研究發(fā)現(xiàn)在干旱條件下，叢枝菌根真菌（AMF）的根外菌絲跨膜形成了H+外流和Ca2+內(nèi)流，加快了菌絲和環(huán)境兩者間的物質(zhì)交換，促進(jìn)了AMF與寄主植物間的信號傳導(dǎo)，提高了作物對干旱的抵抗能力。本研究利用RNA-seq技術(shù)，對抗性不同棉花品種根系分泌物共培養(yǎng)的Fov轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析，在GO富集分析中發(fā)現(xiàn)，跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)（transmembrane transport,GO:0055085）條目在抗、感根系分泌物處理下均顯著富集，表明此條目中的基因可能與Fov和棉花間的互作密切相關(guān)，為后期篩選枯萎病菌致病相關(guān)基因奠定基礎(chǔ)。

3.3 尖孢鐮刀菌的細(xì)胞壁降解酶相關(guān)基因分析

在宿主植物的病原菌侵染過程中，病原菌可通過分泌多種細(xì)胞壁降解酶來突破宿主植物的細(xì)胞壁，然后侵染植物使其感?。?2-23］。研究發(fā)現(xiàn)，鐮刀菌（Fusarium sp.）分泌的細(xì)胞壁降解酶主要有果膠酶、纖維素酶、蛋白酶、淀粉酶和磷脂酶等［24-26］。Tini等［27］研究表明利用不同種類鐮刀菌侵染小麥，從而引發(fā)小麥赤霉病，發(fā)現(xiàn)禾谷鐮刀菌（F.graminearum）強(qiáng)致病力菌株（FH1和FH8）產(chǎn)生的細(xì)胞壁降解酶活性水平顯著強(qiáng)于弱致病力菌株（FH11和FH19）。Escobar等［28］通過轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)，番茄枯萎病菌（F.oxysporum f.sp.lycopersici）的木聚糖酶基因xyl5和xyl2的表達(dá)受時期的影響，xyl5只在侵染前期響應(yīng)，xyl2在侵染末期響應(yīng)，xyl3和xyl4在整個過程中均有響應(yīng)。Wang等［29］研究發(fā)現(xiàn)，β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶基因在感病棉花品種根系分泌物處理的大麗輪枝菌（Verticillium dahlia）中顯著上調(diào)，而在耐病品種根系分泌物和水處理的樣品中無明顯上調(diào)，表明感病棉花品種根系分泌物與黃萎病的發(fā)病相關(guān)。本研究結(jié)果表明，感病品種XH-14根系分泌物培養(yǎng)的Fov樣本中特有的上調(diào)的DEGs多于抗病品種培養(yǎng)的樣本，通過GO功能富集和KEGG通路分析，篩選到XH-14根系分泌物處理下與“水解酶活性、水解O-糖基化合物”（hydrolase activity,hydrolyzing O-glycosyl compounds）相關(guān)的基因，這一結(jié)果部分解釋了Fov容易導(dǎo)致感病品種感染枯萎病的原因，為探討和解析Fov與棉花相互作用的分子機(jī)理及Fov致病的分子機(jī)理奠定了基礎(chǔ)，對棉花枯萎病的防治具有指導(dǎo)性價值。

4 結(jié)論

抗病品種棉花根系分泌物抑制尖孢鐮刀菌的生長，感病品種棉花根系分泌物促進(jìn)尖孢鐮刀菌的生長。顯著富集到細(xì)胞壁降解酶“水解酶活性、水解O-糖基化合物”GO條目。為篩選該病原真菌潛在的關(guān)鍵致病基因奠定基礎(chǔ)，為棉花枯萎病的防控提供理論依據(jù)。