馬鈴薯StCIPK11的克隆及響應干旱脅迫分析

劉雯錦 馬瑞 劉升燕 楊江偉，2 張寧，2 司懷軍，2

（1.甘肅農業(yè)大學生命科學技術學院，蘭州 730070；2.甘肅農業(yè)大學省部共建干旱生境作物學國家重點實驗室，蘭州 730070；3.甘肅農業(yè)大學農學院，蘭州 730070）

馬鈴薯（Solanum tuberosum L.）為茄科茄屬一年生草本植物，是世界重要的糧食、蔬菜兼經濟作物，在糧食安全和社會經濟發(fā)展中都發(fā)揮著重要作用［1］。干旱是一種常見的不利環(huán)境因素，對農業(yè)生產發(fā)展有著極大的影響。馬鈴薯對水分十分敏感，干旱條件下，馬鈴薯根、莖、葉的生長發(fā)育都會受到影響，其結薯能力以及塊莖對營養(yǎng)元素的吸收也會受到抑制，從而降低塊莖的品質［2-3］，因此，干旱成為嚴重制約馬鈴薯生長生產的重要因素之一［3-6］。

鈣離子是一種重要而保守的第二信使，廣泛存在于真核生物體內，在植物逆境信號轉導過程中起著至關重要的作用［7］。當植物在受到不利環(huán)境刺激時，細胞質中Ca2+的濃度就會發(fā)生一系列復雜的變化，即產生Ca2+振蕩。Ca2+感受器接受到振蕩信號并繼續(xù)向下游傳遞，從而引起植物一系列的生理生化反應［8］。目前，已知高等植物中的Ca2+感受器有鈣調蛋白（calmodulin, CaM）、鈣調磷酸酶B類蛋白（calcineurin B-like protein, CBLs）、鈣調蛋白類似蛋白（calmodulin-like protein, CMLs）和鈣依賴蛋白激酶（calcium-dependent protein kinases, CDPKs），這四大類感受器的蛋白質結構中均含有EF手型（EF-hand）結構，該結構在與Ca2+結合時會發(fā)生改變［9］。CBL是植物體內多種鈣離子感受器中較為特殊的一類小分子鈣結合蛋白，其自身沒有活性，需與下游的CBL結合蛋白激酶（CBL interacting protein kinase,CIPK）特異性互作，激活下游靶標，解碼Ca2+信號［10-11］。CIPKs是植物中特有的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族［12］，前人研究發(fā)現(xiàn)CIPK參與調節(jié)植物各種生理反應從而調節(jié)植物應激耐受性［13-15］。植物在遭受干旱脅迫時，細胞內會產生大量的活性氧（reactive oxygen species, ROS），造成嚴重的氧化損傷，破壞膜系統(tǒng)的完整性［16］，膜脂過氧化產物丙二醛（malondialdehyde, MDA）的含量可以反映出植物所受傷害的程度［17］。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）和過氧化物酶（peroxidase, POD）可有效分解植物體內的自由基，對植物起到一定的保護作用。在缺水環(huán)境下，植物會通過改變體內的滲透調節(jié)物質水平來維持正常生理功能，而脯氨酸（proline, Pro）是植物響應滲透脅迫抗性的重要指標，逆境中脯氨酸的累積可降低細胞的滲透勢，保護質膜免受缺水的有害影響［18-19］。

再者，食品行業(yè)有時需要運輸海鮮、魚、肉等需要保鮮的東西，冬天還好，但是在夏天，天氣炎熱使很多物資都浪費在了路上，損失的也不是小數(shù)目。這些問題一直到現(xiàn)在都是無法徹底解決的，公司的管理層對此也是非常地頭大，雖然物資運輸慢是可以克服的，但是想要運輸成批量的保鮮食品的難度還是非常大的。

近年來，有關CIPK響應非生物脅迫過程的機制已在擬南芥、水稻、玉米、小麥等多種植物中進行了大量研究，如AtCIPK6介導內質網(wǎng)定位的鈣結合肽來調節(jié)對干旱的抗性［20］；過表達OsCIPK15可提高水稻對低溫、干旱和鹽脅迫耐受能力［21］；小麥過表達TaCIPK24可提高植株耐鹽性［22］；干旱脅迫后ZmCIPK8在玉米葉片和根部的表達發(fā)生了顯著變化［23］；SlCIPK8在番茄響應干旱、低溫和鹽脅迫過程中都起到一定作用［24］；CaCIPK13在辣椒耐冷性機制中發(fā)揮積極作用［25］。

Ma等［26］完成了馬鈴薯CIPK家族基因系統(tǒng)鑒定發(fā)現(xiàn)，馬鈴薯植株在干旱脅迫后StCIPK11的表達量發(fā)生了顯著變化，但關于馬鈴薯StCIPK11在干旱脅迫方面的研究還較為罕見。

1.2.5 馬鈴薯遺傳轉化及轉基因植株鑒定 將構建好的p1300-StCIPK11和pBI121-amiR-StCIPK11重組質粒導入根癌農桿菌GV3101菌株中。參見Qi等［17］方法進行試管薯的誘導，參考Huai［27］方法進行馬鈴薯的遺傳轉化。

1 材料與方法

1.1 材料

所用供試馬鈴薯品種‘大西洋’試管苗由甘肅農業(yè)大學生命科學技術學院分子生物學實驗室保存并提供；pMD18-T克隆載體購于TaKaRa公司；大腸桿菌感受態(tài)DH5α購于北京全式金生物技術有限公司；農桿菌GV3101、載體pCAMBIA1300、pRS300和pBI121均由甘肅農業(yè)大學生命科學技術學院分子生物學實驗室保存并提供。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取和cDNA合成 根據(jù)TIANGEN總RNA提取試劑盒（天根，北京）提取‘大西洋’葉片總RNA。根據(jù)TIANGEN Fast Quant RT試劑盒（天根，北京）合成第一鏈cDNA。

1.2.4.2 馬鈴薯StCIPK11干擾表達載體構建 利用WMD3網(wǎng)站（http://wmd3.weigelworld.org/）獲取StCIPK11的amiRNA干擾序列（5′-TTCTATTTCCGCGCTAGCCTC-3′）和PCR擴增引物序列（表1），將引物序列提交至金唯智生物科技（蘇州）有限公司進行合成。以pRS300質粒為模板，進行amiRStCIPK11前體片段a（引物A和IV）、b（引物III和II）、c（引物I和B）的擴增；再以a、b、c小片段混合物為模板擴增d（引物A和B）片段，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測回收。將回收的d片段與pMD18-T克隆載體連接成功后轉入大腸桿菌DH5α，經PCR檢測后，對陽性克隆進行測序檢驗，以測序正確的pMD18-amiR-StCIPK11為基礎，采用酶切連接法將干擾片段amiR-StCIPK11插入pBI121質粒中，命名為pBI121-amiR-StCIPK11。

1.2.4.1 馬鈴薯StCIPK11過表達載體構建 根據(jù)StCIPK11序列，通過（https://www.takarabio.com/learning-centers/cloning）網(wǎng)站設計上下游引物并在5′端分別添加Kpn I和BamH I酶切位點（表1）。引物由金唯智生物科技（蘇州）有限公司合成。

2.全面清理不利于民營企業(yè)發(fā)展的法律法規(guī)和規(guī)范性文件。統(tǒng)籌協(xié)調正在開展的相關法律法規(guī)清理工作，在2018年年底前集中清理現(xiàn)行法律法規(guī)和規(guī)范性文件中有悖于平等保護原則、不利于民營經濟發(fā)展的相關內容，及時予以廢止或者調整完善，打破各種各樣的“卷簾門”“玻璃門”“旋轉門”。進一步加強法規(guī)規(guī)章備案審查，及時糾正有悖于保護民營經濟的法規(guī)規(guī)章規(guī)定，積極為民營企業(yè)發(fā)展提供平等法治保障。

1.2.4 載體構建

泄漏7 200 d后，上覆第四系松散孔隙含水層氟化物污染羽狀物繼續(xù)向南側擴散遷移，濃度也在持續(xù)增大，但遷移距離為75 m，擴散面積12 800 m2;此時下伏巖溶含水層出現(xiàn)低濃度氟化物迅速向南側遷移，最遠遷移距離約300 m,擴散面積36 600 m2。

1.2.3 StCIPK11的生物信息學分析 從馬鈴薯PGSC數(shù)據(jù)庫（http://solanaceae.plantbiology.msu.edu/pgsc_download.shtml）中獲取StCIPK11序列（Soltu.DM.06G002800.1），利用NCBI ORFfinder（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）查找StCIPK11開放閱讀框；通過ExPASy-ProtParam tool（https://web.expasy.org/protparam/）預測該蛋白一級結構，運用Ex-PASy-ProtScale（https://web.expasy.org/cgi-bin/protscale/protscale.pl）分析其基本理化性質；利用SOPMA（https://blog.csdn.net/wangli-ang_f/article/details/22859187）預測二級結構；通過SWISSMODEL（https://swissmodel.expasy.org/interactive/NJSqC4/models/）預測三級結構；利用TMHMM Server v.2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）預測蛋白的跨膜結構域、WOLF PSORT（http://www.genscript.com/wolf-psort.html）進行亞細胞定位預測；利用MEGAX軟件對鑒定的蛋白質序列進行多重序列比對并構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹（采取鄰近法、使用Poisson模式，重復次數(shù)為1 000，其他參數(shù)默認）。

(1) 本文通過興趣點、土地開發(fā)情況、逗留人數(shù)、車站交通銜接條件等數(shù)據(jù)的挖掘，利用雷達圖分析法找到評價各車站的相對分值，該評價值與車站的出站客流量相關性較高，可以近似反應各站客流量的變化趨勢。因此，該方法可以在城市軌道交通客流評價中進行應用。

表1 本研究所用的引物序列Table 1 Primer sequences used in the study

利用同源重組法將1.2.2中的回收產物連接至pCAMBIA1300質粒，重組質粒命名為p1300-StCIPK11。

1.2.2 StCIPK11基因克隆 以1.2.1合成的cDNA為模板進行StCIPK11的擴增，擴增條件為94℃ 3 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 2 min，30個循環(huán)；72℃ 10 min，4℃保存。按照天根生化科技（北京）有限公司DNA膠回收試劑盒說明書，回收經電泳檢測后的StCIPK11片段。

本研究克隆StCIPK11并進行生物信息學分析，構建其過表達載體和干擾表達載體，對轉化馬鈴薯薯塊獲得的轉基因植株進行PEG脅迫，測定轉基因植株中StCIPK11的表達水平和生理生化指標，解析StCIPK11在響應干旱脅迫中發(fā)揮的作用，以期為深入研究StCIPK11響應馬鈴薯抗旱調控的分子機制提供理論依據(jù)。

通過查找比對馬鈴薯StCIPK11蛋白與其他11個物種同源性蛋白序列發(fā)現(xiàn)，HRDLKPENLL這段序列在12個比對的物種間高度保守（圖2）。構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹分析StCIPK11蛋白在不同物種間的進化關系，結果（圖3）表明，馬鈴薯與智利番茄的親緣關系最近。

1.2.6 轉基因植株StCIPK11的表達分析 采用實時熒光定量PCR的方法分析StCIPK11在不同轉基因植株中的相對表達情況。以非轉基因植株和轉基因植株RNA反轉錄合成的cDNA作為模板，延伸因子lα（elongation factor 1α, Ef1α）基因為內參，設計特異性引物（表1），使用TIANGEN Super Real PreMix Plus（SYBR Green）試劑盒進行實時熒光定量PCR。反應體系為Super Real PreMix Plus（2×）10 μL、上、下游引物各0.6 μL、模板1 μL，用ddH2O補至20 μL。反應條件為95℃ 15 min；95℃ 10 s，60℃ 30 s，72℃ 40 s，45個循環(huán)。3次技術重復，根據(jù)相對表達量計算公式2-ΔΔCt法計算StCIPK11的相對表達量。

1.2.8 統(tǒng)計分析方法 利用Office 2020對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計與整理，使用SPSS 22.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，試驗數(shù)據(jù)為3個生物學重復的平均值，用LSD法進行顯著性分析，星號表示顯著性差異（*：P＜0.05，顯著差異；**：P＜0.01，極顯著差異）。

1.2.7 PEG6000脅迫下轉基因植株StCIPK11的生理生化指標測定 將轉基因植株接種于含3%蔗糖的MS液體培養(yǎng)基（25℃ 16 h光照/8 h黑暗20 d），倒出液體培養(yǎng)物，并含20% PEG6000新MS液體培養(yǎng)基取代［28-29］。處理1 d后取樣，液氮速凍后-80℃保存，每個樣品采集自獨立的植株，進行3次生物學重復。參照《植物生理學實驗》操作方法［30］，測定葉片中SOD活性、POD活性、MDA含量和Pro含量。

面對全新的發(fā)展環(huán)境，各醫(yī)院必須緊緊圍繞在戰(zhàn)略部署的周圍，深化理解現(xiàn)代醫(yī)院管理制度的現(xiàn)實需要，實現(xiàn)對財務管理各崗位職能與責任義務的優(yōu)化配置，進而為構建嶄新財務管理組織奠定基礎，適應公立醫(yī)院綜合改革的現(xiàn)實需要。在實現(xiàn)崗位優(yōu)化配置的實踐中，應該將重點放在財務管理職能逐步強化這一視角之上，整合《會計法》、《行政事業(yè)單位內部控制規(guī)范》、《醫(yī)院財務制度》等相關法律法規(guī)與政策部署中的要求與路線指引，公立醫(yī)院應該將進一步提高內部治理能力為基本著眼點與發(fā)力點，盡快構建起將總會計師作為核心的領導管理機制，使得財務部門可以盡快實現(xiàn)集中化、統(tǒng)一化管理，實現(xiàn)財務核算職能與管理職能的相互分離。

2 結果

2.1 StCIPK11基因克隆

以馬鈴薯品種‘大西洋’的cDNA為模板進行PCR 擴增（圖1-A），瓊脂糖凝膠電泳檢測結果表明，在1 000-2 000 bp之間有明顯條帶，大小約為1 341 bp，與預期大小一致。

圖1 StCIPK11的擴增產物條帶及 amiR-StCIPK11前體片段擴增Fig.1 StCIPK11 amplified product bands and amiRStCIPK11 precursor fragments amplification

2.2 StCIPK11生物信息學分析

根據(jù)馬鈴薯StCIPK11序列（Soltu.DM.06G0028 00.1），該基因位于第6染色體，全長1 747 bp，包含一個1 341 bp開放閱讀框，含有2個外顯子。StCIPK11共編碼456個氨基酸，總原子數(shù)7 238個、化學分子式C2281H3663N611O659S24、相對分子量50 960.31 Da、等電點8.47、不穩(wěn)定指數(shù)38.01。通過在線軟件預測，結果表明，StCIPK11蛋白質結構以無規(guī)則卷曲（40.36%）為主，α-螺旋（31.61%）次之，最后為延伸鏈（19.0%）和β轉角（8.97%）；StCIPK11蛋白可能定位于細胞質中，是不具有跨膜結構域的親水性蛋白。

通過CTAB法提取轉基因植株和非轉基因植株的DNA為模板，利用表達載體pCAMBIA1300上特有的HYG抗性標記序列和pBI121上特有的新霉素磷酸轉移酶NPT II，設計特異性引物（表1），以非轉基因植株DNA和質粒p1300-StCIPK11、pBI121-amiR-StCIPK11作為對照，分別擴增HYG和NPT II，篩選轉基因植株用于后續(xù)測定。

Step3：將屬于同一類別的所有用戶評分和情境信息平均值作為該類中心；返回Step2，直到聚類中心不再發(fā)生變化。

2.3 StCIPK11過表達載體與干擾表達載體構建

利用同源重組法獲得重組質粒p1300-StCIPK11，經Kpn I和BamH I酶切驗證，結果（圖4-A）顯示，片段在1 000和1 500 bp中間有明顯條帶，大小約為1 341 bp，符合目的基因預期效果，結合測序結果，進一步說明馬鈴薯過表達載體p1300-StCIPK11構建成功。

圖4 重組質粒雙酶切驗證Fig.4 Double-digestion verification of recombinant plasmid

以pRS300為模板，擴增獲得a（272 bp）、b（171 bp）、c（298 bp）片段（圖1-B），以a、b、c的膠回收產物以等量混合后擴增d片段，片段大小與預期相符（圖1-C）。利用雙酶切法獲得干擾表達載體pBI121-amiR-StCIPK11，經Kpn I和Xba I雙酶切驗證，插入的目的片段大小為512 bp（圖4-B），與預期片段的大小相符，結合測序結果進一步表明干擾表達載體pBI121-amiR- StCIPK11構建成功。

2.4 馬鈴薯轉化植株的檢測

對農桿菌介導法獲得的轉化植株用HYG和NPT II進行PCR擴增檢測，結果表明，目的基因已整合到馬鈴薯基因組中。RT-qPCR結果表明，StCIPK11在過表達株系中的相對表達水平顯著高于非轉基因植株，OE-1和OE-2的表達水平分別是NT植株的11.59和21.76倍；StCIPK11在干擾表達株系中的表達水平顯著低于NT，Ri-1和Ri-2的表達水平分別是NT植株的0.21和0.22倍，抑制效率達到78%以上（圖5）。

圖5 轉基因植株的RT-qPCR檢測Fig.5 RT-qPCR detection of the transgenic plants

2.5 PEG6000脅迫下轉基因植株的生理指標測定

模擬干旱條件下，過表達植株中MDA含量是NT植株的1.24-1.32倍以上，而Pro含量是NT植株的0.91倍，SOD和POD活性也較低，僅為NT植株的82%-84%；干擾表達植株中MDA含量是NT植株的0.84-0.86倍，Pro含量是NT植株的1.18-1.32倍，SOD、POD活性顯著高于NT植株和過表達植株，是NT植株的1.25-1.40倍（圖6）。

圖6 PEG6000處理下轉基因植株和NT植株生理指標分析Fig.6 Analysis of physiological indices of transgenic and NT potato plants under PEG6000 treatment

3 討論

干旱是威脅農業(yè)生產力和生態(tài)平衡的主要環(huán)境因素之一［31］。當植物遭受干旱脅迫時，細胞中的鈣離子濃度會迅速累積［17］。CBL-CIPK作為Ca2+信號通路中的重要感受器之一，在維持植物正常生長和調節(jié)環(huán)境脅迫反應中發(fā)揮重要作用。基于前人對馬鈴薯CIPK基因家族的研究，本試驗發(fā)現(xiàn)，PEG模擬干旱脅迫條件下，干擾表達StCIPK11可以提高馬鈴薯抗氧化酶（SOD、POD）活性和脯氨酸含量，減少MDA含量，減輕細胞受損程度，從而降低馬鈴薯幼苗對水分的敏感性。

本研究對StCIPK11進行了生物信息學分析。結果顯示，StCIPK11編碼的蛋白質與擬南芥［28］、紫花苜蓿［32］和小麥［33］等CIPK蛋白質二級結構基本一致，均以無規(guī)則卷曲和α-螺旋結構為主；研究發(fā)現(xiàn)AtCIPK11蛋白在擬南芥中雙定位于細胞質和細胞核中［31］，而本研究亞細胞定位預測結果顯示StCIPK11蛋白定位于細胞質上，后期需進行相關試驗再次鑒定。

在其他調味品應用上，Nisin主要是與其他防腐劑進行復配使用，而非單一添加應用，因此后續(xù)在開發(fā)Nisin防腐效果上，應采用復配型防腐劑。

為進一步研究StCIPK11響應非生物脅迫的分子和生理機制，通過構建過表達載體和干擾表達載體，利用農桿菌介導法獲得StCIPK11轉基因植株。本研究中，在20% PEG條件下，NT植株和轉基因植株體內MDA、Pro含量和SOD、POD活性較脅迫前均有升高，過表達植株中MDA含量高于NT植株，而Pro含量和SOD、POD活性均顯著低于NT植株，說明干旱條件下，StCIPK11過表達植株更易受到損傷，且清除活性氧的能力較弱；干擾表達植株中MDA含量略低于NT植株，而Pro含量和SOD、POD活性則是NT植株的1.18-1.40倍，說明干擾表達植株對干旱脅迫具有更高的抵抗力。前人發(fā)現(xiàn)，AtCIPK11不僅響應干旱、高pH脅迫，還參與鐵離子和脫落酸（abscisic acid, ABA）調節(jié)［24,34-35］；ZmCIPK27在玉米遭受干旱脅迫后表達水平顯著上升［36］；馬鈴薯中，StCIPK11在響應干旱、PEG、NaCl及部分激素脅迫后其表達水平存在顯著差異［26,37］；擬南芥過表達AtCIPK11植株在干旱脅迫下，MDA含量最高，脯氨酸含量顯著低于NT植株［35］，與本研究結果一致。StCIPK11可能是通過調節(jié)植物體內抗氧化酶活性，清除體內自由基含量，增加有機物質積累從而響應干旱脅迫，其作用機理及分子機制有待于進一步研究。本研究結果初步表明了StCIPK11負調控馬鈴薯的抗旱性。

綜上所述，護理臨床帶教中實施分層次教學目標管理，應用價值較高，可有效提供帶教效果，為實習生日后工作奠定良好基礎，利于醫(yī)療事業(yè)良性發(fā)展。

4 結論

從馬鈴薯中克隆獲得StCIPK11，全長1 747 bp，包含一個1 341 bp開放閱讀框，編碼456個氨基酸。StCIPK11對干旱脅迫有響應，在馬鈴薯中干擾其表達，會使馬鈴薯植株抗旱能力升高。