多菌種聯(lián)用發(fā)酵燕麥麩皮工藝優(yōu)化及發(fā)用功效評價

張岳一 蘭社益 裴海閏 封棣

（北京工商大學輕工科學技術(shù)學院，北京 100048）

燕麥（Avena sativa L.）富含蛋白質(zhì)和膳食纖維，尤以球蛋白與β-葡聚糖含量最高［1］，在禾谷類糧食中均居首位。麩皮是燕麥加工中的主要副產(chǎn)物，廉價易得，相比于燕麥胚乳，麩皮中蛋白所占比例更高，可達到15%-20%，除此之外，燕麥β-葡聚糖也在麩皮的糊粉層和亞糊粉層中富集［2］。

燕麥蛋白經(jīng)過降解，可獲得比原蛋白生物活性更好的燕麥多肽，燕麥多肽較燕麥蛋白具有更好的加工性能、理化性能、水合性質(zhì)以及溶解性［3］。ProvitalGroup公司生產(chǎn)的HydrolyzedOat由控制酶法水解燕麥蛋白制得，添加至護發(fā)類產(chǎn)品中，起到調(diào)理、修復、成膜保濕等作用。對成纖維細胞的增殖和皮膚膠原蛋白的合成均具有顯著的促進作用［3］。多肽可作為發(fā)用洗護產(chǎn)品的原料，小分子多肽有利于毛發(fā)吸收，并幫助恢復角蛋白中的二硫鍵，修護毛鱗片角蛋白［4］。目前燕麥多肽制備多采用酶解法，陳敏［5］以燕麥粉為原料，使用堿性蛋白酶制備燕麥多肽，得率達17.02%。但是蛋白質(zhì)通過酶解獲取多肽會產(chǎn)生苦味和臭味，影響產(chǎn)物的感官品質(zhì)，且費用較高。

燕麥麩皮中的β-葡聚糖具有較強的吸附小分子的能力，能和多酚通過氫鍵、疏水相互作用等結(jié)合，形成的多糖多酚復合物能為機體提供持久的抗氧化能力［6］。燕麥β-葡聚糖的大分子結(jié)構(gòu)可作為天然保濕劑添加到發(fā)用化妝品中，β-葡聚糖分子覆蓋于頭發(fā)表面可起到增加發(fā)絲濕度、強度的作用，強化頭發(fā)的韌性［7］。且因其具有保濕性，能夠改善頭皮屑、皮脂和發(fā)癢。目前燕麥β-葡聚糖的提取方法主要有水提法、熱提取法、超聲輔助提取法等。熱提取法的提取條件較為溫和，因此能夠在較大程度上保留β-葡聚糖的物理性質(zhì)，可作為一種β-葡聚糖的基礎提取方法。李楠等［8］以燕麥全粉為原料，采用熱提法制備燕麥β-葡聚糖，得率達4.36%。但熱提法料液過于濃稠，不易分離，提取效率較低。

雖然分別提取燕麥多肽和β-葡聚糖已經(jīng)達到較高得率，但目前常用的提取方法尚存在一定缺陷，相比之下，發(fā)酵提取法具有反應條件溫和簡單、提取率高、產(chǎn)物活性高及廢料可回收等優(yōu)勢［9］。蓋夢等［10］使用枯草芽孢桿菌發(fā)酵燕麥制備降壓肽，血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制活性達63.96%。劉新琦等［11］通過接種高活性干酵母發(fā)酵提取β-葡聚糖，得率為5.21%，與傳統(tǒng)水提法相比提高了60.8%。然而，通過一次性工藝同時提取燕麥多肽與燕麥β-葡聚糖的研究較少，現(xiàn)有文獻中也缺少兩種混合功能成分應用到護發(fā)類化妝品的評價。因此，本研究將通過多菌種聯(lián)用發(fā)酵法同時提取燕麥多肽和燕麥β-葡聚糖，并與熱提取燕麥β-葡聚糖和酶解提取燕麥多肽進行比較，對3種提取液的功能成分得率、抗氧化活性、抑菌活性與發(fā)用功能進行研究分析，以期為燕麥麩皮發(fā)酵液發(fā)用領域的應用提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 無菌操作臺SW-CJ-1FD，廣州瑞智凈化設備有限公司；全溫振蕩培養(yǎng)箱TCYQ，蘇州市培英實驗設備有限公司；恒溫生化培養(yǎng)箱LRH-70，上海一恒科學儀器有限公司；可見分光光度計VCX130，蘇州索尼克超聲科技有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器LS-35HD，江陰濱江醫(yī)療設備有限公司；酶標儀MULTISKAN MK3、SEM掃描電鏡Q45，賽默飛世爾科技（中國）有限公司；掃描差熱分析儀Q20，沃特世科技（上海）有限公司。

1.1.2 試驗材料 燕麥麩皮，市售；枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）AS1.892、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）CGMCC1.807、糠秕馬拉色菌（Malassezia furfur）ATCC4434、大腸埃希菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄鏈球菌（Staphylococcus aureus）：北京生物保藏中心；高活性干酵母（Saccharomyces）：安琪酵母股份有限公司；酵母浸粉、蛋白胨、胰蛋白胨、瓊脂：北京奧博星生物技術(shù)；葡萄糖、七水合硫酸亞鐵、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉：福晨化學試劑有限公司；堿性蛋白酶Alcalase 3.07（1.8×105U/g）：諾維信Novozymes；纖維素酶（1.0×105U/g）：山東隆科特酶制劑有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）：梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司；3-乙基-2-亞硝基亞胺-2,3苯噻唑（ABTS）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；L-抗壞血酸（維生素C, Vc）：北京索萊寶科技有限公司；過氧化氫：北京化工廠；水楊酸：北京博奧拓達科技有限公司；十二烷基醚硫酸鈉（SLES）：山東金麗源化工科技有限公司；標準發(fā)束17 cm × 1.5 cm、蓬松發(fā)束27 cm × 1.0 cm。

1.1.3 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基（g/L）：胰蛋白胨10.0、酵母浸出粉5.0、氯化鈉10.0；Leeming & Notman培養(yǎng)基（g/L）［12］：蛋白胨10.0、葡萄糖10.0、酵母浸粉1.0、牛膽鹽4.0、甘油1.0、單硬脂酸甘油酯0.5、吐溫60（聚氧乙烯山梨醇酐單硬脂酸酯）1.0、全脂奶10.0、橄欖油40.0、氯霉素0.5。

1.2 方法

1.2.1 熱提取法制備β-葡聚糖提取液（heating extract, HE） 燕麥β-葡聚糖提取采用熱提法［8］。取燕麥麩皮5 g，加105 mL蒸餾水（料液比1∶21）于250 mL燒杯中，攪拌混合使料液成均勻分散體系，用濃度1 mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至10.9，將料液置于85℃水浴中攪拌加熱1.9 h。提取結(jié)束后用濃度1 mol/L的HCl溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0，離心取上層液，定容至100 mL。

1.2.2 酶解法制備多肽提取液（enzyme extract,EE） 燕麥多肽提取采用酶解法提?。?3］。取燕麥麩皮5 g，加50 mL蒸餾水（料液比1∶10）于250 mL燒杯中，添加纖維素酶15 mg與堿性蛋白酶150 mg，攪拌混合使料液呈均勻分散體系，用1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至9.0-9.5。60℃水浴攪拌加熱3 h后，用濃度1 mol/L的HCl溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0，離心取上層清液，定容至50 mL。

1.2.3 菌種接種比確認 在料液比為1∶10的燕麥麩皮培養(yǎng)基中分別以2%（體積分數(shù)）的總接種量接種枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌與酵母菌的菌液進行發(fā)酵培養(yǎng)，接種比例保持（枯草芽孢桿菌∶地衣芽孢桿菌）∶酵母菌=2∶1，其中枯草芽孢桿菌∶地衣芽孢桿菌分別為9∶1、7∶3、5∶5、3∶7和1∶9；發(fā)酵過程中第2、4、6、8、10、12、18、24、30和36小時取發(fā)酵液稀釋一定倍數(shù)，涂布至LB培養(yǎng)基中統(tǒng)計菌落形成單位（CFU），每組實驗設3個平行。

1.2.4 燕麥麩皮發(fā)酵液（fermented extract, FE）制備與發(fā)酵工藝優(yōu)化

1.2.4.1 單因素實驗 選取發(fā)酵時間（18、24、30、36、42和48 h）、接種量［1%、2%、3%、4%、5%和6%（體積分數(shù)）］、料液比（1∶5、1∶7.5、1∶10、1∶15、1∶20和1∶30）和發(fā)酵溫度（28、30、32、34、36和48℃）為單因素，其他條件保持一致，發(fā)酵結(jié)束后再次滅菌，用濃度1 mol/L的HCl溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0，離心取上層清液定容至30 mL，每組實驗設3個平行。

1.2.4.2 正交試驗 在單因素試驗的基礎上，進行四因素三水平正交試驗，正交試驗因素水平如表1所示。

表1 正交試驗設計Table 1 Orthogonal experimental design

1.2.5 多肽得率測定 采用雙縮脲法檢測多肽含量。取18支試管分3組，分別加入0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mL的10 mg/mL標準牛血清蛋白溶液，用蒸餾水補足到1 mL，加入4 mL雙縮脲試劑A液與0.2 mL雙縮脲試劑B液。充分搖勻后室溫（20-25℃）放置30 min，于540 nm波長下測定吸光度。未加蛋白質(zhì)溶液作為空白對照液。以蛋白含量為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線。

多肽得率計算公式

式中 C：多肽的質(zhì)量濃度（mg/mL）；V：樣品總體積（mL）；m：燕麥麩皮質(zhì)量（g）。

1.2.6 β-葡聚糖得率測定 采用剛果紅法檢測β-葡聚糖含量［14］。取18支試管分3組，分別加入0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mL的0.1 mg/mL β-葡聚糖標準溶液，用蒸餾水補足到2.0 mL，加4.0 mL剛果紅溶液搖勻后室溫（20-25℃）放置10 min，于550 nm波長下測定吸光度，以0號管中反應液作空白調(diào)零。取測定的平均值，以葡聚糖的含量為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線。β-葡聚糖得率計算公式如下：

式中 C：葡聚糖的質(zhì)量濃度（mg/mL）；V：樣品總體積（mL）；m：燕麥麩皮質(zhì)量（g）。

1.2.7 抗氧化活性測定

1.2.7.1 DPPH·清除活性的測定［15］將發(fā)酵液、葡聚糖提取液、多肽提取液用蒸餾水配制成濃度為1、5、10、25、50、100、200、400、800 mg/mL的溶液。選取0.1 mg/mL的維生素C溶液作為陽性對照。取2 mL不同濃度的樣液與2 mL DPPH溶液加入離心管充分混合，室溫下避光反應30 min，離心1 min，取上層清液于517 nm測定吸光值A。計算公式如下：

式中，A0為DPPH溶液+無水乙醇在波長517 nm處吸光度；A1為DPPH溶液+樣品溶液在波長517 nm處吸光度；A2為無水乙醇+樣品溶液在波長517 nm處吸光度。

1.2.7.2 ABTS清除活性的測定 溶液配制同1.2.7.1。選取0.4 mg/mL的維生素C溶液作為陽性對照。取200 μL樣品加入10 μL ABTS溶液，室溫下靜置6 min，于734 nm測定吸光值A。計算公式如下：

式中，A0為ABTS溶液+蒸餾水在波長734 nm處吸光度；A1為ABTS溶液+樣品溶液在波長734 nm處吸光度；A2為蒸餾水+樣品溶液在波長734 nm處吸光度。

1.2.7.3 羥自由基清除活性測定 各組樣品溶液濃度為10、15、25、50、100、200、400、800 mg/mL。選取2.0 mg/mL的維生素C溶液作為陽性對照。取200 μL樣品于536 nm測定吸光值A。計算公式如下：

式中，A0為蒸餾水+ FeSO4溶液+ H2O2溶液+水楊酸溶液在波長536 nm處吸光度；A1為樣品溶液+ FeSO4溶液+ H2O2溶液+水楊酸溶液在波長536 nm處吸光度；A2為樣品溶液+FeSO4溶液+蒸餾水+水楊酸溶液在波長536 nm處吸光度。

1.2.8 抑菌活性測定

1.2.8.1 菌懸液制備 將金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌接于LB培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)18 h取出，使用無菌水調(diào)整菌懸液濃度約106-107CFU/mL，取馬拉色菌接種于Leeming & Notman培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)5 d取出，使用無菌水調(diào)整菌懸液濃度約106-107CFU/mL。

1.2.8.2 抑菌圈的測定 通過紙片法測定提取物對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、馬拉色菌的抑菌圈直徑。吸取100 μL菌懸液滴加到對應的瓊脂平板上涂布均勻，待其表面無水后用無菌鑷子將直徑6 mm的滅菌濾紙片貼附于培養(yǎng)基上，吸取20 μL燕麥麩皮提取液滴至濾紙片上，對照組使用等量無菌水。金黃色葡萄鏈球菌、大腸埃希菌37℃培養(yǎng)18 h，馬拉色菌37℃培養(yǎng)5 d后取出，測量抑菌圈直徑，每組做5個平行。

1.2.8.3 最小抑菌濃度測定［16］將梯度稀釋的提取液與瓊脂培養(yǎng)基等體積混合，制備遞減濃度抑菌藥物平板，然后把細菌點種在培養(yǎng)基的表面，金黃色葡萄鏈球菌、大腸埃希菌37℃培養(yǎng)18 h，馬拉色菌37℃培養(yǎng)5 d，抑制受試菌種生長的最低抑菌物質(zhì)濃度，即為最小抑菌濃度。

1.2.9 發(fā)用功效評價

1.2.9.1 光澤度改善 將發(fā)束用10% SLES進行基礎清洗，平衡干燥后，使用光澤度測試儀測量發(fā)束的光澤度參數(shù)值，每束發(fā)束均勻測量10次。隨后再以10% SLES進行清洗。樣品組取約0.2 g樣品均勻涂抹于發(fā)束上，對照組使用等量蒸餾水操作，揉搓1 min，停留10 min，蒸餾水洗凈。完成后將發(fā)束懸掛在（26±2）℃，（60±10）%相對濕度的恒溫恒濕室中干燥平衡24 h，再次測量發(fā)束的光澤度參數(shù)值10次。

1.2.9.2 修護毛鱗片能力 發(fā)束處理與樣品使用方法與1.2.9.1相同，從經(jīng)處理發(fā)束中隨機取10-20根發(fā)絲，對發(fā)絲進行電鏡掃描。

1.2.9.3 干梳理性 發(fā)束處理與樣品使用方法與1.2.9.1相同，使用頭發(fā)多功能測試系統(tǒng)（Combing）進行發(fā)束的干梳測試，記錄干梳理功與干梳理最大負荷，每個樣品重復5次。

1.2.9.4 α-角蛋白還原能力 發(fā)束處理與樣品使用方法與1.2.9.1相同，將發(fā)束切割成1.0 mm左右的片段，選取15組發(fā)束片段，使用掃描差熱分析（DSC）儀測試頭發(fā)的DSC曲線，獲得吸收峰峰值溫度（Td）和平均吸收峰面積（△Hd），并計算相對螺旋含量（RHC），RHC越小，頭發(fā)受損程度越大：

1.2.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 實驗所得數(shù)據(jù)結(jié)果均以“mean±SD”的形式表示，使用正交設計助手軟件進行正交設計與分析，利用OriginPro 2021軟件對試驗結(jié)果進行整理作圖、IC50計算和顯著性分析。

2 結(jié)果

2.1 提取工藝優(yōu)化

2.1.1 菌種接種比優(yōu)化 如圖1所示，在所有接種比例下，地衣芽孢桿菌生長曲線為經(jīng)典S形，但有較長遲滯期，均在8 h活菌數(shù)最少，隨后菌量再次增長。發(fā)酵液黏度在發(fā)酵3 h后下降，鑒于此時僅枯草芽孢桿菌生長，應為該菌產(chǎn)生的蛋白酶快速降解料液中蛋白質(zhì)導致，溶氧量增加枯草芽孢桿菌數(shù)量快速上升但很快被抑制，后期不同接種比的枯草芽孢桿菌均出現(xiàn)第二次生長。增加地衣芽孢桿菌接種比例，當枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌接種比7∶3時，兩菌種的活菌數(shù)在發(fā)酵后期都能達到最大（圖1-B）。然而，進一步增加地衣芽孢桿菌接種比，并沒有縮短遲滯期，且兩菌種的活菌數(shù)均有所下降，可能是燕麥麩皮中β-葡聚糖的釋放，增加了料液黏稠度，減緩菌種繁殖速度和生物量。菌種生長受多方面因素影響，從生長曲線觀察在枯草芽孢桿菌與地衣芽孢桿菌接種比7∶3時，兩菌種均有相對較好的活力，后續(xù)將選用7∶3接種比對燕麥麩皮進行發(fā)酵提取。

圖1 枯草芽孢桿菌與地衣芽孢桿菌在接種比9∶1（A）、7∶3（B）、5∶5（C）、3∶7（D）和1∶9（E）時的生長曲線Fig.1 Growth curves of Bacillus subtilis and Bacillus licheniformis in inoculation proportion of 9∶1（A）, 7∶3（B）,5∶5（C）, 3∶7（D）and 1∶9（E）

2.1.2 提取工藝條件優(yōu)化 隨發(fā)酵時間的延長，燕麥多肽及燕麥β-葡聚糖得率均上升，36 h時葡聚糖得率達到最高得率5.23%，42 h時燕麥多肽得率達到最高得率14.33%（圖2-A），之后隨發(fā)酵時間延長，得率持平不再上升，發(fā)酵至42 h時反應已充分，繼續(xù)延長時間得率也不再提升。當總接種量為2%（體積分數(shù)）時，多肽和β-葡聚糖得率均達到最高，分別為15.33%和5.21%，其中多肽得率呈現(xiàn)出先上升再下降的趨勢（圖2-B）。發(fā)酵溫度30℃時，多肽和β-葡聚糖得率均達到最高，分別為15.36%和5.30%（圖2-C），此時枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和酵母菌均處于相對適宜的生長溫度。當料液比為1∶7.5時，多肽得率、β-葡聚糖得率均達到最大，分別為15.62%和5.84%（圖2-D），當料液比由1∶7.5降至1∶10時，得率開始下降，原因或為料液過稀不能為菌種提供足夠營養(yǎng)從而影響提取效率。

圖2 發(fā)酵時間、接種量、溫度和料液比對多肽、β-葡聚糖得率的影響Fig.2 Effects of fermentation time, inoculation volume, temperature and solid-liquid ratio on peptides and β-glucan yield

2.1.3 正交試驗結(jié)果 正交結(jié)果如表2所示。由極差分析可知，料液比A、發(fā)酵溫度B、發(fā)酵時間C、接種量D對得率的影響大小依次為A＞D＞C＞B，最佳工藝條件為料液比1∶7.5，發(fā)酵溫度30℃，發(fā)酵時間42 h，接種量3%（A2B2C3D2），后經(jīng)實驗驗證，該條件下制備發(fā)酵液多肽得率16.21%，β-葡聚糖得率5.98%。

表2 正交試驗結(jié)果及分析Table 2 Orthogonal test results and analysis

2.1.4 不同提取方法多肽、β-葡聚糖得率對比 如圖3所示，熱提取法和酶解法僅對一種功能因子有較高的提取效率，發(fā)酵提取可同時高效提取多肽和β-葡聚糖。葡聚糖提取液黏稠度高，澄清度較低；多肽提取液有較明顯的苦臭味，輕微渾濁，上層有難處理的漂浮物；發(fā)酵液呈琥珀色，透明澄清，有類似水果香氣，或因酵母在發(fā)酵過程中消耗原料中淀粉等物質(zhì)，改善感官品質(zhì)。

圖3 不同提取方法多肽、β-葡聚糖得率對比Fig.3 Comparison of peptide and β-qlucan yields by different extraction processes

2.2 抗氧化活性

2.2.1 DPPH清除率 如圖4-A所示，葡聚糖提取液、多肽提取液與發(fā)酵液對DPPH自由基均具有較為顯著的清除作用，發(fā)酵液的清除率最高達到89.00%。在50-200 mg/mL范圍內(nèi)，發(fā)酵液對DPPH自由基的清除率由19.53%上升至73.09%。圖4-B反映了不同提取液對DPPH自由基的IC50值，發(fā)酵液IC50值為89.35 mg/mL，低于0.1 mg/mL維生素C（135.80 mg/mL），具有顯著性差異（P＜0.001）。

圖4 不同提取方法DPPH清除率與IC50對比Fig.4 Comparison of DPPH clearance rate and IC50 under different extraction methods

2.2.2 ABTS清除率 如圖5-A所示不同提取液對ABTS均具有較為顯著的清除作用，發(fā)酵液與多肽提取液的清除率均達到99.40%。在濃度50 mg/mL 時，發(fā)酵液對ABTS的清除率即達到75.02%，且在0-200 mg/mL濃度范圍內(nèi)，清除率高于其他組。圖5-B反映了不同提取液對ABTS的IC50值，發(fā)酵液的IC50值為1.315 mg/mL，顯著低于0.4 mg/mL維生素C（2.366 mg/mL）。

圖5 不同提取方法ABTS清除率與 IC50 對比Fig.5 Comparison of ABTS clearance rate and IC50 under different extraction methods

2.2.3 羥自由基清除率 如圖6-A所示不同提取液對羥自由基均有清除作用，發(fā)酵液的清除率達到93.00%，與2.0 mg/mL的維生素C相當。圖6-B反映了不同提取液對羥自由基的IC50值，發(fā)酵液的IC50值為91.26 mg/mL，低于2.0 mg/mL維生素C的107.74 mg/mL。

圖6 不同提取方法的羥自由基清除率與 IC50 對比Fig.6 Comparison of hydroxy radical scavenge rates and IC50 under different extraction methods

2.3 抑菌活性

由表3可知，葡聚糖未顯現(xiàn)抑菌性。多肽提取液對金黃色葡萄鏈球菌的MIC為6.25 mg/mL，對大腸埃希菌的MIC為6.25 mg/mL，而對馬拉色菌的MIC為1.56 mg/mL；發(fā)酵液對金黃色葡萄鏈球菌的MIC為6.25 mg/mL，對大腸埃希菌的MIC為3.12 mg/mL，而對馬拉色菌的MIC為6.25 mg/mL。相比于其他方法，發(fā)酵提取液對3種細菌的抑菌圈直徑均最大，結(jié)合對于3種細菌的抑菌圈直徑分析，發(fā)酵液對于3種菌的抑菌性高于多肽提取液，對金黃色葡萄鏈球菌的抑制低于大腸埃希菌與馬拉色菌。

2.4 發(fā)用功效評價

2.4.1 光澤度分析結(jié)果 如圖7所示，經(jīng)不同提取液處理的發(fā)絲較對照組相比，光澤度變化值提升均具有顯著差異（P＜0.001），具有改善發(fā)束光澤度的效果。發(fā)酵液較低于葡聚糖提取物與多肽提取物，或因葡聚糖提取物與多肽提取物中含較大分子量的燕麥蛋白，可附著于發(fā)絲表面，改善發(fā)絲光澤度與柔順度。

圖7 不同提取液浸漬發(fā)絲光澤度變化Fig.7 Changes in the glossiness of hair soaked with different extract

2.4.2 干梳理性改善效果分析 通過圖8頭發(fā)多功能測試系統(tǒng)分析結(jié)果可以看出，葡聚糖提取液、多肽提取液與發(fā)酵液的干梳理功（圖8-A）和干梳理最大載荷（圖8-B）小于對照組且結(jié)果均具有顯著差異，表示測試樣品具有改善發(fā)束干梳梳理、減少打結(jié)的效果。3組之間干梳理最大載荷和干梳理功差異不顯著。

圖8 不同提取液浸漬發(fā)絲干梳理功（A）與干梳理最大負荷（B）Fig.8 Dry carding work（A）and maximum load（B）of dry carding for hair soaked with different extract

2.4.3 α-角蛋白還原能力分析 頭發(fā)α-角蛋白DSC曲線在230-250℃有一個被標記為α-螺旋峰的吸熱峰，峰值溫度（Td）被定義為α-螺旋峰的變性溫度；峰的面積（△Hd）表示為變性焓，指的是α-螺旋峰變性所需的能量（每克干發(fā)吸收的熱量），△Hd用于計算相對螺旋含量，峰面積越小，α-角蛋白受損程度越大。如圖9所示，經(jīng)葡聚糖提取液、多肽提取液與發(fā)酵液處理的發(fā)絲的α-螺旋峰的變性溫度較對照組均有提升，RHC分別為95.04%、86.02%、100.01%，相比于對照組均體現(xiàn)出對α-角蛋白的還原能力，對受損發(fā)質(zhì)起到修復作用，其中燕麥麩皮發(fā)酵液修復力最顯著。

圖9 不同提取液浸漬發(fā)絲相對螺旋含量Fig.9 Relative helix content of hair soaked with different extract

2.4.4 毛鱗片修復能力分析 SEM 是應用電子束在樣品表面掃描激發(fā)二次電子成像的電子顯微技術(shù)。由于它的高分辨率，運用其對頭發(fā)表面的形貌進行分析，可以直觀檢測頭發(fā)受損程度。

通過電鏡掃描圖片分析可以看出，對照組（圖10-A）經(jīng)水洗處理，觀察到以下形態(tài)學變化：毛鱗片的邊緣輕微鋸齒狀，可見裂縫，有角質(zhì)脫落的現(xiàn)象。圖10-B-D顯示，3種提取液處理發(fā)絲后，頭發(fā)具有完整、緊密重疊的毛鱗片層，能夠清晰地分辨毛鱗片的形狀和方向，毛鱗片外翻有不同程度減輕，無局部剝落。3組測試樣品對損傷發(fā)束的毛鱗片（毛鱗片閉合程度）有修護效果，發(fā)酵液組毛鱗片邊緣閉合程度最高，對毛鱗片閉合效果最顯著。

圖10 經(jīng)蒸餾水（A）、葡聚糖提取液（B）、多肽提取液（C）和發(fā)酵液（D）浸提發(fā)絲的掃描電鏡圖Fig.10 SEM images of hairs soaked with distilled water（A）, glucan extract（B）, peptide extract（C）and fermentation extract（D）

3 討論

3.1 菌種與接種比例的選取

試驗選用枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和酵母菌聯(lián)用發(fā)酵。單一的枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌產(chǎn)生的蛋白酶均可以將不可溶蛋白分解成肽，改變其營養(yǎng)結(jié)構(gòu)，提高蛋白質(zhì)的利用效率，將這兩種菌的發(fā)酵程度結(jié)合在一起，既能充分降解麩皮中的蛋白質(zhì)，又能維持在一定的碳源、氮源消耗。酵母可提升谷物類發(fā)酵液澄清度和氣味等方面的感官品質(zhì)［17］，并幫助燕麥麩皮細胞破壁，提高β-葡聚糖提取率。實驗需要考慮酵母β-葡聚糖的影響，酵母菌細胞壁中同樣存在的β-葡聚糖也可通過剛果紅法進行檢測。但酵母菌不易破壁，且酵母β-葡聚糖一般條件下不易溶于水，酵母β-葡聚糖溶出至發(fā)酵液中的可能性較低。為排除酵母β-葡聚糖的干擾進行了兩組對照實驗，一組以酵母膏胨葡萄糖培養(yǎng)基單獨培養(yǎng)酵母菌，另一組將燕麥麩皮換為營養(yǎng)成分類似但β-葡聚糖含量低的綠豆，以相同工藝條件接入枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌與酵母菌制備綠豆發(fā)酵液，經(jīng)高溫滅菌后的兩組通過剛果紅法均未檢出β-葡聚糖，判斷該發(fā)酵工藝流程不能溶出酵母菌細胞壁中的β-葡聚糖，即所得燕麥麩皮發(fā)酵液中β-葡聚糖均來自燕麥。

混合發(fā)酵過程較為復雜，通過最終產(chǎn)物得率不能全面掌握菌種生長狀況。為獲得菌種聯(lián)用更好的發(fā)酵效果，需了解不同比例接種條件下，在發(fā)酵過程中各時段的不同菌種的活菌數(shù)以評價生長情況，并以此確定最低的發(fā)酵時間。酵母菌的生長周期比枯草芽孢桿菌與地衣芽孢桿菌長，且生長穩(wěn)定，因此試驗中固定酵母菌接種量，以（枯草芽孢桿菌＋地衣芽孢桿菌）∶酵母菌=2∶1 的比例進行實驗，最終確定3個菌種的接種比例。菌種比例確定的實驗中發(fā)現(xiàn)，初期枯草芽孢桿菌數(shù)量快速上升時，蛋白酶降解形成的多肽具有一定的抑菌性，因此枯草芽孢桿菌生長受到抑制，但隨著多肽進一步降解為更小分子小肽，抑菌作用有所減弱，枯草芽孢桿菌出現(xiàn)第二次生長。另外，地衣芽孢桿菌對枯草芽孢桿菌的生長存在一定的拮抗［18］，提升地衣芽孢桿菌的接種比例時，枯草芽孢桿菌數(shù)量被持續(xù)抑制。

3.2 發(fā)酵工藝優(yōu)化結(jié)果分析

目前對于發(fā)酵提取工藝條件的優(yōu)化大多數(shù)采用單因素實驗結(jié)合正交試驗，可以快速準確地得到優(yōu)化條件。實驗通過優(yōu)化料液比、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、接種量，發(fā)酵提取燕麥多肽與燕麥β-葡聚糖得率分別達到16.21%和5.98%。通過正交試驗結(jié)果可知，料液比的影響最為明顯，料液比是影響細胞內(nèi)外滲透壓的主要因素，適當料液比利于活性成分溶出［19］，又能節(jié)約溶劑［20］。其次為接種量，接種量對發(fā)酵過程中各菌種的數(shù)量和生長狀況有較大影響，當液體發(fā)酵培養(yǎng)基固定的情況下，接種量過高會使培養(yǎng)基總營養(yǎng)物質(zhì)不足導致接入的菌種生長代謝受到很大的限制，對發(fā)酵過程中的促進作用減弱［21］。

將發(fā)酵法與熱提取β-葡聚糖、酶解提取燕麥多肽工藝對比，根據(jù)統(tǒng)計學分析，發(fā)酵提取法單一的燕麥多肽與燕麥β-葡聚糖的得率與熱提取葡聚糖和酶解提取燕麥多肽相比無顯著差異，但考慮燕麥β-葡聚糖和燕麥多肽綜合得率，發(fā)酵提取分別比熱提取和酶解提取得率提高195.7%和35.81%。

3.3 發(fā)酵過程對活性的影響

多菌種聯(lián)用發(fā)酵可同時提取燕麥多肽與燕麥β-葡聚糖，且發(fā)酵過程提高了燕麥麩皮提取物的抗氧化活性。燕麥多肽可通過清除自由基、減少脂肪過氧化氫含量和螯合金屬離子來發(fā)揮其抗氧化活性［22］；燕麥β-葡聚糖因其具有較強的吸附小分子的能力，能和多酚通過氫鍵、疏水相互作用等結(jié)合，形成的多糖多酚復合物能為機體提供更持久的抗氧化能力［6］，同時還能增加谷胱甘肽還原酶、谷胱甘肽過氧化物酶和超氧化物歧化酶活的活性，減少脂質(zhì)過氧化［23-24］。發(fā)酵過程通過破壞燕麥麩皮細胞壁，釋放多酚類物質(zhì)［25］，與β-葡聚糖結(jié)合，相比單獨的β-葡聚糖、多肽提取液，表現(xiàn)出更好的抗氧化性。

通過抑菌活性實驗了解到，發(fā)酵液對于金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌與馬拉色菌的抑制作用均顯著優(yōu)于多肽提取液。金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌是皮膚感染中最常見的病原菌［26］。馬拉色菌是引起頭屑問題的主要菌種［27］，抑制馬拉色菌是目前減少頭屑問題的主要方法。葡聚糖提取液中含有少量蛋白，但未經(jīng)水解不具備抑菌活性。一方面發(fā)酵過程對抑菌肽活性具有一定促進作用，另一方面酵母發(fā)酵幫助釋放燕麥麩皮中的多酚類物質(zhì)，也起到了一定的抑菌作用［28］。

燕麥中的功能成分常應用到護發(fā)類化妝品中［29］。實驗對發(fā)酵液進行發(fā)用功效評價，發(fā)用功效評價較多采用離體真人發(fā)絲模擬的方法，通過對頭發(fā)纖維的形貌、結(jié)構(gòu)、化學成分和機械性能等的改變對功效進行量化評估［30］。通過實驗了解到，相比于葡聚糖提取液和多肽提取液，發(fā)酵液還原α-角蛋白，閉合毛鱗片的效果更為顯著，或源于發(fā)酵過程降低了葡聚糖與多肽的分子量，更利于發(fā)絲對于功效成分的吸收，而大分子聚合物更有利于提升發(fā)絲的光滑度與光澤度［31］。

此工藝制得的燕麥麩皮發(fā)酵液在護發(fā)方面具有較好的開發(fā)應用前景，但試驗僅研究了原料提取液和發(fā)酵液的一些生化指標和對比功效評價，可將本文所得到的提取工藝與其他儀器分析方法相聯(lián)合，對原料中的有效成分進行分離、純化及結(jié)構(gòu)鑒定，對比分析是否通過微生物的作用產(chǎn)生了新的活性物質(zhì)，研究其發(fā)酵后功效增強的原因以及作用機理，以達到綜合開發(fā)利用的目的。

4 結(jié)論

使用枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和酵母菌聯(lián)用發(fā)酵燕麥麩皮可同時提取燕麥β-葡聚糖與燕麥多肽，最佳工藝條件為料液比1∶7.5、溫度30℃、接種量2%、發(fā)酵時間42 h。發(fā)酵液可有效清除DPPH、ABTS和羥自由基，具有抗氧化能力；對大腸埃希菌、金黃色葡萄鏈球菌和馬拉色菌有抑制效果；具有一定護發(fā)效果，在修護毛鱗片與α-角蛋白還原方面更顯著，為采用發(fā)酵工藝制備燕麥麩皮提取液在護發(fā)方面的應用提供參考。