EZH2 抑制劑與膀胱癌GC 化療藥物聯(lián)用增敏的作用研究

謝 峻 ，劉紹有 ，施鴻金 ，毛秋玉 ，楊 宏

（1）昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院泌尿外科，云南 昆明 650101;2）云南省腫瘤醫(yī)院泌尿外科，云南 昆明 650118）

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，在男性中，其發(fā)病率據(jù)統(tǒng)計(jì)位于第十位，且發(fā)病率和病死率根據(jù)調(diào)查結(jié)果顯示在近幾年也呈逐年攀升的趨勢(shì)，情況不容樂觀[1]。在膀胱癌中其最重要的病理類型經(jīng)研究為尿路上皮癌，膀胱癌患者的預(yù)后較差的原因主要為其早期缺乏特異性癥狀，由于腫瘤的轉(zhuǎn)移導(dǎo)致部分患者就診時(shí)已進(jìn)入中晚期，行手術(shù)及放化療等治療手段療效較差。因此，開發(fā)靶向治療藥物是阻止膀胱癌病情惡化的關(guān)鍵。EZH2 經(jīng)研究得知屬于多梳蛋白抑制復(fù)合物家族成員，該基因主要參與調(diào)控多種靶基因沉默并催化組蛋白H3 的甲基化過程。研究表明，EZH2 與膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌、腎細(xì)胞癌、肺癌、子宮內(nèi)膜癌、膠質(zhì)瘤等一系列腫瘤的惡性發(fā)生與發(fā)展關(guān)系極為密切[2-8]。并且越來越多的證據(jù)表明了EZH2 抑制劑在多種癌癥中化療增敏作用[9]。因此這些研究提示EZH2 抑制劑可以作為癌癥化療增敏新靶點(diǎn)，使得EZH2 抑制劑成為化療方案中重要的輔助策略。但是目前EZH2 抑制劑在膀胱癌GC 化療中的研究仍然較少。因此本研究首次探討EZH2 抑制劑在尿路上皮癌（urothelial cell carcinoma，UCC）治療與GC 化療方法聯(lián)合治療時(shí)的重要作用，將為臨床指導(dǎo)用藥方面提供理論基礎(chǔ)，并且對(duì)于UCC 患者的GC 化療方案提供新的輔助，最終為膀胱癌的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

人膀胱癌T24 細(xì)胞，GC 化療藥物（1 μM 順鉑+1.56 μM 吉西他濱），5 種EZH2 抑制劑（GSK126，UNC1999，DZNep1，EI1 和EPZ005687），EZH2 抑制劑的溶媒緩沖液、吉西他濱、UNC1999 與順鉑均由細(xì)胞平臺(tái)提供，引物設(shè)計(jì)為 Beacon Designer 7.90，引物合成為廣州invitrogen RPMI 1640。谷氨酰胺、基礎(chǔ)培養(yǎng)基、青鏈霉素（雙抗）、胎牛血清、0.25%胰酶均購自Gibco 公司，30%過氧化氫溶液（西隴化工），TritonX-100（Vetec V900502），PBS 緩沖液（北京中杉ZLI-9061），DAB 顯色試劑盒（北京中杉 ZLI-9018），恒溫干燥箱與自動(dòng)消毒鍋均由SANYO 公司提供。兔抗人EZH2 單克隆抗體、GAPDH 抗體購自Abmart 公司；羊抗人HRP 標(biāo)記IgG 二抗購自CST 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

BALB/C 裸鼠30 只，雌，體重（18±4）g，購自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（京）2019-0010。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 EZH2 siRNA 的設(shè)計(jì)合成及篩選該實(shí)驗(yàn)根據(jù)3 條不同的siRNA 分別為siEZH2-1/-2/-3。進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分組，分為T24 細(xì)胞正常培養(yǎng)、T24 細(xì)胞+si NC、T24 細(xì)胞+si-EZH2 1、T24 細(xì)胞 +siEZH2-2 和T24 細(xì)胞+siEZH2-3 5 個(gè)組。然后將T24 細(xì)胞用0.25%胰酶消化收集細(xì)胞，去上清后1 mL 完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，按照每個(gè)孔接種5×104個(gè)細(xì)胞將細(xì)胞接種在6 孔板中，每組接種6 重復(fù)，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到50%～60%時(shí)，按照分組轉(zhuǎn)染si NC、siEZH2，以riboFECT? CP 作為轉(zhuǎn)染試劑，轉(zhuǎn)染濃度為50 nM；稀釋 riboTRACER?：用不含雙抗的完全培養(yǎng)基將10X riboFECT? CP Buffer（v1）稀釋成1X 的riboFECT?CP Buffer（v2）；按照每孔用120 μL v2 加20 μM 的riboTRACER? Fluorescent Oligo（Green）儲(chǔ)存液（v3）5 μL，輕輕混勻。合液制備：加入 12 μL riboFECT? CP Reagent（v4），輕輕吹打混勻，室溫孵育 0～15 min，制備 riboFECT? CP 混合液。根據(jù)以上siRNA 轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染24 h 后，收集細(xì)胞，每組3 重復(fù)提取RNA，進(jìn)行后續(xù)qPCR 檢測(cè)；每組剩余3 重復(fù)，提取蛋白，進(jìn)行后續(xù)WB 檢測(cè)。

1.3.2 RT-qPCR收集5 組細(xì)胞，分別為對(duì)照組（T24 細(xì)胞正常培養(yǎng)）、si-NC 組（T24 細(xì)胞+si NC）、si-EZH2 1 組（T24 細(xì)胞+siEZH2-1）、siEZH2-2 組（T24 細(xì)胞+siEZH2-2）與siEZH2-3組（T24 細(xì)胞+siEZH2-3），細(xì)胞總RNA 利用TRIzol 法提取，瓊脂糖凝膠電泳鑒定，酶標(biāo)儀測(cè)定RNA 濃度，待逆轉(zhuǎn)錄成cDNA 進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng)，EZH2 引物序列見表1。按照試劑盒說明書設(shè)定20 μL 反應(yīng)體系：反應(yīng)條件主要為以下3 步：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性10 s 與退火&延伸60 ℃ 30 s，共40～45 個(gè)循環(huán)，最終使用 2-ΔΔCT法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 EZH2 引物序列Tab.1 Primer sequences of EZH2

1.3.3 Western blot各組細(xì)胞加入細(xì)胞裂解液，蛋白樣品即為離心所得上清液。用BCA 蛋白檢測(cè)試劑盒用于測(cè)定各組蛋白濃度，待蛋白定量變性后進(jìn)行SDS-PAGE 分離蛋白，電泳后迅速轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，使用5%脫脂牛奶TBST 溶液中室溫封閉1 h，分別以抗EZH2（1∶1 000）和GAPDH 抗體（1∶4 000）為一抗，4 ℃處理過夜，TBST 洗滌3 次后，以HRP 標(biāo)記IgG 為二抗（1∶4 000）室溫處理2 h，之后加入ECL 顯色劑顯色，在暗室中通過膠片曝光，膠片顯影及定影，最后用掃描儀掃描記錄膠片上蛋白印跡的變化。

1.3.4 CCK-8 試驗(yàn)將細(xì)胞按5×103個(gè)/孔接種于96 孔板，每組設(shè)6 個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng) 24～ 96 h；當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到50%～60%時(shí)，按照分組轉(zhuǎn)染si EZH2 或加入抑制劑處理24 h 后，加入GC 化療藥物（1 μM 順鉑+1.56 μM 吉西他濱）處理2 h，之后更換不含GC 化療藥物培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h和48 h 后進(jìn)行CCK-8 檢測(cè)。然后于每個(gè)設(shè)定的時(shí)間點(diǎn)每孔加入10 μL CCK-8 溶液孵育2 h；酶標(biāo)儀于450 nm 波長處檢測(cè)吸光度（OD）值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.5 平板克隆實(shí)驗(yàn)與Annexin V-FITC/PI 凋亡實(shí)驗(yàn)將轉(zhuǎn)染細(xì)胞按1×103/孔接種于6 孔板培養(yǎng)，每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)10 d 后，用4%多聚甲醛溶液固定，用結(jié)晶紫染色，倒置顯微鏡（×40）觀察克隆形成情況并拍照。細(xì)胞接種于6 孔板，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期后，收集細(xì)胞，PBS 重懸，?。?～10）×104個(gè)重懸細(xì)胞，1 000 r/min 離心5 min，棄上清，加入195 μL Annexin V-FITC 結(jié)合液重懸細(xì)胞，加入5 μL Annexin V-FITC 混勻，室溫避光孵育10 min，1 000 r/min 離心 5 min，棄上清，加入 10 μL PI，輕輕混勻，冷浴避光放置，上流式細(xì)胞儀（BD FACSVerse）檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.6 移植瘤裸鼠模型的建立與觀察按實(shí)驗(yàn)要求進(jìn)行分組，將BALC/c 裸鼠隨機(jī)分為5 組，每組6 只。5 組分別為對(duì)照組（T24 細(xì)胞正常培養(yǎng)）、溶媒緩沖液組（T24 細(xì)胞+100 μL UNC1999 溶媒緩沖液）、GC 化療組（裸小鼠+T24 細(xì)胞+GC 化療組）、UNC1999 組（裸小鼠+T24 細(xì)胞 +UNC1999）、UNC1999+GC 化療組（裸小鼠+T24細(xì)胞+UNC1999+GC 化療）在各組BALB/C 裸鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，開始接種細(xì)胞，多次接種直到瘤體長出為止，瘤體長出后開始測(cè)量瘤體，培養(yǎng)至瘤體大小為50 mm3左右，開始給藥處理。UNC1999 給藥：腹腔注射50 mg/kg，每只給藥量1 mg；吉西他濱：腹腔注射40 mg/kg，每只給藥量0.8 mg；順鉑：腹腔注射60 mg/kg，每只給藥量1.2 mg。第2 周與4 周時(shí)分別處死裸鼠，完整取出皮下腫瘤后稱其質(zhì)量。

1.3.7 免疫組化染色移植瘤組織的固定通過10%中性甲醛溶液，之后進(jìn)行石蠟包埋、切片、脫蠟與水化，經(jīng)過使用過氧化氫阻斷其內(nèi)源性過氧化酶活性后，分別加入鼠抗人 Ki67 與EZH2，4℃處理過夜。加入酶標(biāo)羊抗小鼠/兔室溫處理1 h，DAB 顯色，蘇木精復(fù)染，乙醇梯度脫水、二甲苯透明、中性膠封片。最后，在顯微鏡（×200）下鏡檢拍照。其中陽性染色為細(xì)胞核的棕色顆粒沉著。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

以上主要實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3 次。所有數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism8.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用Shapiro-Wilk 正態(tài)性檢驗(yàn)對(duì)檢驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性分析。采用單因素方差分析對(duì)組間差異進(jìn)行比較分析，多重比較用Bonferroni 法，數(shù)據(jù)以平均值±平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差（Mean±SEM）表示，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 si-EZH2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染于T24 細(xì)胞中對(duì)其EZH2 RNA 表達(dá)的影響

首先將實(shí)驗(yàn)分為T24 細(xì)胞正常培養(yǎng)、T24 細(xì)胞+si NC、T24 細(xì)胞+siEZH2-1、T24 細(xì)胞 +siEZH2-2 和T24 細(xì)胞+siEZH2-3 5 個(gè)組。然后將構(gòu)建好的siEZH2-1、siEZH2-2、siEZH2-3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至T24 細(xì)胞中，通過qPCR 實(shí)驗(yàn)及WB 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)EZH2 基因表達(dá)水平，結(jié)果顯示:與對(duì)照組正常T24 細(xì)胞（1.238±0.121 0）相比，其余4 組中只有 siEZH2-1（0.624 3±0.031 35）、siEZH2-2（0.216 8±0.031 28）的EZH2 siRNA 表達(dá)量低于對(duì)照組（P<0.01），見圖1。并且si EZH2-2 的Ct 值與對(duì)照組相比明顯下降，說明siEZH2-1、siEZH2-2 可以作為EZH2 基因的siRNA，并且siEZH2-2 更為合適。

圖1 qRT-PCR 檢測(cè)EZH2 siRNA 的表達(dá)Fig.1 Expression of EZH2 siRNA via qRT-PCR**P <0.01。

2.2 si-EZH2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染于T24 細(xì)胞中對(duì)其EZH2 蛋白表達(dá)量的影響

上述5 組實(shí)驗(yàn)組之間WB 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與EZH2的蛋白相對(duì)表達(dá)量結(jié)果，見圖2。與正常T24 細(xì)胞相比，其余4 組實(shí)驗(yàn)組中只有siEZH2-1、siEZH2-2 的EZH2 蛋白表達(dá)量低于對(duì)照組（P<0.01），其中與對(duì)照組膀胱癌T24 細(xì)胞正常培養(yǎng)的EZH2 的相對(duì)蛋白表達(dá)量（1.076 0±0.059 31）相比，T24 細(xì)胞+siEZH2-2 實(shí)驗(yàn)組EZH2 的相對(duì)蛋白表達(dá)量（0.338 3±0.039 78）降低，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。表明膀胱癌T24 細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)成功，同時(shí)提示，細(xì)胞中已轉(zhuǎn)染的siEZH2 對(duì)EZH2 表達(dá)具有明顯的抑制作用。

圖2 5 組膀胱癌T24 細(xì)胞中EZH2 的蛋白相對(duì)表達(dá)量分析Fig.2 Analysis of relative protein expression of EZH2 in five groups of bladder cancer T24 cells

2.3 降低EZH2 表達(dá)對(duì)在GC 化療中膀胱癌T24細(xì)胞的增殖與克隆能力的影響

為了檢測(cè)不同的EZH2 抑制劑之間對(duì)于GC化療中的膀胱癌T24 細(xì)胞增殖與凋亡是否存在差異，對(duì)照組（膀胱癌T24 細(xì)胞正常培養(yǎng)）、GC 化療組（T24 細(xì)胞+GC 化療藥物）、si EZH2 轉(zhuǎn)染組（T24 細(xì)胞+si EZH2 轉(zhuǎn)染+GC 化療藥物）、GSK126 抑制劑組（T24 細(xì)胞+GSK126 5 μM+GC化療藥物）、UNC1999 抑制劑組（T24 細(xì)胞 +UNC1999 5 μM+GC 化療藥物）、EI1 抑制劑組（T24 細(xì)胞+EI1 5 μM+GC 化療藥物）、DZNep1抑制劑（T24 細(xì)胞+DZNep1 5 μM+GC 化療藥物）與EPZ005687 抑制劑（T24 細(xì)胞+EPZ005687 5 μM+GC 化療藥物）的24 h 與48 h CCK8 實(shí)驗(yàn)結(jié)果，見圖3。研究結(jié)果表示，其中使用UNC1999 EZH2 抑制劑結(jié)合GC 化療藥物的膀胱癌T24 細(xì)胞活力在24 h 和48 h 均低于對(duì)照組與GC 化療組，24 h [（48.63±2.958）%，（P<0.01）]、48 h[（43.56±1.709）%，（P<0.01）]差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。平板克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果，見圖4。與對(duì)照組（215.7±10.73）個(gè)相比，T24 細(xì)胞+DZNep1 5 μM +GC 化療藥物組[（84.46±6.066）個(gè)，（P<0.01）]與T24 細(xì)胞+EPZ005687 5 μM+GC 化療藥物組[（127.6±24.00）個(gè)，（P<0.05）]的細(xì)胞克隆形成數(shù)目減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明EZH2 抑制劑可以降低膀胱癌T24 細(xì)胞在GC 化療藥物中增殖與克隆能力。

圖3 CCK-8 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)24 h 與48 h EZH2 抑制劑對(duì)膀胱癌T24 細(xì)胞增殖的影響Fig.3 CCK-8 assay to detect the effect of 24 h and 48 h EZH2 inhibitors on the proliferation of bladder cancer T24 cells

圖4 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)使用EZH2 抑制劑對(duì)膀胱癌T24 細(xì)胞增殖的影響Fig.4 Effect of using EZH2 inhibitor on the proliferation of bladder cancer T24 cells detected by plate clone formation assay

2.4 降低EZH2 表達(dá)對(duì)GC 化療中膀胱癌T24 細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡能力的影響

為了進(jìn)一步驗(yàn)證EZH2 抑制劑可以有效提高膀胱癌T24 細(xì)胞在GC 化療藥物的敏感性，進(jìn)行PI 單染檢測(cè)細(xì)胞周期與平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞克隆形成能力。細(xì)胞周期結(jié)果見圖5。與上述對(duì)照組相比，其余7 組實(shí)驗(yàn)組在細(xì)胞周期方面G1 期都有所上升而G2 期與S 期所占的比例卻都有所下降，說明單獨(dú)GC 化療與EZH2 抑制劑和GC 化療藥物聯(lián)用均能在G1 期水平上抑制膀胱癌T24 細(xì)胞增殖，并且EZH2 抑制劑與GC 化療藥物聯(lián)用抑制膀胱癌T24 細(xì)胞增殖效果比單獨(dú)GC 化療藥物的效果顯著。其中與對(duì)照組（34.47±1.888）和GC 化療組（43.00±1.128）相比，T24 細(xì)胞+UNC1999 5 μM+GC 化療藥物實(shí)驗(yàn)組中的G1 期在細(xì)胞周期中所占百分比（61.80±0.450 4）最高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。另外，Annexin V-FITC/PI 檢測(cè)結(jié)果顯示，在早期凋亡比例中，與對(duì)照組（5.750±0.172 1）和GC 化療組（9.830±0.197 0）相比，T24 細(xì)胞+UNC1999 5 μM+GC 化療藥物組的早期凋亡比例所占百分比（20.08±1.519）最高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見圖6。

圖5 PI 單染試驗(yàn)檢測(cè)EZH2 抑制劑對(duì)膀胱癌T24 細(xì)胞其細(xì)胞周期的影響Fig.5 Effect of EZH2 inhibitor on bladder cancer T24 cells and their cell cycle detected by PI single staining assay

圖6 Annexin V/PI 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)EZH2 抑制劑對(duì)GC 化療中的膀胱癌T24 細(xì)胞凋亡的影響Fig.6 Annexin V/PI assay to detect the effect of EZH2 inhibitor on apoptosis of bladder cancer T24 cells in GC chemotherapy

2.5 EZH2 抑制劑對(duì)小鼠體內(nèi)T24 細(xì)胞移植瘤生長與骨髓抑制毒副作用的影響

為了更加明確EZH2 抑制劑在體內(nèi)可以提高膀胱癌T24 細(xì)胞在GC 化療藥物的敏感性，移植瘤圖片，見圖7A。實(shí)驗(yàn)分為5 組，分別為對(duì)照組（T24 細(xì)胞正常培養(yǎng)）、溶媒緩沖液組（T24 細(xì)胞 +100 μL EZH2 抑制劑的溶媒緩沖液）、GC 化療組（T24 細(xì)胞+GC 化療組）、UNC1999 EZH2 抑制劑組（T24 細(xì)胞+UNC1999）與UNC1999+和GC 化療組聯(lián)用組（T24 細(xì)胞+UNC1999+GC 化療）。結(jié)果顯示，與單純GC 化療組2 周（0.277 4±0.103 1）g與4 周（0.301 9±0.049 98）g 瘤體重量相比，GC 化療與UNC1999 EZH2 抑制劑聯(lián)用組2 周（0.209 9±0.044 83）g 與4 周（0.212 9±0.018 86）g 瘤體重量減小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見圖7B。免疫組化染色法檢測(cè)結(jié)果，見圖7C。血常規(guī)檢測(cè)結(jié)果，見圖7D。與單純GC 化療組相比，GC 化療與UNC1999 EZH2 抑制劑聯(lián)用組的紅細(xì)胞2 周（7.687±0.456 4）×109/L 和4 周（7.277±0.402 4）×109/L、白細(xì)胞2 周（4.777±0.464 1）×109/L 和4 周（4.163±0.427 1）×109/L 與血小板2 周（675.2±39.58）×109/L 和4 周（524.2±36.73）×109/L 3 種血細(xì)胞數(shù)量均增加。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，UNC1999 EZH2 抑制劑與GC 化療藥物聯(lián)用可以相比于單用GC 化療藥物更有效的抑制其體內(nèi)膀胱癌T24細(xì)胞的增殖與侵襲轉(zhuǎn)移，與體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，并且可以有效減少骨髓抑制的毒副作用。

圖7 EZH2 抑制劑對(duì)小鼠體內(nèi)T24 細(xì)胞移植瘤生長的影響Fig.7 Effect of EZH2 inhibitors on the growth of T24 cell transplanted tumours in mice

3 討論

膀胱癌是全球第十大最常見的癌癥[10]。在膀胱癌中，UCC 是最常見的病理組織學(xué)類型[11]，最終導(dǎo)致死亡的原因主要?dú)w功于其病灶轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。近幾年藥物治療方面使用基于鉑類化療藥物順鉑的MVAC（甲氨喋呤、長春新堿、阿霉素、順鉑）化療方案應(yīng)用于臨床以來，其治療效果明顯改善，并一直以來作為UCC 化療的標(biāo)準(zhǔn)一線方案也是肌層浸潤性膀胱癌（muscle-invasive bladder cancer，MIBC）圍手術(shù)期治療的首選治療方案。此外，膀胱內(nèi)卡介苗免疫療法或化學(xué)療法被用作經(jīng)尿道切除術(shù)后非肌層浸潤性膀胱癌（non-muscle-invasive bladder cancer，NMIBC）的輔助治療選擇，以防止進(jìn)展與復(fù)發(fā)[11]。所以近年來，隨著普及鉑類化療藥物的使用以及廣泛應(yīng)用分子靶向藥物，在膀胱癌患者總體生存率方面也有所改善，并且迅速成為其熱點(diǎn)研究領(lǐng)域歸結(jié)于其精準(zhǔn)的靶向治療[12-13]。自從新藥GC 聯(lián)合應(yīng)用于臨床，該方案將成為治療UCC 的一線化療方案，其逐漸取代MVAC 方案的主要原因在于臨床毒副作用方面GC 要明顯優(yōu)于之前的MVAC 方案，但化療效果基本一致，基本吻合于國外同行報(bào)道結(jié)果[14]。然而，化療過程中經(jīng)常產(chǎn)生的主要毒副作用眾所周知?jiǎng)t為骨髓抑制，其中2 種血細(xì)胞減少分別為白細(xì)胞與血小板較為容易發(fā)生。因此，進(jìn)一步提升UCC 治療GC 方案的敏感性，降低藥物使用劑量，對(duì)于UCC 患者具有重要意義。

EZH2 是多梳抑制復(fù)合物（polycomb repressive complex 2，PRC2）的催化亞基，該催化亞基可使催化組蛋白 H3 賴氨酸（H3K27）甲基化[15]，該基因也為調(diào)控表觀遺傳的主要因子之一，并參與了組蛋白甲基化、EMT 等過程[15-16]。EZH2 基因位于人類染色體 7q35 上，包含20 個(gè)外顯子，并且EZH2 主要通過SET 結(jié)構(gòu)域作為組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶，以PRC2 依賴或獨(dú)立的方式抑制或協(xié)同激活轉(zhuǎn)錄[15-16]。EZH2 所表達(dá)的蛋白具有促進(jìn)細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移、抑制細(xì)胞凋亡以及參與耐藥等功能[17]。EZH2 在乳腺癌正常黏膜組織、良性病變及腺癌中的陽性表達(dá)率呈逐漸增加，說明在乳腺癌變過程中EZH2 也發(fā)揮了一定作用[18]，并且EZH2 基因突變可以增加乳腺癌細(xì)胞的易感性，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移[19]。另外，抑制EZH2 基因在肌型浸潤性膀胱癌的表達(dá)可以減少膀胱癌細(xì)胞的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移能力，并且可以增加順鉑聯(lián)合抑制的敏感性[2]。目前，多種EZH2 抑制劑已被用于抗腫瘤的基礎(chǔ)和臨床前期研究，并在非霍奇金淋巴瘤、肝細(xì)胞癌、結(jié)直腸癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、宮頸癌、多發(fā)性骨髓瘤與自身性免疫性疾病中取得了令人滿意的結(jié)果[20-28]。令人遺憾的是，至今尚未有EZH2 抑制劑在膀胱癌GC 化療中的研究。

因此，本研究在細(xì)胞水平驗(yàn)證下調(diào)EZH2 的表達(dá)對(duì)GC 方案治療UCC 細(xì)胞的影響，結(jié)果顯示與對(duì)照組相比，各EZH2 抑制劑處理組在24 h 與48 h 的細(xì)胞增殖與克隆能力均比對(duì)照組低，并且在細(xì)胞周期方面顯著滯留在G1 期，細(xì)胞凋亡方面比對(duì)照組多，且抑制劑UNC1999 效果尤為明顯，闡明EZH2 與膀胱癌細(xì)胞活性密切相關(guān)，其中表現(xiàn)在EZH2 可有效抑制T24 細(xì)胞的增殖與遷移能力。另外，本研究通過裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型中驗(yàn)證EZH2 抑制劑對(duì)于GC 方案治療UCC 的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，GC 化療組（T24細(xì)胞+GC 化療組）、UNC1999EZH2 抑制劑組（T24 細(xì)胞+UNC1999）與UNC1999+和GC 化療組聯(lián)用組（T24 細(xì)胞+UNC1999+GC 化療）在2 周與4周內(nèi)的瘤體體積與重量顯著降低。Ki67 為一種核抗原，可以反映細(xì)胞其增殖活性，在正常膀胱組織中低表達(dá)[29]。本實(shí)驗(yàn)中通過免疫組化檢測(cè)T24細(xì)胞中Ki67 水平與EZH2 水平發(fā)現(xiàn)與空白組相比，其余3 組實(shí)驗(yàn)處理組也明顯降低，最后通過血常規(guī)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)GC 藥物與EZH2 抑制劑聯(lián)用可以提升白細(xì)胞、紅細(xì)胞及血小板數(shù)量從而有效減少GC 化療藥物的毒副作用。

綜上所述，本研究采取使用不同的EZH2 抑制劑與膀胱癌GC 化療藥物聯(lián)用對(duì)于膀胱癌 T24細(xì)胞的增殖能力均呈抑制作用，證實(shí)了EZH2 抑制劑可以增加膀胱癌GC 化療藥物的敏感性，在膀胱癌的臨床精準(zhǔn)治療方面提供了一種新的思路。然而，此實(shí)驗(yàn)對(duì)于EZH2 抑制劑與膀胱癌GC 化療藥物聯(lián)合增敏的作用機(jī)制研究尚淺，本課題組將進(jìn)一步對(duì)EZH2 抑制劑在膀胱癌GC 化療方案中增敏作用及其調(diào)控機(jī)制進(jìn)行深入研究，為其成為膀胱癌細(xì)胞的治療靶點(diǎn)提供新的方法與思路。