Corilagin 對(duì)OX-LDL 誘導(dǎo)的HUVECs 細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及對(duì)MyD88 信號(hào)通路表達(dá)的影響

陶代菊，陳 鵬，李雨晴，陳臨宜，楊仁華，何 波，沈志強(qiáng)

（昆明醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院暨云南省天然藥物藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650500）

動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是一種以大動(dòng)脈壁聚集脂質(zhì)沉積物為主要特征的慢性炎癥性疾病，其發(fā)病機(jī)理是一個(gè)復(fù)雜的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，ox-LDL 的形成和攝取是AS 進(jìn)展的關(guān)鍵步驟[1]。在氧化環(huán)境中，低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）被氧化修飾為氧化型LDL（oxidized low density lipoprotein，ox-LDL），ox-LDL 會(huì)與內(nèi)皮細(xì)胞以及單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞上的多種清道夫受體（scavenger receptors，SRs）結(jié)合，最終導(dǎo)致在狹窄的動(dòng)脈粥樣硬化動(dòng)脈中形成富含血小板和白細(xì)胞的凝塊[2]。

蛋白質(zhì)髓樣分化初級(jí)反應(yīng)蛋白88（myeloid differentiation primary response 88，MyD88）是一種重要的銜接分子，通過(guò)下調(diào)TLR-4/MyD88/P65 表達(dá)，可減輕單核細(xì)胞趨化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）及TNF-α 介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展[3-7]。因此，MyD88 信號(hào)通路在AS 發(fā)生發(fā)展過(guò)程中扮演著重要的調(diào)控作用。

AS 已經(jīng)成為威脅人類生命健康的主要疾病之一，目前臨床仍缺乏有效的治療藥物[8]。雖然應(yīng)用他汀類為代表的調(diào)血脂藥取得了一定療效，但其嚴(yán)重的不良反應(yīng)限制了其發(fā)展。因此，從天然產(chǎn)物中尋找治療AS 的潛在藥物具有重要意義。Corilagin 是一種從Phyllanthus urinaria L.中分離的天然化合物，具有多種藥理作用[9]。研究發(fā)現(xiàn)Corilagin 在體內(nèi)外均能抑制ox-LDL 誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移[10]，還可降低ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs 的LOX-1 表達(dá)水平[11-12]，提示其具有良好的抗AS 作用。本研究將通過(guò)MyD88信號(hào)通路進(jìn)一步探討Corilagin 干預(yù)對(duì)ox-LDL 誘導(dǎo)損傷的HUVECs 細(xì)胞的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 研究材料

1.1.1 細(xì)胞人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs），購(gòu)自中國(guó)典型物保藏中心。

1.1.2 藥物Corilagin 由中科院昆明植物研究所提供，結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1，分子量為634.46，純度為99.5%，黃褐色粉狀物，避光密封4℃保存。辛伐他汀原料藥（Q12VK-FO），購(gòu)自Sigma，分子式C25H38O5，分子量418.57，純度 >99%，防潮低溫避光保存。維生素E（Vit E）原料藥（T-438），購(gòu)自Sigma，分子式為C29H50O2，分子量為430.71，純度 >99%，白色粉末，-20℃保存。

圖1 Corilagin 的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structure of Corilagin

1.1.3 主要試劑OX-LDL 購(gòu)自廣州奕源生物科技有限公司，MTT-705B054 購(gòu)自Solarbio 公司，BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自碧云天公司，TRNzol-A+總RNA 提取試劑裂解液，Golden Taq PCR 試劑盒，TIANScript M-MLV 第一鏈cDNA 合成試劑盒購(gòu)自Fermentas 公司，一抗β-actin 購(gòu)自SAB 公司，MYD88（1∶1 000），P65（1∶500），TNF-α（1：500），MCP-1（1∶1 000）購(gòu)自愛(ài)博泰克生物科技有限公司。

1.2 研究方法

1.2.1 藥液配制Corilagin 藥液：用PBS 溶液配制成2 mmol/L 的Corilagin 母液。辛伐他汀藥液：用PBS 溶液配制成10 000 μmol/L 的辛伐他汀母液。維生素E 藥液：用PBS 溶液配制成10 000 μmol/L的維生素E 母液。藥液均臨用前稀釋成所需濃度。

1.2.2 細(xì)胞鑒定（1）顯微鏡觀察法：HUVECs 的細(xì)胞形態(tài)于倒置相差顯微鏡下觀察并拍照；（2）免疫組織化學(xué)法：將消毒滅菌后的0.5 cm×0.6 cm蓋玻片放置在6 孔培養(yǎng)板內(nèi)，并將HUVECs 濃度調(diào)整為1×105個(gè)/mL，按2 mL/孔接種于6 孔板內(nèi)。培養(yǎng)至HUVECs 融合80%～90%后，取出蓋玻片。檢測(cè)HUVECs 的VIII 因子、CD34的表達(dá)，分別分為實(shí)驗(yàn)組和陰性對(duì)照組2 組，每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，按照免疫組化流程處理后，于熒光顯微鏡下觀察，并拍照保存。

1.2.3 MTT 實(shí)驗(yàn)方法將計(jì)數(shù)后的上述HUVECs接種于96 孔板上，加入MTT（5 mg/mL）孵育4 h，再用三聯(lián)液孵育8 h 后，測(cè)定570 nm 和630 nm處的OD 值。

1.2.4 復(fù)制ox-LDL 誘導(dǎo)HUVECs 細(xì)胞損傷用含EDTA 的胰蛋白酶消化HUVECs，經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)調(diào)整濃度為5×104個(gè)/mL，100 μL/孔接種到96 孔板內(nèi)，培養(yǎng)24 h。每次種板4 塊，分別用于探索HUVECs 的損傷時(shí)間：6 h、12 h、24 h、48 h，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。每塊板設(shè)正常對(duì)照組和ox-LDL 組。正常對(duì)照組：加入等量的PBS；ox-LDL 組：分別加入終濃度為10 mg/L、20 mg/L、30 mg/L、40 mg/L、50 mg/L、60 mg/L、70 mg/L、80 mg/L 的ox-LDL。應(yīng)用改良MTT 法測(cè)定不同損傷濃度及時(shí)間條件下ox-LDL 對(duì)HUVECs 的損傷程度，以確定ox-LDL 損傷HUVEC 的適宜濃度及時(shí)間。

1.2.5 Corilagin 對(duì)ox-LDL 誘導(dǎo)損傷的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVECs 保護(hù)作用觀察用含EDTA 的胰蛋白酶消化HUVECs，經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)調(diào)整濃度為5×104個(gè)/mL，并以100 μL/孔接種到96 孔板內(nèi)，培養(yǎng)24 h。每次種板6 塊，重復(fù)3 次，每塊板上設(shè)9 個(gè)組：正常組；模型組；陽(yáng)性藥組：（Vit E：10 μmol/L、辛伐他?。? μmol/L）；Corilagin 給藥組（3.125、6.25、12.5、25、50 μmol/L）。按照分組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，根據(jù)改良MTT 法測(cè)定細(xì)胞活力，評(píng)價(jià)Corilagin 對(duì)ox-LDL 損傷HUVECs 的保護(hù)作用及其量-效/時(shí)-效關(guān)系。

1.2.6 RT-qPCR 檢測(cè)ox-LDL 損傷的HUVECs 中MyD88、P65、TNF-α、MCP-1 mRNA 的表達(dá)將細(xì)胞分成正常組，模型組，陽(yáng)性藥組（Vit E：10 μmol/L、辛伐他汀：1 μmol/L）；Corilagin 組：Corilagin（3.125、6.25、12.5、25、50 μmol/L）一共9 個(gè)組。孵育24 h，收集細(xì)胞提取總RNA 進(jìn)行RT-qPCR 定量檢測(cè)，引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.2.7 Western blot 檢測(cè)ox-LDL 損傷的HUVECs及VSMCs 中MyD88、P65、TNF-α、MCP-1 蛋白的表達(dá)實(shí)驗(yàn)分組同1.2.6，細(xì)胞培養(yǎng)24 h 后，按照分組加入對(duì)應(yīng)的藥物濃度，孵育24 h，所有給藥組給予70 mg/L 的ox-LDL，刺激12 h，將各組細(xì)胞分別置于冰上充分研磨后提取總蛋白，總蛋白濃度用BCA 蛋白檢測(cè)試劑盒測(cè)定。蛋白質(zhì)樣品用12%、15%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，然后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜。用無(wú)蛋白快速封閉液封閉膜20 min。將PVDF 膜與一抗在4℃孵育過(guò)夜，用TBST 洗滌3 次后與二抗孵育2 h。TBST 洗滌3 次，用Bio-Rad 凝膠成像系統(tǒng)顯影、收集和分析靶蛋白的圖像，采用ImageJ 軟件統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 HUVECs 的鑒定

2.1.1 形態(tài)學(xué)鑒定倒置顯微鏡下顯示，HUVECs細(xì)胞呈扁平的卵圓形、梭形、多角形，細(xì)胞均勻透亮，邊界清晰，胞核清晰，呈圓形或橢圓形，有2～3 個(gè)核仁。胞漿內(nèi)含小顆粒，結(jié)構(gòu)完整，符合血管內(nèi)皮細(xì)胞的基本形態(tài)，見(jiàn)圖2A～2B。

圖2 HUVECs 形態(tài)學(xué)鑒定（A×100，B×400）Fig.2 Morphological identification of HUVECs（A×100，B×400）

2.1.2 免疫學(xué)鑒定內(nèi)皮細(xì)胞的特異性蛋白CD34、Ⅷ因子既是胞漿蛋白也是胞膜蛋白。通過(guò)免疫化學(xué)鑒定結(jié)果表明，陰性對(duì)照細(xì)胞形態(tài)完整，背景清晰均勻，而陽(yáng)性組細(xì)胞邊界清晰，呈棕紅色，胞漿和胞膜邊緣顏色更深，細(xì)胞核明顯，見(jiàn)圖3A。HUVEC Ⅷ因子的陽(yáng)性表達(dá)，見(jiàn)圖3B；CD34 陽(yáng)性表達(dá)，進(jìn)一步證實(shí)培養(yǎng)的細(xì)胞為HUVECs，見(jiàn)圖3D。

圖3 免疫組化法檢測(cè)HUVECs 細(xì)胞Ⅷ、CD34 因子表達(dá)（×400）Fig.3 Immunohistochemical detection of factor VIII.and CD34 expression in HUVECs cells（×400）

2.2 OX-LDL 刺激HUVECs 損傷模型

尋找最佳的ox-LDL 刺激HUVECs 損傷模型的條件。結(jié)果顯示，隨著ox-LDL 濃度的增加，OD 值下降，說(shuō)明ox-LDL 對(duì)HUVECs 具有損傷作用。與正常對(duì)照組比較，刺激6 h，70 mg/L 和80 mg/L 濃度的ox-LDL 明顯損傷了HUVECs（P<0.01）；刺激12、24、48 h，60～80 mg/L 濃度的ox-LDL 明顯損傷HUVECs（P<0.01）。因此，筆者最終選取終濃度為70 mg/L 的ox-LDL 刺激HUVECs 12 h 作為復(fù)制ox-LDL 損傷HUVECs 模型的最佳條件，見(jiàn)圖4。

圖4 ox-LDL 對(duì)HUVECs 損傷模型的復(fù)制（，n=6）Fig.4 Replication of HUVECs damage model by ox-LDL（，n=6）

2.3 Corilagin 對(duì)ox-LDL 損傷HUVECs 的保護(hù)作用

與正常對(duì)照組比較，ox-LDL 損傷模型組的細(xì)胞活力明顯降低（P<0.01）；與模型比較，孵育12 h，6.25～50 μmol/L 的Corilagin 處理組的細(xì)胞活力明顯提高，25 μmol/L 的Corilagin 保護(hù)作用最明顯，細(xì)胞活力較模型組提高50%，50 μmol/L 的Corilagin 組細(xì)胞活力與25 μmol/L 組基本持平（P<0.01）；孵育24 h，3.125～50 μmol/L 的Corilagin處理組的細(xì)胞活力明顯提高，25 μmol/L 的Corilagin組細(xì)胞活力最高，接近正常組水平（P<0.01）；孵育48 h，僅25 μmol/L 和50 μmol/L 的Corilagin 處理組的細(xì)胞活力明顯提高，較模型組提高30%（P<0.01），見(jiàn)圖5。這表明，Corilagin 能對(duì)ox-LDL 損傷的HUVECs 具有保護(hù)作用，其中以25 μmol/L 和50 μmol/L 的濃度效果最顯著。

2.4 Corilagin 對(duì)ox-LDL 損傷HUVECs 中MyD-88、P65、TNF-α、MCP-1 mRNA 表達(dá)的影響

與正常對(duì)照組比較，ox-LDL 模型組的MyD88、NF-kB、TNF-α、MCP-1mRNA 的表達(dá)量顯著升高（P<0.01）。與ox-LDL 模型組比較，不同濃度Corilagin（12.5 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L）組和陽(yáng)性藥組（辛伐他汀、維生素E）的MyD88、P65、MCP-1、TNF-α mRNA 的表達(dá)量均顯著降低（P<0.05），見(jiàn)圖6。以上結(jié)果表明，Corilagin 可抑制ox-LDL 誘導(dǎo) HUVECs 的 HUVECs 損傷中的MyD88、P65、TNF-α、MCP-1 的mRNA 表達(dá)。

圖6 Corilagin 對(duì)OX-LDL 誘導(dǎo)的HUVECs 中P65、MCP-1、MyD88 和TNF-α 的mRNA 表達(dá)的影響（，n=6）Fig.6 Effect of Corilagin on mRNA expression of P65，MCP-1，MyD88 and TNF-α in OX-LDL-induced HUVECs（，n=6）

2.5 Corilagin 對(duì)ox-LDL 損傷HUVECs 中MyD-88、P65、TNF-α、MCP-1 蛋白表達(dá)的影響

與正常對(duì)照組比較，ox-LDL 模型組MyD88、P65、TNF-α、MCP-1 蛋白表達(dá)均顯著升高（P<0.01）。與模型組比較，Vit E 10 μmol/L、辛伐他汀1 μmol/L 組和不同濃度Corilagin（12.5 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L）組MyD88、P65、TNF-α、MCP-1 蛋白表達(dá)均出現(xiàn)顯著降低（P<0.05），見(jiàn)圖7。以上結(jié)果顯示，Corilagin 可抑制ox-LDL 損A：OX-LDL 刺激6 h 對(duì)HUVECs 細(xì)胞的影響；B：OX-LDL 刺激12 h 對(duì)HUVECs 細(xì)胞的影響；C：OX-LDL 刺激24 h 對(duì)HUVECs 細(xì)胞的影響；D：OX-LDL 刺激48 h 對(duì)HUVECs 細(xì)胞的影響。與正常組相比，**P<0.01。傷的HUVECs 中MyD88、P65、TNF-α、MCP-1蛋白表達(dá)。

圖7 Corilagin 對(duì)OX-LDL 誘導(dǎo)的HUVECs 中P65、MCP-1、MyD88 和TNF-α 的蛋白表達(dá)的影響（，n=3）Fig.7 Effect of Corilagin on protein expression of P65，MCP-1，MyD88 and TNF-α in OX-LDL-induced HUVECs（，n=3）

3 討論

AS 病程復(fù)雜，涉及脂質(zhì)代謝紊亂和免疫細(xì)胞向動(dòng)脈壁募集等病理過(guò)程。他汀類藥物是治療血脂異常的一線藥物，具有降低LDL-C 的功效，然而，部分人對(duì)他汀類藥物不耐受，且不良反應(yīng)較多，限制其使用[13]，因此，尋找安全有效的抗AS 藥物是醫(yī)藥學(xué)界急需解決的問(wèn)題。

血管內(nèi)皮細(xì)胞是參與AS 發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵細(xì)胞之一，研究選用HUVECs 細(xì)胞系，通過(guò)鑒定發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞符合血管內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)特征并且高表達(dá)血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性蛋白CD34 和Ⅷ，提示該細(xì)胞系確為HUVECs。目前普遍認(rèn)為血管內(nèi)皮細(xì)胞的氧化損傷是AS 發(fā)展的始動(dòng)環(huán)節(jié)，采用ox-LDL 誘導(dǎo)后筆者發(fā)現(xiàn)60～80 mg/L 濃度的ox-LDL作用12 h 可使HUVECs 損傷明顯，因此本研究選擇75 mg/L 濃度的ox-LDL 作用12 h 為造模條件。在前期研究中筆者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了Corilagin 抗AS 的作用，本實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步在細(xì)胞水平評(píng)價(jià)了不同時(shí)-效/量-效的Corilagin 對(duì)ox-LDL 損傷HUVECs 的保護(hù)作用，結(jié)果顯示，Corilagin 在12、24、48 h以濃度依賴的方式（3.125、6.25、12.5、25、50 μmol/L）提高細(xì)胞活力，表明Corilagin 對(duì)ox-LDL 損傷HUVECs 具有保護(hù)作用。

炎性反應(yīng)貫穿AS 發(fā)生發(fā)展的全過(guò)程，MyD88 是TLR 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)鍵靶標(biāo)，在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用，它通過(guò)調(diào)控胞漿募集下游的腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子-6（tumor-necrosis factor receptor associated factor，TRAF-6），誘導(dǎo)TNF-α 和MCP-1 等炎癥因子的表達(dá)。Zhu 等[14]研究發(fā)現(xiàn)抑制巨噬細(xì)胞中TLR4/MyD88/P65 信號(hào)通路后小鼠AS 出現(xiàn)轉(zhuǎn)歸，表明以MyD88 銜接的炎癥反應(yīng)通路對(duì)AS 的進(jìn)展具有重要調(diào)控作用。HUVECs 作為研究?jī)?nèi)皮細(xì)胞功能調(diào)節(jié)的模型系統(tǒng)，常應(yīng)用于血管形成、AS 斑塊的研究[15]。本研究以MyD88、P65、TNF-α 和MCP-1 為研究靶標(biāo)，通過(guò)RT-qPCR 和Western blot 技術(shù)檢測(cè)Corilagin對(duì)ox-LDL 誘導(dǎo)的損傷HUVECs 模型中上述因子的表達(dá)的影響，在模型組中，MyD88、P65、TNFα 和MCP-1 的表達(dá)均明顯上調(diào)，而Corilagin 組中這些指標(biāo)的表達(dá)均得到了顯著逆轉(zhuǎn)。

綜上所述，Corilagin 對(duì)ox-LDL 損傷的HUVECs的保護(hù)作用可能是通過(guò)下調(diào)MyD88 基因的表達(dá)，抑制p65、炎性因子TNF-α 和趨化因子MCP-1的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。本研究沒(méi)有采用MyD88 抑制劑佐證Corilagin 通過(guò)下調(diào)MyD88 信號(hào)通路發(fā)揮抗AS 作用，因此，在接下來(lái)的研究中，筆者將使用MyD88 抑制劑在動(dòng)物-細(xì)胞水平進(jìn)一步驗(yàn)證Corilagin 的作用機(jī)制，為Corilagin 臨床用于防治AS 提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。