茶樹菇菌絲多糖提取工藝研究

郭漢忠，徐俊杰，郭 涵， 譚才鄧，林雅琦，黃依屏，杜詠怡，劉曉玲，陳永沛，陳政儒，陳芊樺

（1.廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣東廣州 510300；2.佛山復(fù)星禪誠醫(yī)院有限公司，廣東佛山 528000）

0 引言

茶樹菇是一種營養(yǎng)物質(zhì)豐富，具有清熱、明目、平肝等多種功效的食藥用菌，其多糖是一種特殊的生物活性物質(zhì)，具有增強體液免疫和細胞免疫的功能[1-2]。據(jù)統(tǒng)計，目前對于采用超聲破碎法提取茶樹菇多糖的研究多集中于子實體上，但提取時原料預(yù)處理所耗費的時間成本過高，所得經(jīng)濟效益過低[3]。菌絲體的發(fā)酵周期較短，采用菌絲體為原料可以大大縮短其加工周期，提高提取效率，進而提高經(jīng)濟效益。通過液態(tài)發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基獲得茶樹菇發(fā)酵液，優(yōu)化影響超聲破碎提取的因素，提高所提取的菌絲多糖含量，為后續(xù)批量生產(chǎn)茶樹菇多糖提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 茶樹菇母種

茶樹菇母種，廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院微生物實驗室提供。

1.1.2 培養(yǎng)基[4]

（1）PDA 培養(yǎng)基。馬鈴薯質(zhì)量濃度200 g/L，葡萄糖質(zhì)量濃度20 g/L，氯霉素質(zhì)量濃度100 mg/L，瓊脂粉質(zhì)量濃度20 g/L，pH 值6.0。

（2）液態(tài)發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基。葡萄糖質(zhì)量濃度20 g/L，蛋白胨質(zhì)量濃度10 g/L，KH2PO4質(zhì)量濃度2.5 g/L，MgSO4質(zhì)量濃度1.5 g/L，pH 值6.0。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種活化

配制的PDA 平板培養(yǎng)基接入茶樹菇母種后置于26 ℃培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)3～4 d，挑取鮮嫩菌絲進行二次活化。

1.2.2 發(fā)酵液的制備

將活化后的茶樹菇菌種與適量無菌水進行勻漿操作，吸取5 mL 菌絲勻漿液接種至100 mL 液態(tài)發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，混勻靜置過夜，于26 ℃搖床中以轉(zhuǎn)速130 r/min 振蕩培養(yǎng)6 d。

1.2.3 茶樹菇菌絲多糖提取

將發(fā)酵液經(jīng)8 層紗布過濾，并用蒸餾水反復(fù)清洗干凈菌絲體，于50 ℃的干燥箱中烘干，磨成菌絲粉。再按試驗設(shè)計的料液比、超聲時間、超聲功率進行超聲破碎，離心取上清液，醇沉，獲得茶樹菇菌絲多糖粗品，測多糖含量。

1.2.4 單因素試驗

以獲取的茶樹菇菌絲發(fā)酵液為基料，提取的茶樹菇菌絲多糖含量為響應(yīng)量，由料液比、超聲時間、超聲功率這3 個因素展開探究。

茶樹菇菌絲多糖提取單因素試驗設(shè)計見表1。

表1 茶樹菇菌絲多糖提取單因素試驗設(shè)計

1.2.5 正交試驗

在上述單因素試驗所得出的結(jié)果基礎(chǔ)上，設(shè)計三因素三水平的正交試驗。

茶樹菇菌絲多糖提取正交試驗設(shè)計見表2

表2 茶樹菇菌絲多糖提取正交試驗設(shè)計

1.2.6 菌絲多糖含量測定

菌絲多糖含量測定方法采用苯酚-硫酸法[5-6]。

2 結(jié)果與分析

2.1 料液比對茶樹菇菌絲多糖提取率的影響

通過以液態(tài)發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基所培養(yǎng)得出的茶樹菇菌絲溶液混勻適量水分，改變其料液比，以茶樹菇菌絲多糖含量為因變量。

不同料液比對提取茶樹菇菌絲多糖的影響見圖1。

圖1 不同料液比對提取茶樹菇菌絲多糖的影響

由圖1 可知，在不同的料液比提取條件下，超聲提取所得茶樹菇菌絲多糖含量隨著料液比的變化而存在明顯差異。當料液比為1∶40（g∶mL）時，所提取的茶樹菇菌絲多糖含量最高，當料液比高于或低于1∶40（g∶mL）時，出現(xiàn)顯著下降趨勢。提取過程中，提取液中料液比的大小可能會直接影響提取液的飽和度，進而影響超聲破碎菌絲體的效果，導(dǎo)致胞內(nèi)多糖的流出受到不同程度的抑制。因此，在超聲破碎提取過程中，料液比的大小過高或者過低均會抑制茶樹菇菌絲多糖的提取。經(jīng)過試驗驗證，1∶40（g∶mL）為茶樹菇菌絲多糖超聲破碎提取最適料液比，此條件下提取茶樹菇菌絲多糖含量為1.89%。

2.2 超聲時間對茶樹菇菌絲多糖提取率的影響

通過以液態(tài)基礎(chǔ)培養(yǎng)基所培養(yǎng)得出的茶樹菇菌絲溶液，改變其超聲破碎提取的時間，以茶樹菇菌絲多糖含量為因變量。

不同超聲時間對提取茶樹菇菌絲多糖的影響見圖2。

圖2 不同超聲時間對提取茶樹菇菌絲多糖的影響

由圖2 可知，在不同的超聲時間下，超聲提取所得茶樹菇菌絲多糖含量隨著超聲時間的變化而存在顯著差異。當超聲時間小于15 min 時，所提取的茶樹菇菌絲多糖含量隨著超聲時間的增加而增加；當超聲時間高于15 min 時，出現(xiàn)明顯下降的趨勢。由此可見，提取茶樹菇菌絲多糖過程中，在一定的條件下，超聲破碎提取的時間大小與提取所得多糖含量成正比，超過一定范圍后，由于茶樹菇菌絲體破碎完全，其多糖均以擴散到溶液中，因此超聲時間越長，其提取的多糖含量沒有上升趨勢，甚至延長超聲時間還有可能導(dǎo)致已提取的多糖降解為單糖。經(jīng)過試驗驗證，15 min 為茶樹菇菌絲多糖超聲破碎提取最佳超聲時間，此條件下提取茶樹菇菌絲多糖含量為1.94%。

2.3 超聲功率對茶樹菇菌絲多糖提取率的影響

通過以液態(tài)基礎(chǔ)培養(yǎng)基所培養(yǎng)得出的茶樹菇菌絲溶液，改變其超聲功率，以茶樹菇菌絲多糖含量為因變量。

不同超聲功率對提取茶樹菇菌絲多糖的影響見圖3。

圖3 不同超聲功率對提取茶樹菇菌絲多糖的影響

由圖3 可知，在不同的超聲功率下，超聲提取所得茶樹菇菌絲多糖含量隨著超聲功率的變化而存在顯著差異。當超聲功率小于400 W 時，所提取的茶樹菇菌絲多糖含量隨著超聲功率的增加而增加；當超聲功率高于400 W 時，出現(xiàn)明顯下降的趨勢。由此可見，提取茶樹菇菌絲多糖過程中，在一定的范圍內(nèi)，超聲破碎提取的功率大小與提取所得多糖含量成正比，超過此范圍后，由于茶樹菇菌絲體破碎完全，其多糖均已提取完畢，因此超聲功率越大，其提取的多糖含量不僅沒有上升趨勢，甚至增加超聲功率還有可能導(dǎo)致已提取的多糖轉(zhuǎn)變?yōu)槠渌镔|(zhì)。經(jīng)過試驗驗證，400 W 為茶樹菇菌絲多糖超聲破碎提取最佳超聲功率，此條件下提取茶樹菇菌絲多糖含量為1.69%。

2.4 正交試驗結(jié)果分析

結(jié)合所得料液比、超聲時間、超聲功率的單因素試驗結(jié)果，以茶樹菇菌絲體超聲破碎的料液比、超聲時間、超聲功率3 個因素為自變量，提取所得茶樹菇菌絲多糖含量為因變量，設(shè)計相應(yīng)的正交試驗，優(yōu)化茶樹菇多糖提取工藝。

茶樹菇菌絲多糖提取工藝正交試驗結(jié)果見表3。

表3 茶樹菇菌絲多糖提取工藝正交試驗結(jié)果

由表3 可知，料液比、超聲時間、超聲功率3 個因素對茶樹菇菌絲多糖提取的影響的大小分別為超聲功率＞料液比＞超聲時間，且最佳組合為A2B1C2，即超聲破碎提取茶樹菇菌絲多糖最佳工藝條件為料液比1∶40，超聲時間10 min，超聲功率400 W，此工藝所提取的茶樹菇菌絲多糖含量最高，經(jīng)試驗驗證，此條件下提取茶樹菇菌絲多糖含量為2.11%，有利于后續(xù)的多糖深加工產(chǎn)品的研發(fā)。

3 結(jié)論

對茶樹菇菌絲多糖提取工藝優(yōu)化試驗中，通過對料液比、超聲時間、超聲功率等因素進行單因素試驗及正交試驗設(shè)計，針對試驗結(jié)果分析得出最佳的提取工藝為料液比1∶40（g∶mL），超聲時間10 min，超聲功率400 W，菌絲多糖含量高達2.11%。通過該研究結(jié)論，可以解決使用子實體為原料提取茶樹菇多糖所遇到的生長周期長、提取時間長、提取效率不高等問題所導(dǎo)致的其多糖產(chǎn)品深加工成本高，通過優(yōu)化工藝可以在相同的時間內(nèi)從菌絲體中提取到更多的茶樹菇多糖，能制作更經(jīng)濟實惠的且有利于人體健康的茶樹菇多糖深加工產(chǎn)品，實現(xiàn)經(jīng)濟效益與社會效益并存的“雙贏”價值。