菘藍碳氮代謝與基質C/N對氮處理的動態(tài)響應

崔英靜 孫莉瓊 師建玲 李曉帆 鮑婷婷 王峰峰唐曉清， 王康才

（1南京農業(yè)大學中藥研究所，江蘇 南京 210095；2蘇州啟帆農業(yè)科技有限公司，江蘇 蘇州 212000）

菘藍（IsatisindigoticaFort.）為十字花科菘藍屬兩年生草本植物，葉、根均可入藥，分別為大青葉與板藍根，大青葉具有清熱解毒、涼血消斑的功效，板藍根具有清熱解毒、涼血利咽的功效［1］，其藥典指標成分分別為靛玉紅、（R，S） -告依春。菘藍葉內的靛藍是重要的天然染料，廣泛應用于食品、醫(yī)藥和印染工業(yè)。靛藍、靛玉紅為吲哚類生物堿，（R，S） -告依春是含有氮雜環(huán)結構的生物堿，這三種成分均是含氮化合物，其含量受外源氮素的影響。氮是植物生長所必需的大量元素之一，對植物體內的碳氮代謝起著至關重要的作用。已有研究表明，施加氮素的用量、形態(tài)及相應的配比顯著影響菘藍葉、根指標成分的累積及產量［2-4］，靛藍、靛玉紅［5］和（R，S） -告依春［6］含量隨著氮素濃度的增加呈現先增加后減少的變化趨勢。但前人研究多注重施氮后單一時間點的變化，缺少施氮后菘藍碳氮代謝關鍵酶、基因表達量及有關化合物的動態(tài)變化過程研究。

土壤有機質對改良土壤耕性、調節(jié)土壤結構具有重要作用。土壤全氮是指土壤中所有形式的有機氮與無機氮的綜合，是為植物生長提供有效氮的庫。土壤C/N 是衡量土壤營養(yǎng)平衡的重要指標，其值大小影響土壤的氮循環(huán)［7］。植物吸收氮素后，其自身各部位C/N同時變化，不同器官的C/N 反映了其對生存環(huán)境的適應，一般植物向低C/N 變化［8］。植物碳氮代謝受多個基因的影響［9-11］，因碳氮代謝的復雜性，影響碳氮代謝的基因具有多種生理生化功能［12-13］，其中，BIG基因的突變體會導致擬南芥C/N 增大，進而調節(jié)植物碳氮平衡［14］。鑒于此，本試驗通過外源施加氮素改變基質C/N，影響菘藍吸收氮素的性能，在此過程中，測定基質與菘藍葉、根的碳素與氮素含量，計算基質與菘藍葉、根C/N；測定碳代謝關鍵酶磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（phosphoenolpyruvate carboxylase，PEPC）和蔗糖磷酸合成酶（sucrose phosphate synthase，SPS）與氮代謝關鍵酶硝酸還原酶（nitrate reductase，NR）、谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase，GS）、谷氨酸合成酶（glutamate synthetase，GOGAT）的活性及其基因表達量，揭示基質C/N 變化后菘藍碳、氮代謝的動態(tài)變化過程；最后測定菘藍葉、根指標成分在施氮后的含量變化，分析施氮后菘藍葉、根的適宜采收時間，以期為菘藍氮營養(yǎng)的高效利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以河北居群的菘藍種子（角果）為試驗材料，經南京農業(yè)大學唐曉清教授鑒定為十字花科植物菘藍（IsatisindigoticaFort.）。

1.2 試驗設計

于2022 年4 月播種，避雨盆栽，每盆定植4 株。栽培基質為蛭石∶珍珠巖（2∶1），基本營養(yǎng)液采用霍格蘭營養(yǎng)液配方，pH 值為6.0；KH2PO4提供菘藍生長所需的磷、鉀。出苗30 d后，設置4組處理，每組20盆，處理液分別為0、5、15、20 g·L-1的CO（NH2）2，記為CK、N1、N2、N3，隔4 d處理一次，每盆施加處理液100 mL，共處理4次。在4次處理結束后12、28、44、64 d取樣。每次取樣，取3盆12株菘藍葉、根的相同部位，約10 g鮮樣，混合后剪碎并于-80 ℃冰箱保存，用于測定碳氮代謝關鍵酶的活性及其基因表達量。收取整株菘藍，葉、根分開，108 ℃殺青，60 ℃烘干至恒重，粉碎過60目篩，干燥保存，用于測定靛藍、靛玉紅和碳氮元素含量。將已收取菘藍的3 盆基質充分混勻，取適量基質（干燥前約10 g），用于測定其碳氮元素含量。

1.3 測定項目與方法

1.3.1 基質、菘藍碳和氮元素含量的測定 采用重鉻酸鉀外加熱法［15］測定基質和植物碳元素含量，采用F30800090 CN 802碳氮分析儀（意大利VELP Scientifica Srl公司）對全氮含量進行分析，計算基質及菘藍葉、根的C/N。每個處理重復3次。

1.3.2 碳氮代謝關鍵酶活性的測定 使用BC2195磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）活性檢測試劑盒、BC0605 蔗糖磷酸合成酶（SPS）活性檢測試劑盒（北京Solarbio 公司）測定碳代謝關鍵酶PEPC、SPS 的活性。氮代謝關鍵酶NR、GS、GOGAT 的活性使用A096-1-2硝酸還原酶試劑盒（南京建成生物工程研究所）、BC0915谷氨酰胺合成酶（GS）活性檢測試劑盒、BC0075谷氨酸合成酶（GOGAT）活性檢測試劑盒（北京Solarbio公司）測定。每個處理重復3次。

1.3.3 碳氮代謝關鍵酶基因表達量的測定 將-80 ℃冰箱中菘藍葉、根的凍存樣品碾碎充分混勻后取適量于液氮中研磨，而后取約0.3 g 平均分成3 份，按RR047A RNAsimple Total RNA Kit 試劑盒（北京TIANGEN 公司）方法提取菘藍葉、根的RNA，反轉錄使用Primer ScriptTMRT reagent kit with gDNA Eraser（Derfect Real Time）（北京寶日醫(yī)生物技術有限公司）體系，以TIP41作為內參基因［16］，碳代謝關鍵酶PEPC、SPS和氮代謝關鍵酶NR、GS、GOGAT基因表達量采用實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRTPCR）方法測定，使用2×T5 Fast qPCR Mix（SYBR Green l）體系（北京擎科生物科技有限公司），具體所用引物見表1，體系混合后由QuantStudio 6 Flex 熒光定量PCR儀（美國賽默飛公司）測定后，分析程序運行結果時，假定目的片段和內參基因的擴增效率一致，均為100%，用2-ΔΔCT法定量分析，每個處理重復3次。

表1 碳氮代謝關鍵酶基因的引物Table 1 Primers for key enzyme genes of carbon and nitrogen metabolism

1.3.4 葉中靛藍、靛玉紅含量的測定 參照《中華人民共和國藥典》（2020版一部）［1］高效液相色譜法（通則0512），采用超高效液相色譜（ultra-high-performance liquid chromatography，UPLC）法測定靛藍和靛玉紅含量，條件略作修改，分析柱為Aglient ZORBA×Eclidise Plus C18（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）；流動相為甲醇-水（v∶v=72∶28）；流速0.30 mL·min-1；柱溫30 °C；檢測波長289 nm；進樣體積2 μL。以靛藍、靛玉紅的色譜峰面積（Y）與其對應的含量（X，μg·mL-1）作標準曲線，計算回歸方程。靛藍：Y1=892.05X1+1 406.3，R12=0.988 9（n=3），線性范圍為0～10 μg·mL-1，靛玉紅：Y2=51 134X2-2 441.5，R22=0.997 7（n=3），線性范圍為0～10 μg·mL-1。供試品溶液的制備：精密稱定0.25 g菘藍葉細粉，置于索氏提取器中，加三氯甲烷浸泡15 h，加熱回流提取至提取液無色?；厥杖軇┲粮桑瑲堅蛹状既芙獠⑥D移至100 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，過濾，取續(xù)濾液備用。精密吸取對照品溶液2 μL，注入超高效液相色譜儀測定相應峰面積，根據標準曲線計算即得靛藍、靛玉紅含量。每個處理重復3次。

1.3.5 根中(R,S) -告依春含量的測定 參照《中華人民共和國藥典》（2020版一部）［1］高效液相色譜法（通則0512），UPLC 條件同1.3.4，流動相為甲醇-0.02%磷酸（v∶v=7∶93）。以（R，S）-告依春色譜峰面積（Y）與其對應的含量（X，μg·mL-1）作標準曲線，計算回歸方程：Y=183.49X+227.32，R2=0.994 9（n=3），線性范圍為0～100 μg·mL-1。供試品溶液的制備：精密稱定1 g 菘藍根細粉，置于圓底瓶中，精密加入水50 mL，稱定重量，煎煮2 h，放冷，再稱定重量，用水補足減失的重量，搖勻，過濾，取濾液，得供試品溶液。其余操作同1.5，每個處理重復3次。

1.4 數據處理

采用Excel 2019 及SPSS 20.0 軟件中的單因素方差分析法（P＜0.05）進行數據分析，處理間顯著性比較采用Duncan’s新復極差法。

2 結果與分析

2.1 施氮后菘藍葉與根碳代謝的動態(tài)變化

菘藍葉中，隨著施氮后天數的增加，CK、N1 的PEPC 活性呈現先降低后升高再降低的趨勢，N2 則先降低后升高，N3 逐漸降低（表2）；菘藍葉中N1、N2、N3的PEPC基因表達量呈現先升高后降低的趨勢（圖1）；SPS 的活性均隨著時間延長呈現先降低后升高的變化趨勢；N1 的SPS基因表達量呈現先降低后升高再降低的趨勢，N2 則呈現先降低后升高的趨勢，N3 的變化趨勢與N1 相反。不同處理組的碳代謝產物可溶性糖含量的變化不同（圖2）。隨著施氮后天數的增加，CK 葉中可溶性糖含量逐漸增加，N1、N2、N3 的可溶性糖含量先減少后增加。不同天數，處理組生物量整體高于對照組，各組生物量隨施氮后天數的增加逐漸增加（表3）?？傮w分析，N1、N2、N3可溶性糖含量與PEPC基因表達量的變化趨勢相反，與SPS 活性的變化趨勢相似。施氮12、28、64 d 后，N2 中PEPC 的活性高于其他組，PEPC基因表達量在施氮后12～64 d較高。N2、N3的SPS活性在施氮12、64 d 較高，CK、N1 的SPS 活性在施氮后12、64 d較高。施氮后12、64 d，N2的SPS基因表達量高于其他組。

圖1 施氮后菘藍葉與根中碳代謝關鍵酶酶基因的表達（n=3）Fig.1 Expression of key enzyme genes of carbon metabolism in I.indigotica leaves and roots after nitrogen application （n=3）

圖2 施氮后菘藍葉與根中可溶性糖含量的變化（n=3）Fig.2 Changes of soluble sugar content in I.indigotica leaves and roots after nitrogen application （n=3）

表2 施氮后菘藍葉與根中碳代謝關鍵酶活性的變化（n=3）Table 2 Changes of key enzyme activities of carbon metabolism in I.indigotica leaves and roots after nitrogen application （n=3）

表3 施氮后菘藍生物量的變化（n=10）Table 3 Changes of biomass of I.indigotica after nitrogen application （n=10）/g

菘藍根中，隨著施氮后時間延長，CK、N1、N2、N3的PEPC、SPS活性均呈現先降低后升高的趨勢；N1、N2的PEPC基因表達量先升高后降低，N3 先降低后升高再降低；N1、N3 的SPS基因表達量先降低后升高，N2先降低后升高再降低；同時，CK、N1、N2、N3 根中可溶性糖含量先降低后升高?？傮w分析，N1、N2、N3可溶性糖含量與PEPC基因表達量的變化趨勢相反，與SPS活性的變化趨勢相似，該結果與葉相同。施氮后28～64 d，N2 的PEPC 活性及基因表達量高于其他組。施氮后12、28、64 d，SPS 的活性較高，SPS基因表達量在施氮后12、44、64 d 較高。N3 施用氮素多于N2，但其對碳代謝關鍵酶活性及基因表達量的促進作用略低于N2。

2.2 施氮后菘藍葉與根氮代謝的動態(tài)變化

菘藍葉中，隨著施氮后天數的增加，CK的NR活性先升高后降低，N1 先降低后升高，N2、N3 則先降低后升高再降低（表4）；N1 的NR基因表達量逐漸降低，N2、N3則先升高后降低（圖3）；CK的GS活性先升高后降低，N1 先升高后降低再升高，N2 先降低后升高，N3逐漸降低；N1 的GS基因表達量先降低后升高再降低，N2、N3 先升高后降低；CK 的GOGAT 活性先升高后降低再升高，N1 先降低后升高再降低，N2、N3 則先升高后降低；N1、N2、N3 的GOGAT基因表達量均先升高后降低再升高。GS 與GOGAT 活性、基因表達量的變化趨勢相反。隨著施氮后天數的增加，CK、N3 的靛藍含量先增加后減少，N1 逐漸減少，N2 先增加后減少再增加，僅N1 組靛藍含量的最大值出現在施氮后12 d，其余處理組靛藍含量的最大值均出現在施氮后28 d，施氮后28 d，N2 組靛藍含量顯著高于CK，為0.37 mg·g-1（圖4）；CK、N1 的靛玉紅含量先減少后增加再減少，N2、N3 則先增加后減少，各處理靛玉紅含量的最大值均出現在施氮后44 d，其中N2 最高，為0.74 mg·g-1。總體分析，CK 靛藍含量與NR、GS 活性的變化趨勢相似，靛玉紅含量與GOGAT 活性的變化趨勢相反。N1的靛藍含量與NR基因表達量變化趨勢相似；靛玉紅含量與GS基因表達量、GOGAT 活性變化趨勢相似，與GOGAT基因表達量、GS 活性變化趨勢相反。N2 靛藍含量與NR活性的變化趨勢相反，與GOGAT基因表達量的變化趨勢相似；靛玉紅含量與NR、GS基因表達量、GOGAT 活性的變化趨勢相似。N3 靛藍、靛玉紅含量與NR、GS基因表達量、GOGAT 活性的變化趨勢相似。施氮后12～64 d，N2的NR 活性始終處于較高水平。施氮后12、28、44、64 d，GS 和GOGAT 活性升高的時間點相互交錯，如N1 菘藍葉中GS 活性先升高后降低再升高，GOGAT 活性則先降低后升高再降低。施氮后12、28、64 d，NR基因表達量表現為N3＞N2＞N1，施氮后44 d則表現為N2＞N3＞N1。施氮后12、44、64 d，GS基因表達量表現為N2＞N1＞N3，施氮后28 d 則表現為N3＞N2＞N1。試驗過程中，GOGAT基因表達量均表現為N2＞N1＞N3。總體上，N2氮代謝關鍵酶的活性較高。

圖4 施氮后菘藍葉與根中指標成分的變化（n=3）Fig.4 Changes of index components in I.indigotica leaves and roots after nitrogen application （n=3）

表4 施氮后菘藍葉和根中氮代謝關鍵酶活性的變化（n=3）Table 4 Changes of key enzyme activities of nitrogen metabolism in I.indigotica leaves and roots after nitrogen application （n=3）

菘藍根中，隨著施氮后天數的增加，CK、N1、N2 的NR 活性先升高后降低，N3 先降低后升高；N1、N3 的NR基因表達量逐漸降低，N2 先降低后升高；CK 的GS活性逐漸升高，N1、N2、N3先升高后降低再升高；N1的GS基因表達量先降低后升高再降低，N2 先降低后升高，N3 逐漸降低；CK 的GOGAT 活性逐漸降低，N1、N2先升高后降低再升高，N3 先升高后降低；N1 的GOGAT基因表達量先降低后升高再降低，N2 先升高后降低，N3 逐漸降低；根中（R，S）-告依春的含量逐漸增加，各處理最大值均出現在施氮后64 d，（R，S）-告依春含量表現為N2＞N1＞N3＞CK，最大值為7.50 mg·g-1。N1 的NR基因表達量變化趨勢與葉相似，N2、N3 與葉相反。在菘藍葉、根中，GS 與GOGAT 活性均存在相反的變化趨勢。碳代謝關鍵酶SPS的活性和基因表達量與氮代謝第1 個關鍵酶NR 的活性和基因表達量變化趨勢相反。PEPC 的活性和基因表達量與NR 變化趨勢相似。分析施氮后菘藍葉、根中指標成分含量的變化與處理濃度的相關性（表5），除施氮后44 d 葉中靛藍含量、施氮后28 d 根中（R，S）-告依春含量與處理濃度的相關性較小外，其余時間點菘藍指標成分含量均與氮素濃度顯著相關。

表5 施氮后菘藍葉和根中指標成分含量與氮素濃度的相關性分析Table 5 Correlation analysis between changes in index component content and nitrogen concentration in leaves and roots of I.indigotica after nitrogen application

2.3 施氮對基質碳氮比的影響

外源施加氮素可以降低基質C/N。施氮后，基質及菘藍葉、根碳氮含量及碳氮比的變化見圖5。處理結束后（0 d），處理組N1、N2、N3 基質中的氮含量高于CK，此時各組的C/N 最小。隨著施氮后天數的增加，基質中的碳含量逐漸增加，氮含量則逐漸減少。施氮后64 d，N1、N2、N3基質的碳元素含量比CK低2.86%、1.29%、23.32%；僅N1 氮元素含量較CK 低1.10%，N2、N3 氮元素含量則分別較CK 高23.78%、21.71%。隨著施氮后天數的增加，各組基質的C/N 逐漸增大，CK、N1組基質C/N整體顯著高于N2、N3。

菘藍碳、氮含量的變化趨勢與基質相反。隨著施氮后天數的增加，菘藍葉、根中的碳含量呈波動變化，而氮含量整體逐漸增加，C/N 整體逐漸減小。各組葉中氮含量在施氮后12～28 d 的增加量較大，同時，吸收氮素關鍵酶NR 活性較大，根中同樣存在此規(guī)律。菘藍葉中碳元素含量整體呈現先減小后增加的變化趨勢；根中碳元素含量整體呈現逐漸減小的變化趨勢。葉中C/N 在施氮后28 d表現為CK＞N1＞N2＞N3；施氮后44 d 表現為CK＞N1＞N3＞N2；施氮后64 d 表現為N1＞CK＞N3＞N2。根中C/N 在施氮后12 d 表現為N3＞CK＞N1＞N2；施氮后28 d 后表現為N1＞CK＞N3＞N2；施氮后44 d 表現為N1＞CK＞N3＞N2；施氮后64 d 表現為CK＞N1＞N3＞N2。

3 討論

3.1 氮素對菘藍C/N的影響

土壤C/N 直接反映土壤肥力大小。外源施加氮素使基質C/N 減小，土壤肥力增大。隨著菘藍生長進程的推進，基質中碳含量逐漸增加，氮含量逐漸降低；與之相反，菘藍葉、根中的碳含量減少，氮含量增多。栽培菘藍后的基質C/N明顯增大，肥力發(fā)生變化。施氮后64 d，基質氮含量由高到低分別為N2、N3、CK、N1，與土壤氮素殘留量隨土壤C/N 的增大而逐漸增加的結論相符［20］，這可能是因為植物對氮元素的吸收受基質本身含有氮素的限制。

器官代謝越活躍時，氮分布越多，該器官C/N 越小［21］。本研究發(fā)現，施氮后，菘藍葉、根C/N逐漸降低，即菘藍體內的代謝活動增強，與施氮后菘藍碳氮代謝關鍵酶活性增大的現象相符。N2、N3 菘藍葉、根的C/N 小于N1 及CK，這說明N2、N3 組菘藍的代謝較強。植物通過降低C/N 使其在較短的時間內吸收較多養(yǎng)分以滿足其生長需求［22］。植物不同部位C/N 不同，體現了植物對自身氮素的分配［8，21］。施氮后菘藍葉的C/N小于根，說明菘藍葉的代謝活動強于根［21］?？梢姡~是菘藍進行各種代謝的主要部位。

3.2 外源施加氮素后菘藍碳、氮代謝的變化

外加氮源可直接影響菘藍的氮代謝，間接影響與氮代謝相互制約的碳代謝。碳代謝為植物的基本代謝，其代謝產物貫穿氮代謝等其他代謝過程，為其提供碳骨架、ATP等，而氮代謝為碳代謝提供其需要的氨基酸及酶［23］。NR 為氮代謝的第一個關鍵酶，其活性大小可以直接反映植物的氮代謝能力［24］。外加氮素可以增大菘藍NR 活性。施加不同濃度氮素，菘藍葉和根中碳、氮代謝關鍵酶的活性及其基因表達量升高的時間點不同。葉中NR 活性及基因表達量均高于根，同時葉中氮素含量高于根，這說明葉吸收氮素更多，造成該現象的主要原因可能是葉需要更多的氮素滿足其代謝的基本需求。N2 的NR 活性高于其他組，N2 組菘藍葉、根中氮元素的增大量高于其他組，說明N2 組菘藍所吸收的氮素較多。GS 催化含氮無機化合物合成谷氨酰胺（glutamine，Gln），是將無機氮轉化為有機氮的一條主要途徑，其活性是衡量植物氮素同化的重要生理指標，GOGAT 與GS 構成循環(huán)，參與氮的初級吸收等［25］。施氮后，GS、GOGAT 活性及基因表達量升高的時間點晚于NR，這可能是由二者所催化的反應以NR所催化的反應產物為底物而致［25］。

PEPC 是植物固定CO2的第一個關鍵酶，可催化磷酸烯醇式丙酮酸（phosphoenolpyruvate，PEP）生成草酸乙酰等［26］，而PEP 是合成吲哚等生物堿的關鍵物質［27］，菘藍葉中的靛藍、靛玉紅均屬于吲哚類生物堿。PEPC 亦可調節(jié)C/N［28］。本研究發(fā)現，在菘藍葉和根中，N2 的PEPC 活性及基因表達量較高。碳代謝關鍵酶PEPC 與氮代謝關鍵酶NR 的活性及基因表達量變化趨勢相似，在施氮后12～28 d 較大，結合菘藍葉、根中氮素在施氮后12～28 d 增大量較大的現象，綜合說明PEPC 活性與菘藍吸收的氮元素量呈正相關。SPS是調控蔗糖合成的關鍵酶，SPS 活性與植物蔗糖含量成正比［29］。蔗糖是植物的儲能物質，具有多種生理作用。施氮64 d后菘藍根中SPS活性與基因表達量較施氮后28、44 d顯著升高，這可能是因為生長后期菘藍將一部分營養(yǎng)物質向地下部分轉移［30］，符合菘藍葉、根中可溶性糖含量在施氮后64 d 升高的結果。PEPC 參與產能反應［26］，SPS催化能量儲存物質的合成，二者所催化反應的屬性相反，本試驗同樣發(fā)現PEPC 與SPS活性及基因表達量的變化趨勢相反，這可能是因為施加氮素后，菘藍首先進行的氮代謝強度較高，消耗能量；之后菘藍的氮代謝強度減弱，累積能量。

菘藍內的指標成分對不同氮水平的響應不同［31］。施氮后，N2處理的菘藍葉、根中的指標成分含量較高，但其含量達到最高的時間點不同，造成該現象的原因可能是菘藍不同生長時期對其相應指標成分的需求量不同。

4 結論

本研究發(fā)現，隨著施氮后天數的增加，菘藍葉、根中累積的氮素逐漸增多，與此相反，基質中的氮素減少；碳代謝關鍵酶PEPC 活性呈波動變化，SPS 活性及基因表達量、可溶性糖含量先減小后增加；碳代謝產物可溶性糖含量與PEPC基因表達量的變化趨勢相反。氮代謝產物靛藍、靛玉紅、（R，S）-告依春含量與NR、GS、GOGAT 活性及基因表達量密切相關。15 g·L-1CO（NH2）2處理的各種酶活性及基因表達量較高。葉中靛藍、靛玉紅及根中（R，S）-告依春的含量分別在施氮后28、44、64 d 較高，15 g·L-1CO（NH2）2處理更有助于菘藍指標成分的累積。