基于網(wǎng)絡(luò)藥理學從線粒體自噬途徑探討八味沉香散抗缺血性心臟病的作用機制

岳棟芳,李彩霞,官 敏,李永芳

(青海大學醫(yī)學部,青海 西寧 810001)

近年來,我國心血管疾病的發(fā)病率和死亡率逐年上升[1],其中缺血性心臟病(ischemic heart disease, IHD)是導致心血管疾病患者死亡的重要原因。線粒體作為心肌能量的供應者,還參與維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)、影響心肌細胞的凋亡和壞死,在IHD的發(fā)病過程中起關(guān)鍵作用[2]。因此,線粒體對于維護心肌功能和存活具有重要意義,被認為是治療IHD的潛在靶點。

八味沉香散系藏藥復方,具有清心熱、寧心神的功效。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)八味沉香散,可緩解線粒體腫脹,減輕線粒體損傷,改善異丙腎上腺素誘導的心肌缺血模型大鼠的心舒縮功能[3],但其具體機制尚不明確。線粒體自噬是一種選擇性自噬途徑,可特異性消除受損及功能異常的線粒體,維持線粒體穩(wěn)態(tài)[4]?？紤]到八味沉香散多成分多靶點的特性以及疾病本身的復雜性,本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學方法,從線粒體自噬途徑探討八味沉香散保護線粒體緩解心肌缺血的作用機制。

1 材料與方法

1.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學研究材料與方法

1.1.1八味沉香散入血成分靶點查詢 課題組前期分別應用UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS和GC-MS技術(shù)對八味沉香散的水溶性入血組分[5]和揮發(fā)性入血組分進行了分析鑒定,得到水溶性入血組分16個,揮發(fā)性入血組分26個。在PubChem數(shù)據(jù)庫檢索并下載各個入血組分2D結(jié)構(gòu)的*.sdf文件。依次導入SwissTargetPrediction平臺,選擇物種為“Homo sapiens”進行靶點預測,從結(jié)果中篩選出可能性大于0的靶點。同時在TCMSP和DrugBank數(shù)據(jù)庫中進行檢索補充。利用UniProt數(shù)據(jù)庫將獲得的靶點蛋白名稱轉(zhuǎn)化為標準的基因名稱。結(jié)果合并去重后作為入血成分的候選靶點。

1.1.2線粒體自噬及缺血性心臟病相關(guān)靶點獲取 分別以“Myocardial ischemia”、“Ischemic heart disease”、“Myocardial infarction”和“Mitochondrial Autophagy”、“Mitophagy”為關(guān)鍵詞,在GeneCards數(shù)據(jù)庫、NCBI及OMIM數(shù)據(jù)庫中進行檢索,分別合并去重復后得到缺血性心臟病和線粒體自噬相關(guān)靶點。將八味沉香散入血成分靶點、線粒體自噬靶點和缺血性心臟病靶點導入Venny 2.1在線平臺(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)獲取交集靶點,繪制韋恩圖,作為八味沉香散經(jīng)線粒體自噬途徑治療缺血性心臟病的潛在靶點。

1.1.3“成分-疾病-靶點”網(wǎng)絡(luò)和“蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建分析 將入血成分和交集靶點導入Cytoscape 3.8.2軟件,構(gòu)建“成分-疾病-潛在靶點”網(wǎng)絡(luò),進行網(wǎng)絡(luò)分析,計算Betweenness Centralities(BC)、Closeness Centralities(CC)、Degree Centralities(DC)值,篩選出BC、CC、DC均為前10的成分作為八味沉香散經(jīng)線粒體自噬途徑治療缺血性心臟病關(guān)鍵活性成分。將交集靶點導入STRING數(shù)據(jù)庫,設(shè)置物種為“Homo sapiens”,最低相互作用評分≥0.7,隱藏游離靶點構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò),保存為*tsv文件后導入Cytoscape 3.8.2軟件,利用cytoHubba插件進行網(wǎng)絡(luò)分析,篩選出BC、CC、DC均為前10的靶點作為八味沉香散通過線粒體自噬途徑治療缺血性心臟病的核心靶點。

1.1.4GO、KEGG富集分析 將交集靶點輸入到DAVID數(shù)據(jù)庫,設(shè)置物種為“Homo sapiens”分別進行GO和KEGG富集分析,篩選出P<0.01的富集結(jié)果,繪制GO富集條圖和KEGG富集氣泡圖。

1.1.5分子對接 在PubChem數(shù)據(jù)庫中查詢關(guān)鍵活性成分的3D結(jié)構(gòu)并保存為*.sdf格式,然后利用Pymol軟件轉(zhuǎn)化為*.pdb格式。在PDB數(shù)據(jù)庫中下載核心靶點的蛋白3D結(jié)構(gòu),利用Pymol軟件分別對蛋白質(zhì)進行去溶劑、去除小分子有機物、去除配體等前處理,保存為*.pdb格式。通過AutoDock軟件分別對蛋白質(zhì)、化合物進行加氫原子等處理,同時設(shè)置小分子的可旋轉(zhuǎn)鍵,完成后將處理后的靶蛋白和化合物保存為*.pdbqt格式。根據(jù)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)大小設(shè)置Grid Box參數(shù)。運行Vina 1.5.6進行分子對接,模擬靶標和入血分子結(jié)合模式,計算結(jié)合能,結(jié)合能小于0表明可以自由結(jié)合。最后通過Pymol軟件將靶蛋白和入血成分結(jié)合的最優(yōu)構(gòu)象結(jié)果可視化。

1.2 細胞實驗驗證材料與方法

1.2.1細胞、動物與藥物 H9C2心肌細胞購于武漢普諾塞生命科技有限公司(貨號 CL-0089)。SD雄性大鼠(體質(zhì)量200～250 g)由西安交通大學動物中心提供,本實驗已通過青海大學動物倫理委員會批準。八味沉香散購于西藏神猴藥業(yè)有限公司(批號20210801)。

1.2.2主要試劑與儀器 DMEM培養(yǎng)基,武漢普諾賽生命科技有限公司;0.25%胰蛋白酶-EDTA、雙鏈霉素,北京索萊寶生物科技有限公司;胎牛血清,依科賽生物技術(shù)有限公司;CCK-8細胞活性試劑盒,Elabscience公司;PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、p62單克隆抗體,美國CST公司(貨號 4257、17366、4691、4060、23214);LC3B單克隆抗體,美國abCAM公司(貨號ab192890);β-actin、HRP標記羊抗兔二抗,武漢博士德生物工程有限公司(貨號BA1054、M01263);ECL發(fā)光液,默克密理博(中國)有限公司;H100移動式三氣培養(yǎng)箱,上海力康公司;Varioskan LUX多功能酶標儀酶標儀,賽默飛世爾科技(中國)有限公司;Bio-Rad垂直電泳儀,美國伯樂公司;AI600images凝膠成像儀,美國通用電氣公司。

1.2.3含藥血清制備 20只雄性SD大鼠適應性喂養(yǎng)7 d后隨機分為空白組、八味沉香散藥物組(每日1.0 g·kg-1),每組10只。灌胃給藥10 d(空白組給等體積生理鹽水),末次給藥前禁食12 h,給藥30 min后異氟烷吸入麻醉,腹主動脈取血,3 500 r·min-1離心10 min,分離血清。各組血清混合均勻后用0.22 μm濾器除菌后分裝,保存于-80 ℃冰箱中備用。

1.2.4細胞干預 H9C2細胞用添加10%胎牛血清、1%青、鏈霉素的高糖培養(yǎng)基置于37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。參照課題組前期造模方法[6],取對數(shù)生長期的H9C2細胞,分為空白組(完全培養(yǎng)基+20%空白組血清)、模型組(無糖培養(yǎng)基+20%空白組血清)、八味沉香散含藥血清組(無糖培養(yǎng)基+20%八味沉香散含藥血清)。添加含藥血清后先置于常氧培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)1 h,然后將模型組、含藥血清組轉(zhuǎn)移至三氣培養(yǎng)箱中,設(shè)置O2濃度為2%,37 ℃培養(yǎng)8 h;空白組繼續(xù)置于常氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 h。

1.2.5細胞活性檢測 取對數(shù)生長期的H9C2細胞,胰酶消化后用培養(yǎng)基重懸制備單細胞懸液,調(diào)節(jié)細胞密度為1×104接種于96孔板,待細胞貼壁后,按1.2.4項下方法進行處理。培養(yǎng)結(jié)束后棄去培養(yǎng)液,加入100 μL含10%CCK8的高糖培養(yǎng)基。37 ℃培養(yǎng)1 h,設(shè)置酶標儀波長為450 nm處測定OD值。

1.2.6蛋白免疫印跡法測定蛋白表達量 按“1.2.4”項下方法干預細胞后,使用含1%蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑2、磷酸酶抑制劑3的RIPA裂解液冰上裂解30 min,離心取上清,收集細胞總蛋白樣品。BCA法定量。利用SDS凝膠電泳分離樣品并通過濕法轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,5%的脫脂奶粉室溫封閉1 h,對應一抗4 ℃孵育過夜,洗膜,室溫下二抗孵育1 h,洗膜,采用化學發(fā)光法顯影并拍照保存,ImageJ軟件分析蛋白條帶發(fā)光強度。

2 結(jié)果

2.1 八味沉香散入血成分靶點預測及疾病靶點和疾病相關(guān)靶點獲取八味沉香散入血成分見Tab 1,合并去重得到八味沉香散候選靶點706個。缺血性心臟病相關(guān)靶點2 475個,線粒體自噬相關(guān)靶點1 042個(檢索結(jié)果見Tab 2)。導入Venny 2.1繪制venny圖(Fig 1),得到132個交集靶點作為八味沉香散經(jīng)線粒體自噬途徑治療缺血性心臟病的潛在靶點。

Tab 1 Targets of serum constituents of Bawei Chenxiang powder predicted by databases

Tab 2 Search results of ischemic heart disease target, mitophagy target

Fig 1 Venn diagram summarizing common targetsof IHD, mitophagy and BWCX

2.2 “成分-疾病-潛在靶點”網(wǎng)絡(luò)和PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建分析將42個八味沉香散入血成分和132個交集靶點導入Cytoscape 3.8.2軟件,繪制“成分-疾病-潛在靶點”網(wǎng)絡(luò)圖(Fig 2),利用Network Analyzer功能進行網(wǎng)絡(luò)分析,得到9個BC、CC、DC均位于前十的化合物,分別是槲皮素(HHW37)、山奈酚(HHW38)、柚皮素(HHW39)、4,8,13-Cyclotetradecatriene-1,3-diol, 1,5,9-(HHW26)、去氫二異丁香酚(HHW40)、秦皮乙素(HHW29)、肉豆蔻醚(HHW20)、9-Hexadecenoic acid(HHW24)、異丁香酚甲醚(HHW18)。

交集靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)(Fig 3)包括126個節(jié)點,2 206條邊。節(jié)點越大顏色越深表示其degree值越大。利用cytoHubba插件進行網(wǎng)絡(luò)分析,篩選出BC、DC、CC值排名均位于前十的靶點分別是TP53、AKT1、STAT3、MAPK3、EGFR、JUN、MAPK1、CASP3,這些靶點可能是八味沉香散調(diào)節(jié)線粒體自噬治療缺血性心臟病的核心靶點。

Fig 2 “Ingredients-disease-potential target” network diagram

Fig 3 PPI network diagram of potential targets

2.3 GO富集分析和KEGG富集分析利用DAVID數(shù)據(jù)庫對132個交集靶點進行GO和KEGG富集分析。GO富集結(jié)果(P<0.01)顯示交集靶點涉及453個生物過程主要包括RNA聚合酶II啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、凋亡過程調(diào)控、蛋白磷酸化等;涉及84種分子功能,主要包括酶結(jié)合、相同蛋白結(jié)合、蛋白激酶活性等;參與構(gòu)成49種細胞成分,主要包括細胞質(zhì)、大分子復合物、細胞核、線粒體等。各個GO富集結(jié)果的前十條及參與靶點的個數(shù)見Fig 4。

KEGG富集結(jié)果(P<0.01)顯示,交集靶點參與148條信號通路,前20條如Fig 5所示,其中HIF-1信號通路[7]、EGFR信號通路[8]、PI3K-Akt信號通路[9]、MAPK信號通路[10]、FoxO信號通路[11]都直接參與線粒體自噬的調(diào)節(jié)。選取其中參與靶點數(shù)多且可信度高的PI3K-Akt信號通路進行后續(xù)驗證。

Fig 4 Results of gene function GO enrichment analysis

Fig 5 Results of gene KEGG pathway enrichment analysis

2.4 分子對接利用AutoDock Vina軟件進行分子對接,對接結(jié)果顯示核心靶點和關(guān)鍵活性化合物的結(jié)合能在-8.7～-4.2 kcal·mol-1之間(Fig 6),說明核心成分和關(guān)鍵靶點均可穩(wěn)定結(jié)合。對各核心靶點與其評分較高的化合物的優(yōu)勢構(gòu)象進行可視化(Fig 7),發(fā)現(xiàn)以上靶點與配體均可通過氫鍵作用相互結(jié)合。

2.5 八味沉香散含藥血清對H9C2細胞存活率的影響CCK-8法測定各組細胞存活率,結(jié)果如Fig 8所示,與空白組相比,模型組H9C2細胞存活率明顯下降(P<0.05);與模型組相比,八味沉香散含藥血清藥物組H9C2細胞存活率明顯提高(P<0.01)。結(jié)果表明缺氧會促使H9C2細胞活力明顯下降,而八味沉香散含藥血清可明顯提高缺氧條件下H9C2細胞的存活率。

2.6 八味沉香散含藥血清對H9C2細胞中LC3、p62、Akt、p-AKT、PI3K、p-PI3K蛋白表達的影響蛋白免疫印跡法測定H9C2細胞中LC3、p62、Akt、p-AKT、PI3K、p-PI3K蛋白表達,結(jié)果如Fig 9所示,與空白組相比,模型組H9C2細胞中p-PI3K/PI3K (P<0.01)和p-AKT/AKT (P<0.05)相對蛋白表達水平明顯降低,p62 (P<0.05)和LC3II/LC3I (P<0.01)相對蛋白表達水平明顯升高;與模型組相比,八味沉香散含藥血清組p62和LC3II/LC3I相對蛋白表達水平明顯降低(P<0.01),p-PI3K/PI3K (P<0.01)和p-AKT/AKT (P<0.05)相對蛋白表達水平明顯升高。提示八味沉香散通過激活PI3K/AKT信號通路抑制H9C2細胞中缺氧誘導的過度的線粒體自噬。

Fig 6 Heatmap of molecular docking of active components acting on core targets

Fig 7 Molecular docking models with high scores of active components acting on core targets

Fig 8 Comparison of H9C2 cell survival rate(n=6)

3 討論

缺血性心臟病是由冠脈血流量和心肌能量供應不平衡導致的病理狀態(tài),線粒體功能障礙是其重要的病理生理基礎(chǔ)。應激條件下的線粒體保護和質(zhì)量控制可以維持線粒體穩(wěn)態(tài),保持能量平衡來預防線粒體功能障礙的策略已被證明可以改善缺血誘導的心功能障礙。受損或功能失調(diào)的線粒體都可以通過線粒體自噬進行降解來消除,這對于維持線粒體穩(wěn)態(tài),確保能量供應和促進細胞存活至關(guān)重要。大量研究表明,線粒體自噬對心臟功能具有“雙重”影響,線粒體降解不足和增強都可能影響心肌細胞的存亡[4]。因此,開發(fā)能夠有效調(diào)節(jié)線粒體自噬維持線粒體穩(wěn)態(tài)的藥物對缺血性心臟病的防治具有重要意義。

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學,構(gòu)建并分析了八味沉香散入血成分通過線粒體自噬途徑抗缺血性心臟病的“成分-疾病-潛在靶點”網(wǎng)絡(luò),分析得到槲皮素、山奈酚、柚皮素等可能是其主要的物質(zhì)基礎(chǔ)。亦有研究證明槲皮素[12]、山奈酚[13]、柚皮素[14]、去氫二異丁香酚[15]均可通過線粒體途徑緩解心肌缺血。構(gòu)建潛在靶點的“PPI”網(wǎng)絡(luò),篩選出八味沉香散經(jīng)線粒體自噬途徑抗缺血性心臟病的關(guān)鍵靶點8個,包括TP53、AKT1、STAT3、MAPK3、EGFR、JUN、MAPK1、CASP3。蛋白激酶B(Akt)是許多保護性信號通路的匯合點,對缺血應激具有很強的心臟保護作用[9]。信號傳感器和激活因子3(STAT3)是STAT家族核轉(zhuǎn)錄因子的成員,通過Janus激酶(JAKs)的磷酸化被激活。參與保護呼吸鏈復合物I,優(yōu)化線粒體呼吸并限制活性氧形成,從而阻止線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mPTP)開放并確保線粒體完整性[16]。絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)1和MAPK3同屬MAPK家族,是MAPK/細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)信號級聯(lián)中兩個關(guān)鍵因子。MAPK/ERK通路是線粒體裂變的主要上游調(diào)節(jié)因子,在缺氧早期被激活,誘導早期的線粒體自噬[10]。核轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白-1(JUN)是MAPK下游的信號因子,參與MAPK介導的細胞凋亡和自噬[17]。表皮生長因子受體(EGFR)可通過獨立于其激酶活性的機制抑制哺乳動物雷帕霉素蛋白復合物2(mTORC2)/AKT途徑的線粒體自噬[8]。天冬氨酸蛋白酶3(CASP3)主要參與線粒體介導的細胞凋亡[18]。對關(guān)鍵活性成分和核心靶點進行分子對接,發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵活性成分和核心靶點均能自由結(jié)合,特別是槲皮素、柚皮素、山奈酚、去氫二異丁香酚對關(guān)鍵靶點有更強的結(jié)合活性,可能在其中發(fā)揮重要作用。

Fig 9 Effect of Bawei Chenxiang powder on protein expression of LC3, p62 and PI3K-AKT signaling pathway in H9C2 cells(n=3)

為探討八味沉香散經(jīng)線粒體自噬途徑抗缺血性心臟病的具體機制,對潛在靶點進行了KEGG富集分析,結(jié)果顯示八味沉香散可能通過缺氧誘導因子1(HIF-1)信號通路、EGFR信號通路、PI3K-Akt信號通路、MAPK信號通路、叉頭框轉(zhuǎn)錄因子O(FoxO)信號通路等多種途徑調(diào)控線粒體自噬來改善心肌缺血。為進一步探究預測結(jié)果的可靠性,選擇對參與靶點多且可信度相對較高的PI3K-AKT信號通路進行體外實驗驗證。通過糖氧剝奪模擬心肌缺血來建立H9C2心肌細胞缺氧模型,八味沉香散含藥血清作用于缺氧期間的H9C2細胞可明顯改善缺氧期間H9C2心肌細胞的存活率。LC3是自噬的重要參與者,在自噬過程中LC3-I轉(zhuǎn)化為LC3-II向囊泡膜上富集促進自噬體的形成,因此LC3-II/LC3-I的值是反映自噬水平的主要指標。p62為自噬銜蛋白,直接與LC3結(jié)合,并通過自噬選擇性降解,是另外一種自噬活性標志物。因此我們采用蛋白免疫印跡法測定H9C2細胞中LC3-II/LC3-I和p62相對表達量來評估自噬水平。結(jié)果顯示缺氧導致H9C2細胞中LC3-II/LC3-I和p62水平升高,添加八味沉香散含藥血清后該趨勢被扭轉(zhuǎn),說明八味沉香散含藥血清抑制了H9C2細胞中缺氧誘導的過度自噬。同時蛋白免疫印跡的結(jié)果也顯示八味沉香散含藥血清改善了缺氧誘導的H9C2細胞中p-AKT/AKT和p-PI3K/PI3K比率,提示八味沉香散可能通過增強PI3K-Ak信號通路抑制過度的線粒體自噬改善‘缺血’條件下心肌細胞的存活率。

綜上所述,本研究應用網(wǎng)絡(luò)藥理學系統(tǒng)的探討了八味沉香散經(jīng)線粒體自噬途徑抗心肌缺血的潛在成分、靶點和作用機制。通過分子對接技術(shù)驗證發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵活性物質(zhì)和核心靶點均有較好的結(jié)合活性,其中槲皮素、山奈酚,柚皮素,去氫二異丁香酚更具結(jié)合優(yōu)勢,可能是其重要的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。結(jié)合體外實驗初步證明八味沉香散可能通過PI3K-AKT信號通路調(diào)控線粒體自噬改善心肌缺血。本文為藏藥八味沉香散的進一步研究和應用提供了參考。