李繞勇,董奎奎,楊 闊,施秀梅,王梅琳,鄧 佳,3,王 芳,2*
(1.西南林業(yè)大學(xué)林學(xué)院,昆明 650224;2.西南林業(yè)大學(xué)/西南地區(qū)生物多樣性保育國家林業(yè)和草原局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,昆明 650224;3.西南林業(yè)大學(xué)/西南山地森林資源保育與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,昆明 650224)
獼猴桃ActinidiachinensisPlanch.是獼猴桃科Actinidiaceae 獼猴桃屬Actinidia的多年生落葉植物[1],果實(shí)營養(yǎng)豐富,富含維生素和多種礦質(zhì)元素及氨基酸,風(fēng)味較好且與大部分水果相比,Vc 含量高,是天然營養(yǎng)物質(zhì)元素來源之一[2-4]。中國是世界獼猴桃生產(chǎn)大國之一,然而,由于采后獼猴桃發(fā)生的軟腐病、青霉病、炭疽病及灰霉病等病害造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[5],其中由灰霉菌潛伏侵染而導(dǎo)致的腐爛造成的危害最為嚴(yán)重,腐爛率高達(dá)30%[6,7]。目前,對于獼猴桃采后貯藏保鮮技術(shù)仍以化學(xué)保鮮為主,但化學(xué)藥劑長期使用引起果蔬采后病害病原菌產(chǎn)生抗藥性,進(jìn)而降低其防腐效果;另一方面產(chǎn)生的大量農(nóng)藥殘留會引起食品安全和環(huán)境污染等問題[8,9]。因此,尋求安全高效的貯藏保鮮技術(shù)對果蔬的采后保鮮和人體健康有著重要的意義。拮抗微生物的生物防治技術(shù)以其高效、無農(nóng)藥殘留且易降解等特點(diǎn),逐漸成為當(dāng)前水果保鮮領(lǐng)域中的研究熱點(diǎn)[10,11]
已有研究表明,特基拉芽胞桿菌Bacillustequilensis對多種植物病原菌具有廣譜抗性。特基拉芽胞桿菌通過產(chǎn)生生物表面活性劑或脂肽等多種不同的抗菌物質(zhì)來抑制植物病原菌的生長,而且還能誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性[12,13]。郗良卿等[14]研究發(fā)現(xiàn)特基拉芽胞桿菌X-16 發(fā)酵液和發(fā)酵上清液對甜櫻桃褐腐病菌具有較好抑制效果,抑制率分別達(dá)到71.93%和67.14%。特基拉芽胞桿菌XT1-4 菌株對引起馬鈴薯黃萎病的大麗輪枝菌Verticilliumdlboatrum和黑白輪枝菌Verticilliumdahliae,防治效果均達(dá)到了 60%以上[15]。特基拉芽胞桿菌D5-8 對煙草寄生疫霉的保護(hù)防效達(dá)60%以上,治療防效達(dá)50%以上[13]。此外,特基拉芽胞桿菌7PJ-16菌株培養(yǎng)96 h 的發(fā)酵濾液對核盤菌Sclerotiniasclerotiorum、桑葚核地杖菌Scleromitrulashiraiana、紋枯病菌Thanatephoruscucumeris等10 種常見供試植物病原菌具有不同程度的抑制作用[16]。芽胞桿菌不僅可以抑制植物病原菌生長,還可以通過誘導(dǎo)植物自身抗性而增強(qiáng)植物的抗病能力[17]。其中,誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性反應(yīng)在生理生化方面主要是通過調(diào)控植物次生代謝產(chǎn)物及相關(guān)酶的催化活動來實(shí)現(xiàn)[18,19]。如地衣芽胞桿菌POT1 能誘導(dǎo)馬鈴薯酚類、黃酮類和花青素的合成增強(qiáng)自身抗病能力[20]。特基拉芽胞桿菌JN-369 誘導(dǎo)提高了水稻的超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)等抗病防御酶活性,從而抵抗水稻稻瘟病的侵染[21]。復(fù)合接種特基拉芽胞桿菌PKDN31 和地衣芽胞桿菌PKDL10 可以通過增加防御酶,如β-1,3 葡聚糖酶(GLU)、多酚氧化酶(PPO)、過氧化物酶(POD)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、幾丁質(zhì)酶(CHI)和總酚的積累誘導(dǎo)番茄對尖孢鐮刀菌的系統(tǒng)抗性[22]。本研究以前期分離自草莓果實(shí)表面對灰霉菌有較好抑菌效果的特基拉芽胞桿菌KXF 6501 作為供試菌株,通過體外平板對峙及獼猴桃果實(shí)接種試驗(yàn)研究了其不同培養(yǎng)時(shí)間發(fā)酵液對獼猴桃灰霉病的控制作用,在此基礎(chǔ)上探究了其發(fā)酵液處理對獼猴桃果實(shí)的誘導(dǎo)抗病機(jī)制及果實(shí)品質(zhì)的影響,以期為闡釋特基拉芽胞桿菌抑制獼猴桃采后灰霉病的作用機(jī)制提供理論支撐。
1.1.1 果實(shí) “紅陽獼猴桃”購于昆明市金馬寺批發(fā)市場。選取無損傷、質(zhì)量在100~120 g、無病蟲害、成熟度一致的果實(shí)。
1.1.2 試驗(yàn)菌株 特基拉芽胞桿菌B.tequilensisKXF 6501,分離自健康草莓果實(shí)表面,后保存于西南林業(yè)大學(xué)生物多樣性保育國家林業(yè)和草原局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。將其活化后,利用NA(牛肉膏3 g,蛋白胨10 g,NaCl 5 g)液體培養(yǎng)基于28 ℃、120 r/min 振蕩培養(yǎng)。
灰霉菌B.cinerea(BC),引起灰霉病,為本實(shí)驗(yàn)室前期從貯藏藍(lán)莓發(fā)病果實(shí)分離獲得,且可以侵染獼猴桃果實(shí)致病的菌株,將其用PDA(土豆200 g,蔗糖20 g,瓊脂粉15 g)培養(yǎng)基,置于25 ℃條件下進(jìn)行培養(yǎng)5 d,待病原菌產(chǎn)孢后用無菌水配成104CFU/mL 的孢子懸浮液備用。
將活化后的芽胞桿菌KXF 6501,接種到NA 液體培養(yǎng)基于28 ℃、120 r/min 振蕩培養(yǎng)24 h 后,調(diào)整濃度為1×107CFU/mL,取100 μL 至盛有250 mL NA 液體培養(yǎng)基的錐形瓶中搖勻,在28 ℃、120 r/min的條件下進(jìn)行培養(yǎng),分別于第2、4、6、12、24、48、72、96、120 和144 h 取樣,采用平板菌落計(jì)數(shù)法測定其活菌菌落數(shù),以菌落數(shù)的對數(shù)值為縱坐標(biāo),培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo),繪制菌株KXF 6501 生長曲線圖,試驗(yàn)重復(fù)2 次。
根據(jù)芽胞桿菌KXF 6501 生長曲線,選取進(jìn)入穩(wěn)定生長期前期和末期的發(fā)酵液(該時(shí)期發(fā)酵液較穩(wěn)定),即24 和96 h 的發(fā)酵液,采用平板對峙法[13]測定KXF 6501 培養(yǎng)時(shí)間發(fā)酵液的抑菌活性。25 ℃條件下培養(yǎng)灰霉菌5 d 后,用直徑5 mm 的打孔器取菌落邊緣的菌絲塊備用。在PDA 培養(yǎng)基中央接種灰霉菌菌絲塊,然后在距離培養(yǎng)皿中央3 cm 處的4 個(gè)無菌濾紙片上分別接種發(fā)酵液5 μL(濃度為1×107CFU/mL),以無菌水處理作為對照,置于培養(yǎng)箱中,25 ℃培養(yǎng)至對照組病原菌長滿整個(gè)培養(yǎng)皿,用十字交叉法測量病原菌的直徑,每個(gè)處理3 個(gè)重復(fù)。抑菌率(%)=(對照組病菌直徑—處理組病菌直徑)/對照組病菌直徑×100。
對果實(shí)進(jìn)行處理,處理方法參照馬電通等[23]的操作方法,略作修改,即將獼猴桃果實(shí)用75%酒精表面消毒后用蒸餾水清洗,自然晾干后分成3 組,在每個(gè)果實(shí)水平赤道的對稱位置用已消毒的打孔釘打2 個(gè)孔(直徑4 mm,深5 mm),待傷口晾干后,分別加入15 μL 如下溶液: ① KXF 6501 24 h 發(fā)酵液(濃度為1×107CFU/mL);② KXF 6501 96 h 發(fā)酵液(濃度為1×107CFU/mL);接種2 h 后,分別向每個(gè)孔中加入15 μL 1×104CFU/mL 灰霉菌孢子懸液,以僅接種灰霉菌孢子懸浮液的果實(shí)作為對照,完成接種后置于塑料盒中室溫放置保存(22 ℃,80%~90%相對濕度)。于處理后的第1 d 開始,每天觀察其發(fā)病情況,并統(tǒng)計(jì)發(fā)病率及病斑直徑,每個(gè)處理分別為10 個(gè)果實(shí),3 個(gè)重復(fù),共90 個(gè)果實(shí)。
發(fā)病率(%)=果實(shí)發(fā)病孔數(shù)/果實(shí)接種總孔數(shù)×100。
果實(shí)病斑直徑(cm):采用十字交叉法測量果實(shí)的病斑大小。
將獼猴桃果實(shí)用75%酒精表面消毒后用蒸餾水清洗,自然晾干分為兩組,每組15 個(gè)果實(shí),分別在無菌水、KXF 6501 24 h 發(fā)酵液中浸泡3 min 后自然晾干,放置于塑料盒中,室溫條件下保存(22 ℃、80%~90%相對濕度),于處理后第0、7、14、21、28 d 每組隨機(jī)取3 個(gè)獼猴桃果實(shí)樣品,標(biāo)記后,在-80 ℃條件下進(jìn)行保存,用于測定相關(guān)抗性物質(zhì)含量及抗性防御酶活性。
抗性物質(zhì)的測定:總酚、類黃酮和花青素的測定參照曹建康等[24]的方法,取0.5 g 果實(shí)組織于研缽(高溫滅菌、-20 ℃冷凍)中,加入少量預(yù)冷的1% HCl-CH3OH 溶液,研磨,后轉(zhuǎn)移到刻度試管后定容至20 mL,于4 ℃避光提取20 min,過濾后取濾液分別于280、325、530、600 nm 處測定濾液吸光度,總酚、類黃酮和花青素的測定結(jié)果以吸光度值表示,單位分別為OD280/g FW、OD325/g FW、OD(530-600)/g FW。
抗性防御酶活性測定:苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia lyase,PAL)、多酚氧化酶((polyphenol oxidase,PPO)、幾丁質(zhì)酶(chitinase,CHI)、β-1,3-葡聚糖酶(β-1,3-glucanase,GLU)利用蘇州研犀生物有限公司的試劑盒進(jìn)行測定,取0.1 g 獼猴桃果實(shí)組織加入提取液在冰上研磨至勻漿,提取粗酶液,按照試劑盒步驟加入試劑后測定并計(jì)算上述酶活,單位為U/g FW。
果實(shí)處理及取樣時(shí)間同方法1.2.4,測定果實(shí)品質(zhì)相關(guān)指標(biāo),失重率用稱質(zhì)量法[24]測定,單位為%;可溶性固形物含量(SSC)采用手持式折光儀日本(AT-AGO 公司)直接測定,單位為%;可滴定酸含量(TA)采用NaOH 滴定法[24]測定,以質(zhì)量分?jǐn)?shù)(%)表示;抗壞血酸采用 2,6-二氯酚靛酚滴定法[24]進(jìn)行測定,以質(zhì)量分?jǐn)?shù)(%)表示;還原糖含量采用3,5-二硝基水楊酸法測定[24],以質(zhì)量分?jǐn)?shù)(%)表示,以上果實(shí)營養(yǎng)品質(zhì)測定均參考曹建康等[24]的方法進(jìn)行測定。
使用Excel 2016 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析、獨(dú)立樣本T 檢驗(yàn)及Duncan 多重比較分析,當(dāng)P<0.05 時(shí)為顯著性差異,利用Origin 2019 軟件進(jìn)行制圖。
芽胞桿菌KXF 6501 的生長符合微生物的生長規(guī)律,其2~24 h 為對數(shù)生長期,24~96 h 為穩(wěn)定生長期,96~144 h 為衰亡生長期,24 h 進(jìn)入穩(wěn)定期后,其菌體數(shù)量達(dá)到108CFU/mL(圖1)。
圖1 芽胞桿菌KXF 6501 生長曲線Fig.1 Growth curve of B.tequilensis KXF 6501
KXF 6501 不同培養(yǎng)時(shí)間的發(fā)酵液均能抑制灰霉菌的生長,且其抑菌率均隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長而增加,但24 h 發(fā)酵液的抑菌率在整個(gè)培養(yǎng)周期均高于96 h 的發(fā)酵液(圖2,3),且在培養(yǎng)前期(第2 d,第3 d)達(dá)到顯著水平;第5 d 時(shí),24 與96 h 發(fā)酵液對灰霉菌的抑菌率分別為75.96%和73.72%(圖3)。
圖2 KXF 6501 24 與96 h 發(fā)酵液對灰霉菌的抑制效果Fig.2 Inhibition effect of KXF 6501 24 and 96 h fermentation broth on gray mold
圖3 KXF 6501 24 h 與96 h 發(fā)酵液對灰霉菌的抑菌率Fig.3 Inhibition rate of KXF 6501 24 h and 96 h fermentation broth on gray mold
如表1 和圖4 所示,KXF 6501 24 h 發(fā)酵液與96 h 發(fā)酵液在獼猴桃果實(shí)上,對灰霉病均有不同程度的抑制作用。24 h 發(fā)酵液處理4 d 后的發(fā)病率為65.00%,低于96 h 發(fā)酵液的發(fā)病率70.00%,二者均顯著低于對照處理(P<0.05)。隨著貯藏時(shí)間的延長,24 h 發(fā)酵液和96 h 發(fā)酵液對獼猴桃果實(shí)病斑直徑的擴(kuò)大均有不同程度的抑制作用。貯藏7~11 d,24 h 發(fā)酵液處理的獼猴桃果實(shí)灰霉病病斑直徑顯著(P<0.05)低于對照組,但96 h 發(fā)酵液處理的果實(shí)病斑直徑與對照組無顯著差異。
表1 KXF 6501 發(fā)酵液對采后獼猴桃灰霉病的抑制效果Table 1 Inhibition effect of KXF 6501 fermentation broth on gray mold of postharvest kiwifruit
圖4 KXF 6501 發(fā)酵液處理第7 d 時(shí)對采后獼猴桃灰霉病的抑制效果Fig.4 Inhibition effect of KXF 6501 fermentation broth on grey mold of postharvest kiwifruit on day 7
2.4.1 果實(shí)抗性物質(zhì)含量變化 從圖5 可以看出,貯藏過程中,對照組果實(shí)總酚、類黃酮和花青素的含量變化趨勢相似,呈緩慢上升,于第21 d 達(dá)到峰值,之后略有下降。KXF 6501 24 h 發(fā)酵液處理后,果實(shí)總酚、類黃酮、花青素的含量迅速上升,于第7 d 達(dá)到峰值,顯著高于對照組,其含量分別為2.38 OD280/g、1.26 OD325/g、0.20 OD(530-600)/g,是對照組的1.96、4.07 和5.29 倍,之后迅速下降至最低值(第14 d),隨后持續(xù)上升。
圖5 KXF 6501 發(fā)酵液處理對采后獼猴桃果實(shí)總酚(A)、類黃酮(B)、花青素(C)含量的影響Fig.5 Effect of KXF 6501 fermentation broth on the content of total phenols (A), flavonoids (B) and anthocyanins (C) in postharvest kiwifruit
2.4.2 果實(shí)抗病酶活性變化 如圖6A 所示,在整個(gè)貯藏期間,PAL 的活性呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,處理組酶活性在貯藏前7 d 呈上升趨勢,在第7 d 時(shí)酶活性達(dá)到最大,為95.04 U/g,是對照組的2.40 倍,且其活性于7~21 d 高于對照組,在7~14 d 達(dá)到顯著(P<0.05)水平,之后呈波動下降趨勢。
圖6 KXF 6501 24 h 發(fā)酵液處理對采后獼猴桃PAL(A)、PPO(B)、CHI(C)、GLU(D)活性的影響Fig.6 Effect of KXF 6501 24 h fermentation broth on the activities of PAL (A), PPO (B), CHI (C) and GLU (D) in postharvest kiwifruit
由圖6B 可知,在整個(gè)貯藏期間,處理組和對照組的PPO 活性呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,下降幅度小于對照組,且僅在貯藏第28 d 時(shí),處理組酶活是對照組的3.35 倍,為116.58 U/g,顯著(P<0.05)高于對照組。
如圖6C 所示,在整個(gè)貯藏期間,CHI 活性在前期的變化不大,然后呈上升后下降的趨勢,處理酶活性在第7 d 急劇上升,在第14 d 達(dá)到峰值,活性為8.41 U/g,與對照相比,酶活性增加了1.15 倍,顯著(P<0.05)高于對照組。
如圖6D 所示,在整個(gè)貯藏期間,處理組GLU 活性總體變化趨勢呈先上升后下降然后逐漸回升的趨勢,且GLU 酶活性于第14 和28 d 顯著(P<0.05)高于對照組,活性分別為163.88 和240.19 U/g,分別是對照組的1.57 和2.03 倍。
隨著貯藏時(shí)間的延長,獼猴桃果實(shí)的失重率逐漸升高,KXF 6501 24 h 發(fā)酵液處理組果實(shí)失重相對較慢,顯著(P<0.05)低于對照組(圖7);獼猴桃果實(shí)在貯藏28 d 時(shí),KXF 6501 24 h 發(fā)酵液處理組果實(shí)可溶性固形物含量為15.13%,顯著低于對照組;處理組和對照組的可滴定酸和抗壞血酸含量無顯著差異。表明KXF 6501 發(fā)酵液處理有效延緩果實(shí)失水,保持果實(shí)營養(yǎng)品質(zhì)(表3)。
表3 KXF 6501 24 h 發(fā)酵液處理對采后獼猴桃果實(shí)品質(zhì)的影響Table 3 Effect of KXF 6501 24 h fermentation broth on fruit quality of postharvest kiwifruit
圖7 KXF 6501 24 h 發(fā)酵液處理對采后獼猴桃失重率的影響Fig.7 Effect of KXF 6501 24 h fermentation broth on weight loss of postharvest kiwifruit
近年來,越來越多的芽胞桿菌作為生防因子應(yīng)用于果蔬采后病害防治研究中,如解淀粉芽胞桿菌、枯草芽胞桿菌、地衣芽胞桿菌和特基拉芽胞桿菌等[8,25]。趙煥蘭等[26]利用貝萊斯芽胞桿菌A4 發(fā)酵液浸泡櫻桃番茄后,果實(shí)貯藏期間的腐爛率降低,表明該菌的發(fā)酵液處理可以提高櫻桃番茄采后保鮮。本研究發(fā)現(xiàn)芽胞桿菌KXF 6501 24 和96 h 發(fā)酵液對灰霉病菌的菌絲生長菌具有較強(qiáng)的抑制作用,同時(shí)也能很好的控制獼猴桃果實(shí)灰霉病的發(fā)生,其中以24 h 的發(fā)酵液效果更佳,這可能是24 h發(fā)酵液的中的菌體處于對數(shù)期前期活力較強(qiáng),相對于灰霉菌更具有空間和營養(yǎng)競爭優(yōu)勢,能夠有效抑制灰霉病的入侵和繁殖。但KXF 6501 24 和96 h 發(fā)酵液中的抑菌活性成分是否存在差異,有待后續(xù)進(jìn)一步深入研究。
當(dāng)植物受到生防菌誘導(dǎo)或病原體侵染時(shí),會啟動與抗病相關(guān)的防御機(jī)制來抵抗病原菌的影響[27,28]。PAL、PPO、SOD 和POD 是植物體內(nèi)與抵制病原微生物侵染相關(guān)的重要酶,酶活性升高是誘導(dǎo)抗性產(chǎn)生的重要指標(biāo)之一[18]。PAL 是與苯丙烷代謝相關(guān)的途徑中的第一種酶,它參與抗病物質(zhì)的生物合成,如酚類物質(zhì)和木質(zhì)素等[29]。植物在受到生防因子誘導(dǎo)后,其體內(nèi)PAL 活性上升及相應(yīng)抗性物質(zhì)含量會增加。本研究發(fā)現(xiàn)特基拉芽胞桿菌KXF 6501 24 h 發(fā)酵液處理組的PAL 酶活性高于對照處理且先于對照組達(dá)到峰值,總酚、類黃酮和花青素的峰值到達(dá)時(shí)間也得到進(jìn)一步提前。陳劉軍等[30]研究發(fā)現(xiàn)蠟質(zhì)芽胞桿菌AR156也能通過誘導(dǎo)水稻體內(nèi)的PAL 酶活力提高,來增強(qiáng)植物本身的抗病能力,這與本研究結(jié)果相一致。PPO可以催化產(chǎn)生木質(zhì)素和酚類氧化產(chǎn)物來構(gòu)成保護(hù)性屏障,抵御病原體的入侵,同時(shí)還可以催化酚類物質(zhì)氧化形成高毒性的醌類物質(zhì),直接作用于病原菌[31]。本研究中,KXF 6501 24 h 發(fā)酵液處理誘導(dǎo)獼猴桃果實(shí)中的PPO 酶活性升高,在14 d 后高于對照組,之后減緩酶活性下降,有效提高了果實(shí)的抗病性。CHI 和GLU 可水解病原菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的幾丁質(zhì)和葡聚糖,破壞其細(xì)胞壁來消滅病原菌,同時(shí)二者常共同作用,協(xié)同表達(dá)來增強(qiáng)植物的抗病性[32-34]。本研究結(jié)果表明,KXF 6501 24 h 發(fā)酵液處理顯著提高獼猴桃果實(shí)體內(nèi)CHI 和GLU 酶活性,增強(qiáng)其抵抗灰霉病的能力。柴慶凱等[35]報(bào)道,施用解淀粉芽胞桿菌LJ02 可以誘導(dǎo)黃瓜CHI 和GLU 酶活,提高了其抵抗灰霉病侵染的能力。唐文等[18]利用枯草芽胞桿菌Czk1 發(fā)酵液對橡膠樹進(jìn)行處理,發(fā)現(xiàn)其誘導(dǎo)了橡膠樹葉片中CAT、SOD、POD、PAL 和PPO 等防御酶活性提高。因此,酶活性的提高在獼猴桃抵御病原侵染中發(fā)揮了重要作用,是芽胞桿菌KXF 6501 控制獼猴桃采后病害的重要機(jī)制之一。
本研究的結(jié)果表明,特基拉芽胞桿菌KXF 6501 可以很好的控制獼猴桃采后灰霉病,保持果實(shí)品質(zhì),誘導(dǎo)提高果實(shí)的抗病酶活和抗病物質(zhì)含量,具有開發(fā)為生防制劑的潛力。但后續(xù)還需要進(jìn)一步分析其發(fā)酵液中的抑菌活性物質(zhì)及其生防作用機(jī)制,為其在將來的大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用和菌劑開發(fā)中發(fā)揮穩(wěn)定防效提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支撐。