植物根際細菌HQ1-2的根際定殖與土壤微生態(tài)調(diào)節(jié)及枯萎病防治

陳夢多，胡春艷，馬肖靜，何夢菡，沈虎生，王藝茹，樸鳳植，申順善*

（1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，鄭州 450002；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院，鄭州 450002）

黃瓜枯萎病是由尖孢鐮刀菌黃瓜?；虵usariumoxysporumf.sp.cucumberium引起的一種真菌性土傳病害，病原菌從黃瓜根莖部侵入并寄生于維管束內(nèi)，阻礙植株對水分和養(yǎng)分的吸收，最終引起植株萎蔫枯死。植物根際促生細菌（Plant growth promoting rhizobacteria，PGPR）是生存在植物根圈范圍，對植物生長有促進或?qū)Σ≡修卓棺饔玫挠幸婕毦y(tǒng)稱，對植物生長和病害防治具有重要的作用[1,2]。PGPR 可以通過多種機制促進植物生長，如溶磷、解鉀、生物固氮作用、產(chǎn)生植物激素、產(chǎn)生鐵載體、產(chǎn)生1-氨基環(huán)丙烷-1-羥酸脫氨酶（ACC）、群體感應(yīng)信號干擾和抑制生物膜形成、產(chǎn)生揮發(fā)性有機化合物、誘導(dǎo)植物系統(tǒng)抗性等，直接促進植物生長和減輕病害發(fā)生或改善植物根際土壤微生態(tài)，進而促進植物生長[3-6]。近年來，利用PGPR 改善植物根際土壤微生態(tài)環(huán)境，保持土壤健康，防治土傳病害受到廣泛關(guān)注。如：解淀粉芽胞桿菌TR2 和CE 菌株依據(jù)其解磷、解鉀能力促進西瓜幼根和莖的生長[7]；從大豆根際土壤中分離的四株溶磷菌分泌IAA 和有機酸促進大豆生長[8]；Ben 等[9]發(fā)現(xiàn)的兩株假單胞桿菌通過分泌嗜鐵素能夠有效持久地抑制康乃馨鐮刀菌枯萎病的發(fā)生，并能夠誘導(dǎo)康乃馨植株對鐮刀菌的抗性；另外，王艷宇[10]研究發(fā)現(xiàn)耐鹽菌S29、KM1 和NM8 能夠在綠豆根際定殖，并增加土壤細菌的多樣性和豐富度，增加土壤中有益菌的相對豐度，進而促進綠豆的生長。

本研究從河南省駐馬店健康番茄根際分離、篩選得到一株植物根際促生菌HQ1-2，研究其在黃瓜根際的定殖能力，明確其對黃瓜枯萎病菌的抑菌活性，評價其對黃瓜枯萎病的防治效果和對黃瓜根際土壤微生態(tài)的調(diào)節(jié)效果，為黃瓜枯萎病的生物防治提供生防資源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試菌株HQ1-2 是從河南省駐馬店番茄根際分離篩選獲得，采用逐步提高誘導(dǎo)濃度的方法獲得穩(wěn)定抗利福平（100 μL/mL）的菌株，并保存于-80 ℃超低溫冰箱。供試黃瓜枯萎病菌尖孢鐮刀菌黃瓜?；虵usariumoxysporumf.sp.cucumberium（FOC）是由本研究室分離鑒定并保存。供試黃瓜品種為“寒育6號”，由河南豫藝種業(yè)科技發(fā)展有限公司提供。供試化學(xué)藥劑50%多菌靈可濕性粉劑由蘇州遍凈植?？萍加邢薰咎峁?。供試培養(yǎng)基為PDA 培養(yǎng)基（馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉18 g，超純水1000 mL）、TSA 培養(yǎng)基（胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（TSB）30 g，瓊脂粉18 g，超純水1000 mL）、PDB 培養(yǎng)基（馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，超純水1000 mL）和AIA 培養(yǎng)基（Actinomycete Isolation Agar Difco.20 g，超純水1000 mL）。

1.2 HQ1-2 菌懸液的配制

將HQ1-2 菌株在TSA 培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)3 d 后，刮取菌落用無菌水配制成濃度為108cfu/mL 的菌懸液待用。

1.3 尖孢鐮刀菌FOC 孢子懸浮液的配制

將在PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)的尖孢鐮刀菌菌餅接種到PDB 培養(yǎng)基，恒溫振蕩培養(yǎng)（28 ℃，轉(zhuǎn)速160 r/min）5 d 后，用滅菌紗布過濾獲得孢子懸浮液，再用無菌水稀釋配制成濃度為1×107孢子/mL 的孢子懸浮液。

1.4 HQ1-2 在黃瓜根際定殖密度測定

HQ1-2 在黃瓜根際定殖密度測定采用稀釋涂布平板法。將一片真葉的黃瓜苗移栽到花盆（直徑9.0 cm×深度7.5 cm），灌注處理HQ1-2 菌懸液（108cfu/mL）100 mL/株，待2 h 后灌根接種FOC 孢子懸浮液（1×107孢子/mL）10 mL/株，置于溫室培育。以清水做對照，每個處理3 次重復(fù)，每個重復(fù)15 株。處理第3 d開始每隔3 d 采集黃瓜根系和根際土壤測定HQ1-2 的定殖密度。即：輕輕拔出黃瓜根系，用流水沖洗干凈，再用無菌水沖洗3 次，吸干根表面水分，稱取1 g 研磨，然后用無菌水稀釋獲得10-3～10-4的根系稀釋液；稱取1 g 根際土壤，用無菌水稀釋獲得10-5～10-6的根際土壤稀釋液，將根系和根際土壤稀釋液分別涂抹在加利福平（100 μg/mL）的TSA 培養(yǎng)基上，置于28 ℃恒溫箱中培養(yǎng)48 h，待形成菌落，調(diào)查菌落數(shù)并推算HQ1-2 的定殖密度。

1.5 黃瓜根際土壤微生物測定

HQ1-2 和FOC 的接種方法同1.4。處理20 d 后，采用稀釋涂布平板法測定黃瓜根際土壤可培養(yǎng)細菌、真菌和放線菌數(shù)量。稱取過篩（60 目篩）過的根際土壤1 g，倒入裝有100 mL 無菌水的三角瓶，充分震蕩后靜置30 min，然后稀釋獲得10-4～10-7的土壤稀釋液，將0.1 mL 的10-6～10-7的稀釋液均勻涂布在TSA培養(yǎng)基，在28 ℃恒溫箱中培養(yǎng)3 d 后調(diào)查細菌菌落數(shù)；將0.1 mL 的10-4～10-5的稀釋液均勻涂布在PDA培養(yǎng)基，在28 ℃恒溫箱中培養(yǎng)5 d 后調(diào)查真菌菌落數(shù)；將0.1 mL 的10-5～10-6的稀釋液均勻涂布在AIA培養(yǎng)基，在28 ℃恒溫箱中培養(yǎng)7 d 后調(diào)查放線菌菌落數(shù)。調(diào)查細菌和真菌采用新鮮土樣，調(diào)查放線菌采用風(fēng)干的土樣。

1.6 黃瓜根際土壤酶活性測定

HQ1-2 和FOC 的接種方法同1.4。處理20 d 后測定黃瓜根際土壤脲酶、磷酸酶、蔗糖酶和過氧化氫酶活性。脲酶活性測定采用苯酚鈉-次氯酸鈉比色法，磷酸酶活性測定采用磷酸苯二鈉比色法，蔗糖酶活性測定采用3,5-二硝基水楊酸比色法，過氧化氫酶活性測定采用高錳酸鉀滴定法[11]。

1.7 黃瓜根際土壤速效氮磷鉀含量測定

HQ1-2 和FOC 的接種方法同1.4。處理20 d 后采用TRF-3A 型土壤養(yǎng)分速測儀測定黃瓜根際土壤速效氮、磷、鉀含量[12]。

1.8 HQ1-2 對尖孢鐮刀菌的抑制活性測定

HQ1-2 對尖孢鐮刀菌菌絲生長的抑制效果測定采用平板對峙培養(yǎng)法，對孢子萌發(fā)的抑制效果測定采用懸滴法[13]。

1.9 HQ1-2 對黃瓜枯萎病的防治效果測定

HQ1-2 對黃瓜枯萎病的防治效果測定采用盆栽試驗。HQ1-2 和FOC 的接種方法同1.4，處理后置于溫室培養(yǎng)14 d 后調(diào)查枯萎病發(fā)病情況，并計算病情指數(shù)和防治效果。以清水處理和化學(xué)藥劑（50%多菌靈可濕性粉劑500 倍液，100 mL/株）做對照，每個處理3 次重復(fù)，每個重復(fù)15 株。調(diào)查枯萎病分級標準：0級為無癥狀；1 級為子葉黃化，但未萎蔫；2 級為子葉萎蔫；3 級為子葉和真葉萎蔫或植株矮化；4 級為全株枯死[14]。

病情指數(shù)＝Σ（病級數(shù)×該病級植株數(shù)）/（最大病級數(shù)×植株總株數(shù)）×100，防治效果（%）＝（對照組病情指數(shù)－處理組病情指數(shù)）/對照病情指數(shù)×100。

1.10 HQ1-2 的鑒定

根據(jù)形態(tài)特征、生理生化特性和16S rRNA 序列同源性分析鑒定菌株HQ1-2，形態(tài)特征和生理生化特性測定主要參考伯杰氏細菌鑒定手冊的常規(guī)細菌學(xué)鑒定方法[15]。16S rRNA 序列同源性分析主要參考潘培培等[16]的方法。

1.11 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用SPSS 26 和Excel 2013 軟件進行數(shù)據(jù)分析，以最小顯著差數(shù)法（LSD）分析差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 HQ1-2 的定殖密度

HQ1-2 在黃瓜根系和根際土壤均具有穩(wěn)定的定殖能力。從圖1 看出，在黃瓜根系，沒有接種FOC 條件下，處理3 d 時定殖密度為5×104cfu/g，處理第6 d 時定殖密度最高，后降低，處理12 d 時定殖密度仍能達到1.43×104cfu/g；接種FOC 條件下，處理3 d 時定殖密度為2.70×104cfu/g，后慢慢增多，處理12 d時定殖密度能達到5.23×104cfu/g。HQ1-2 在黃瓜根系的定殖密度未接種FOC 條件下先高后降趨勢，而接種FOC 條件下先低后增趨勢，到處理12 d 時顯著高于未接種FOC 條件。從圖2 看出，在黃瓜根際土壤，沒有接種FOC 條件下，處理3 d 時定殖密度為7.97×106cfu/g，然后定殖密度比較穩(wěn)定，處理12 d 時定殖密度仍能達到8.33×106cfu/g；接種FOC 條件下，處理3 d 時定殖密度為4.83×106cfu/g，后慢慢增多，到處理第12 d 時定殖密度能達到1.18×107cfu/g。HQ1-2 在黃瓜根際土壤的定殖密度在未接種FOC 條件下基本穩(wěn)定的定殖密度，而接種FOC 條件下先低后增，到處理12 d 時顯著高于未接種FOC 條件。

圖2 HQ1-2 在黃瓜根際土壤的定殖密度Fig.2 Colonization density of HQ1-2 in the rhizosphere soil of cucumber

2.2 HQ1-2 對黃瓜根際土壤微生態(tài)的影響

2.2.1 根際土壤微生物 從表1 看出，HQ1-2 處理顯著增加黃瓜根際土壤可培養(yǎng)細菌數(shù)量，在未接種FOC條件下，HQ1-2 處理的黃瓜根際土壤細菌數(shù)量比對照增加22.60%；在接種FOC 條件下，HQ1-2 處理的黃瓜根際土壤細菌比只接種FOC 處理增加31.39%。HQ1-2 處理明顯降低根際土壤可培養(yǎng)真菌數(shù)量，在未接種FOC 條件下，HQ1-2 處理的黃瓜根際土壤真菌數(shù)量比對照減少20.91%；在接種FOC 條件下，HQ1-2處理的黃瓜根際土壤真菌比只接種FOC 處理減少39.55%。在未接種FOC 條件下，HQ1-2 處理對黃瓜根際土壤放線菌無顯著影響，而在接種FOC 條件下，HQ1-2 處理的黃瓜根際土壤放線菌比只接種FOC 處理增加了39.86%。

表1 HQ1-2 處理對黃瓜根際土壤可培養(yǎng)微生物的影響Table 1 Effects of HQ1-2 on culturable microbial population in the rhizosphere soil of cucumber

2.2.2 根際土壤酶活性 從表2 看出，在未接種FOC 條件下，HQ1-2 處理對黃瓜根際土壤酶活性沒有顯著影響；接種FOC 明顯降低黃瓜根際土壤酶活性，在接種FOC 條件下，HQ1-2 處理顯著提高黃瓜根際土壤脲酶、磷酸酶、蔗糖酶和過氧化氫酶活性，分別比只接種FOC 處理分別提高了56.12%、16.25%、45.95%和147.30%。

表2 HQ1-2 處理對黃瓜根際土壤酶活性的影響Table 2 Effects of HQ1-2 on enzymatic activity in the rhizosphere soil of cucumber

2.2.3 根際土壤速效氮磷鉀含量 從表3 看出，在未接種FOC 條件下，HQ1-2 處理顯著增加黃瓜根際土壤速效磷和速效鉀含量，而對速效氮含量沒有顯著影響；接種FOC 顯著降低了黃瓜根際土壤速效氮、速效磷和速效鉀含量，在接種FOC 條件下，HQ1-2 處理顯著提高了黃瓜根際土壤速效氮、速效磷和速效鉀含量，分別比只接種FOC 處理增加44.78%、154.36%和48.71%。

表3 HQ1-2 處理對黃瓜根際土壤速效營養(yǎng)的影響Table 3 Effects of HQ1-2 on available nutrients in the rhizosphere soil of cucumber

2.3 HQ1-2 對尖孢鐮刀菌的抑菌效果

HQ1-2 對尖孢鐮刀菌菌絲生長、孢子形成和孢子萌發(fā)均有較強的抑制活性，從圖3 可以看出，HQ1-2 顯著抑制FOC 菌絲生長，形成明顯的抑菌帶。從圖4 看出，在PDB 培養(yǎng)液振蕩培養(yǎng)5 d 時，對照處理的FOC 產(chǎn)孢量為1.65×108孢子/mL，而HQ1-2 處理的產(chǎn)孢量僅為4.10×107孢子/mL，HQ1-2 對FOC 孢子形成的抑制效果達到75.15%。從圖5 看出，在無菌水中培養(yǎng)2 h 時FOC 分生孢子萌發(fā)率為17.22%，培養(yǎng)8 h 時萌發(fā)率達到92.78%，而HQ1-2 處理的分生孢子2 h 時沒有萌發(fā)，培養(yǎng)8 h時萌發(fā)率僅為9.87%，HQ1-2 對FOC 孢子萌發(fā)的抑制效果達到89.36%。

圖3 HQ1-2 對尖孢鐮刀菌菌絲生長的抑制效果Fig.3 Antifungal effect of HQ1-2 against mycelial growth of Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum

圖4 HQ1-2 對尖孢鐮刀菌分生孢子形成的抑制效果Fig.4 Inhibitiory effect of HQ1-2 against conidia formation of Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum

圖5 HQ1-2 對尖孢鐮刀菌分生孢子萌發(fā)的抑制效果Fig.5 Inhibitiory effect of HQ1-2 against conidia germination of Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum

2.4 HQ1-2 對黃瓜枯萎病的防治效果

在盆栽試驗中，HQ1-2 對黃瓜枯萎病具有顯著的防治效果。從表4 和圖6 看出，接種FOC 的對照黃瓜苗生長明顯受到抑制，處理第10 d 時底部葉片變黃、開始萎蔫，第14 d 時植株嚴重萎蔫枯死，病情指數(shù)為68.33；而HQ1-2 處理的黃瓜苗，第10 d 開始底部葉片表現(xiàn)輕微變黃，第14 d 時病情指數(shù)為13.33，HQ1-2 處理對黃瓜枯萎病的防治效果達到80.49%，處理第14 d 時化學(xué)藥劑處理對黃瓜枯萎病的防治效果達到65.36%。

表4 HQ1-2 對黃瓜枯萎病的防治效果Table 4 The control effect of HQ1-2 against Fusarium wilt of cucumber

圖6 HQ1-2 對黃瓜枯萎病防治效果Fig.6 The control efficiency of HQ1-2 against Fusarium wilt of cucumber

2.5 HQ1-2 的鑒定

HQ1-2 菌體為直桿狀，革蘭氏陽性，在TSA 培養(yǎng)基上形成乳白色，半透明，表面光滑，邊緣不規(guī)則的菌落（圖7）。在5 ℃～50 ℃范圍內(nèi)均能生長，耐鹽度低于3%，可以利用葡萄糖、甘油、蔗糖和麥芽糖，不能利用半乳糖、單寧酸和檸檬酸，亞硝酸還原反應(yīng)、淀粉水解反應(yīng)呈陽性，硝酸鹽還原反應(yīng)、明膠液化呈陰性（表5）。以HQ1-2 菌株總RNA 為模板，PCR 擴增出的16S rRNA 長度為1579 bp，進行NCBI BLAST 比對分析結(jié)果，與多粘類芽胞桿菌的16S rRNA 序列同源性達到99%，利用MEGA 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果，與多粘類芽胞桿菌Paenibacilluspolymyxa（MK911741.1）在一個分支，其支持度為100%。因此，根據(jù)形態(tài)特征、生理生化特性和16S rRNA 序列同源性分析，將HQ1-2 鑒定為多粘類芽胞桿菌。

表5 HQ1-2 和多粘類芽胞桿菌的形態(tài)特征和生理生化特性Table 5 Morphological characteristics and physiological and biochemical characteristics of HQ1-2 and Paenibacillus polymyxa

圖7 HQ1-2 菌落圖Fig.7 Colony morphology of HQ1-2

圖8 基于16S rRNA 序列構(gòu)建的HQ1-2 系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.8 The phylogenetic tree of HQ1-2 constructed based on 16S rRNA sequence

3 討論

植物根際促生菌的根際定殖是其在植物根部和根際土壤生存并繁殖的能力，是在植株體內(nèi)大量繁殖并保持一定的密度是其發(fā)揮作用的前提[17,18]。如西瓜內(nèi)生細菌C18的定殖能力影響著其生防效果，在西瓜體內(nèi)定殖數(shù)量減少，其生防效果就會下降[19]；枯草芽胞桿菌XF-1 能在大白菜根圍、根表和根內(nèi)長時間定殖，有利于其在根部占據(jù)生態(tài)位點，從而抑制白菜根腫病菌的侵染和繁殖[20]；普城沙雷菌A21-4 和綠針假單胞菌HG28-5 均具有穩(wěn)定的定殖能力，在辣椒根部和根際土壤中保持一定的定殖密度，能使其發(fā)揮促生和防病作用[21]。本研究的HQ1-2 在黃瓜根系和根際土壤均穩(wěn)定地保持一定的定殖密度，并在接種FOC 條件下定殖密度明顯增加且穩(wěn)定，為HQ1-2 發(fā)揮其防病作用奠定基礎(chǔ)，但其定殖機理有待于進一步探討。

植物根際土壤是植物與外界環(huán)境進行物質(zhì)交換和能量交換的主要場所，植物根際土壤微生物、土壤酶活性、土壤理化性質(zhì)與寄主植物生長有密切關(guān)系。土壤微生物直接參與植物根際有機質(zhì)的分解和養(yǎng)分的快速轉(zhuǎn)化[22]。植物根際土壤微生物有有益和有害的，有益微生物能調(diào)節(jié)土壤微生態(tài)環(huán)境有助于植物生長，有害微生物引起植物病害會影響植物正常生長。植物根際促生菌能夠影響植物根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，進而影響土壤酶活性和土壤速效營養(yǎng)，有利于植物生長和防治病害。如枯草芽胞桿菌XS-4 和貝萊斯芽胞桿菌XS-20-15 菌劑顯著影響連作土壤中真菌群落結(jié)構(gòu)[23]；貝萊斯芽胞桿菌P1 改變辣椒根際土壤細菌和真菌群落結(jié)構(gòu)和組成，促進了辣椒植株體內(nèi)全氮和全磷含量[24]；生防菌W5 和Y1 增加馬鈴薯根際土壤細菌和真菌的多樣性，同時改變了馬鈴薯根際土壤微生物物種組成[25]；王亞月等[26]研究發(fā)現(xiàn)生防菌亞麻假單胞菌、沙福芽胞桿菌、暹羅芽胞桿菌、哈茨木霉菌能夠改變土壤菌群豐度，表現(xiàn)出對煙草黑脛病的防治效果。土壤酶活性反映土壤健康狀況，土壤過氧化氫酶能夠轉(zhuǎn)化土壤中的有機質(zhì)，土壤脲酶能促進氮素循環(huán)，土壤磷酸酶與土壤有機磷的轉(zhuǎn)化有關(guān)。植物根際促生菌能夠影響著植物根際土壤酶活性，有利于植物吸收利用土壤速效養(yǎng)分[27]。如解淀粉芽胞桿菌TR2 處理提高草莓根際土壤酶活性，提高了土壤肥力從而達到了促生長的效果[28]。本研究結(jié)果，HQ1-2 顯著影響黃瓜根際土壤細菌、真菌和放線菌的數(shù)量，提高根際土壤酶活性，增加根際土壤速效氮磷鉀含量，進而促進黃瓜生長，其具體的相關(guān)性有待于進一步的探索。

黃瓜枯萎病菌以菌絲體或厚垣孢子在土壤中長期存活，土壤中的菌絲和厚垣孢子萌發(fā)侵入黃瓜根部或藤蔓，在受害部位產(chǎn)生大量的分生孢子引起再次侵染。因此，抑制病原菌的任何一個發(fā)育階段都能夠切斷病原菌的侵入和傳播，有效防治黃瓜枯萎病。如從蚯蚓糞中篩選出的一株黃瓜枯萎病拮抗菌株WQ-5 能夠抑制FOC 菌絲生長，在盆栽試驗防治黃瓜枯萎病[29]；比基尼鏈霉菌HD-087 菌株發(fā)酵液能夠抑制FOC 菌絲生長和分生孢子萌發(fā)，對黃瓜枯萎病具有明顯的防治效果[30]；卡那鏈霉菌CA-6 發(fā)酵液具有強烈的抑菌活性，抑制黃瓜枯萎病菌分生孢子萌發(fā)及菌絲生長，防治黃瓜枯萎病[31]。本研究結(jié)果，HQ1-2 不僅能抑制FOC 菌絲生長，還能抑制孢子形成和孢子萌發(fā)，進而防治黃瓜枯萎病，顯示其生防潛力。

植物根際存活大量的微生物，其中很多是具有促進植物生長和抑制植物病害等作用的促生菌。已報到的植物根際促生菌種類很多，其中多粘類芽胞桿菌是類芽胞桿菌屬的革蘭氏陽性細菌，具有產(chǎn)抗生素、產(chǎn)激素類物質(zhì)、誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性等，具有多種功能的一類重要的植物根際促生菌[32]，被美國環(huán)保署定為可作商用的微生物之一[33]，最近很受廣大研究者的關(guān)注，用于防治多種植物病害。如，多粘類芽胞桿菌HK18-8 菌懸液對辣椒炭疽病的防治效果可達到88.58%[34]，多粘類芽胞桿菌DY04 可有效防治小麥赤霉病[35]，多粘類芽胞桿菌LRS-1 通過改變根際土壤細菌多樣性可有效防治辣椒疫病[36]。本研究篩選出的HQ1-2 菌株為多粘類芽胞桿菌，具有穩(wěn)定的根際定殖能力，對黃瓜枯萎病菌有較強的抑菌活性，防治黃瓜枯萎病，并對黃瓜根際土壤微生態(tài)環(huán)境具有較好的調(diào)節(jié)作用，是一株具有應(yīng)用潛力的生防資源。