干旱脅迫下不同性別野牛草生理及抗氧化酶基因表達差異

劉牧野，郭麗珠，岳躍森，武菊英，范希峰，肖國增*，滕珂*

（1. 長江大學園藝園林學院，湖北 荊州 434052；2. 北京市農(nóng)林科學院，草業(yè)花卉與景觀生態(tài)研究所，北京 100097）

干旱是制約植物生長的重要脅迫因素之一［1］。對于草坪草而言，草坪坪觀質(zhì)量是其主要的觀賞價值之一。干旱脅迫會通過引起植物功能的改變使草坪質(zhì)量嚴重下降，影響其景觀和生態(tài)功能［2］。干旱脅迫會導致植物體內(nèi)產(chǎn)生大量的活性氧（reactive oxygen species，ROS）［3］，ROS 過量積累會導致植物細胞死亡，進而使植物受到損害［4］。植物體內(nèi)存在一套由抗氧化酶以及非抗氧化酶組成的抗氧化系統(tǒng)，從而抵御ROS 對植物的傷害［5］?？寡趸赶到y(tǒng)包括超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化物酶（peroxidase，POD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、抗壞血酸過氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）等［6］。SOD 作為植物逆境防御的第一道防線，保護細胞免受超氧化物誘導的氧化脅迫［7］；APX、CAT 則清除由SOD 特異性地歧化超氧陰離子（O-2）產(chǎn)生的H2O2［8］。Mittler［9］發(fā)現(xiàn)APX 與CAT 對H2O2的清除機制不同，APX 負責調(diào)節(jié)ROS 中間體的信號傳導，而CAT 負責清除過量的ROS。POD 作為活性較高的適應(yīng)性酶，能夠反映植物生長發(fā)育的特點、體內(nèi)代謝狀況以及對外界環(huán)境的適應(yīng)性［10］。

干旱脅迫不僅使植物抗氧化酶活性在生理水平發(fā)生變化，在分子水平上也會發(fā)生抗氧化酶基因表達量的變化。Nasirzadeh 等［11］研究了干旱脅迫對3 種耐旱性小麥（Triticum aestivum）的抗氧化酶基因表達的影響 ，結(jié)果表明3 種小麥抗氧化酶相關(guān)基因在干旱脅迫條件下的表達都增強。田又升等［12］研究表明耐旱型棉花（Gossypiumspp.）相較于干旱敏感型棉花在干旱脅迫下抗旱相關(guān)基因表達量更高。Zhang 等［13］研究了干旱脅迫下白三葉（Trifolium repens）抗氧化酶基因的表達模式，結(jié)果表明白三葉在干旱3 h 后CAT、Fe-SOD、Mn-SOD、Cu/Zn-SOD表達量迅速上升。連玲等［14］研究水稻（Oryza sativa）在干旱脅迫下抗氧化酶基因的表達水平變化發(fā)現(xiàn)，干旱導致水稻的抗氧化酶基因表達量上調(diào)，且大部分基因都呈先上升后下降的趨勢。

野牛草（Buchloe dactyloides），隸屬禾本科野牛草屬，是一種重要的多年生暖季型草坪草［15］。野牛草因為其形態(tài)柔順、抗逆性強、耐貧瘠等優(yōu)點在我國廣泛栽培［16］。前人研究表明野牛草是所有草坪草中抗旱性最強的物種［17］，研究其抗旱機理對其他草坪草抗旱性研究具有指導意義。雌雄異株植物是指只具有單一性別的單性花植株［18］，被子植物中只有6%的物種是雌雄異株［19］。野牛草是草坪草植物中少有的雌雄異株植物［20］，并且前人研究發(fā)現(xiàn)除了在抗葉銹病 （Puccinia kansensis）［21］、匍匐莖生長能力［22］以及保水能力［23］外，二者在擴繁、生長習性、生物產(chǎn)量上并無太大差異。目前對于不同性別野牛草抗旱的生理及分子差異機制的研究較少，本研究旨在通過對生理以及分子水平野牛草雌、雄株之間抗旱能力的比較，探究野牛草雌、雄株之間的抗旱性強弱；同時明確野牛草雌、雄株之間抗氧化酶活性及基因表達在抗旱中的差異，以期為研究雌雄異株植物的抗旱機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗植物為野牛草‘Texoka’品種，2020 年8 月在北京市農(nóng)林科學院草業(yè)花卉與景觀生態(tài)研究所溫室播種。2021 年6 月植物開花，根據(jù)野牛草雌、雄株開花后花型不同從而分辨性別后進行雌、雄株分株擴繁培養(yǎng)至2022 年2 月獲得遺傳背景一致、基因型相同的單性別無性系群體。

1.2 試驗設(shè)計

于 2022 年 6 月25 日在北京市農(nóng)林科學院智能溫室中進行移苗盆栽試驗，采用頂部直徑19 cm、底部直徑10 cm、高度15 cm 的花盆，以野牛草雌株或雄株無性種苗分蘗6～7 個為一株進行栽植，土壤采用園土。緩苗至2022年9 月22 日后進行干旱處理，2022 年10 月6 日進行復水。本研究設(shè)置2 個性別分組雌（♀）與雄（♂），每個性別設(shè)置4 種干旱處理，分別為：D0d（干旱處理0 d）、D7d（干旱處理7 d）、D14d（干旱處理14 d）、R7d（復水處理7 d），每個處理3 個生物學重復。干旱脅迫前，每盆澆水至底部滲水，干旱脅迫后不澆水，在干旱脅迫第14 天取樣后澆水至底部滲水進行復水，復水7 d 內(nèi)不澆水。在干旱至0、7、14 d、復水7 d 的下午3：00 進行取樣，葉片鮮樣用于測定葉片相對含水量以及葉綠素，其余指標采用液氮以及-80 ℃冰箱保存樣進行測定。

1.3 試驗方法

1.3.1 葉片相對含水量測定 稱取樣品1 g，記錄其鮮重（fresh weight，WF）；將稱好的葉片放入50 mL 三角瓶中，加滿蒸餾水，封口，放置24 h；取出葉片，快速輕輕擦干表面水分，稱其飽和重（saturation weight，WT）；將飽和葉片放入鋁盒內(nèi)，105 ℃殺青15 min；80 ℃烘至恒重；取出后，自然冷卻，稱干重（dry weight，WD）。計算公式：

1.3.2 葉綠素含量測定 稱取野牛草雌、雄株葉片0.05～0.08 g，記下具體質(zhì)量，剪碎后置于離心管中；加入8 mL 95%的乙醇，避光靜置 24 h；于665 和649 nm 下測定其吸光度值A(chǔ)665、A649；95%乙醇調(diào)整。計算葉綠素含量：

式中：V為提取后的體積（L，0.008 L）；W為稱取的葉片質(zhì)量（g）。

1.3.3 PSII 最大光化學量子效率測定 采用Handy PEA 植物效率分析儀（Handy PEA+、PP SYSTEMS，英國）進行PSII 最大光化學量子效率（the maximum quantum yield of PSII，F(xiàn)v/Fm）測定，用配備的暗適應(yīng)夾對葉片進行充分的暗適應(yīng)（30 min），將探頭置于暗適應(yīng)夾上的圓形槽之中，確保探頭與暗適應(yīng)夾緊密接觸，無光線進入。用手按緊探頭與暗適應(yīng)夾，拉開適應(yīng)夾上金屬遮光片，按探頭一側(cè)的快捷鍵，開始測定。測定結(jié)果通過PEA軟件進行分析總結(jié)。選取每盆野牛草雌、雄株葉片中部4 個部位使用暗適應(yīng)夾進行暗適應(yīng)，結(jié)果取4 個暗適應(yīng)部位數(shù)據(jù)平均值。測定時間為每次取樣當天的上午10：00。

1.3.4 抗氧化酶測定 用蘇州科銘生物技術(shù)有限公司試劑盒（SOD-1-Y、POD-1-Y、CAT-1-Y、APX-1-W），依據(jù)試劑盒說明書方法，測定0.1 g 野牛草健康生長葉片超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）、抗壞血酸過氧化物酶（APX），分別用酶標儀（Multiskan FC，Thermo，美國）、紫外分光光度計（UV2600，Techcomp，中國）在520、560、470、240 和290 nm 波長下測量吸光值并計算酶活性。

1.3.5 抗氧化酶基因表達量測定 使用百邁客公司RNA 試劑盒（RK02004）提取健康生長的野牛草葉片總RNA，用Takara 公司反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒（RR036A）在PCR 儀中（C1000，Bio-Rad，美國）反轉(zhuǎn)錄成cDNA。反應(yīng)體系為20 μL，反應(yīng)條件：Lid 50 ℃，37 ℃ 30 min，反應(yīng)后 85 ℃ 熱變性5 s，4 ℃保存，以反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA 為模板，用Actin引物進行PCR 檢測，電泳檢測有單一條帶后，用于后續(xù)的qRT-PCR 試驗。

根據(jù)前期實驗室獲得的野牛草全長轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)設(shè)計野牛草SOD（Cu/Zn-SOD、FeSOD）、APX、CAT、POD的qRT-PCR 引物（表1）。利用Bio-Rad CFX connect 熒光定量儀（美國）進行qRT-PCR 反應(yīng)。SYBR Mix 采用Takara 公司的試劑（RR820A）。反應(yīng)體系為20 μL，反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s ，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40 次循環(huán)。定量表達結(jié)果依據(jù)CT 數(shù)值，根據(jù) 2-ΔΔCt法［24］分別計算目標基因在不同處理下的相對表達量。

表 1 實時熒光定量引物信息Table 1 Primer information for qRT-PCR analysis

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2019 對原始數(shù)據(jù)進行記錄整理，采用SPSS 27. 0 對數(shù)據(jù)進行顯著性分析，葉綠素熒光數(shù)據(jù)采用PEA 軟件進行分析，使用GraphPad Prism 9.4 作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 干旱脅迫對野牛草草坪質(zhì)量的影響

野牛草雌、雄株葉片隨著干旱時間的增加開始變黃萎蔫。第7 天野牛草雌株葉片未發(fā)生明顯變化；雄株少部分葉片前端開始變黃萎蔫。第14 天雌、雄株葉片都明顯變黃，葉片前端發(fā)生彎曲萎蔫現(xiàn)象，大部分葉片蜷縮。復水后，雌株大部分葉色恢復，葉片舒展，但葉片前端仍呈現(xiàn)黃色彎曲現(xiàn)象，少部分葉片枯黃無法恢復；雄株葉片仍呈現(xiàn)黃色萎蔫狀，且較多數(shù)葉片枯黃死亡無法恢復（圖1）。以上結(jié)果表明，野牛草雌株與雄株相比具有較好的耐旱性和抗旱恢復潛力。

圖1 干旱脅迫條件下野牛草雌、雄株表型的變化Fig.1 Phenotypic changes of female and male buffalograss plants under drought stress

2.2 干旱脅迫對野牛草葉片含水量和光合作用的影響

干旱脅迫降低了野牛草雌、雄株的葉片RWC 和Chl 含量，隨著干旱時間的增加，野牛草雌、雄株的RWC 都呈下降趨勢，干旱第7 天和干旱第14 天與第0 天相比都有顯著性差異，復水后RWC 與干旱第14 天相比顯著上升（圖2A）。野牛草雌株Chl 隨著干旱時間的增長而下降，干旱第14 天與干旱第0 天相比顯著下降，復水后仍顯著下降（圖2B）；野牛草雄株Chl 隨著干旱時間的增長呈先上升后下降的趨勢，干旱第14 天與干旱第0 天相比顯著下降，復水后仍呈下降趨勢，與第0 天相比有顯著差異（圖2E）。隨著干旱脅迫時間增加，野牛草雌、雄株Fv/Fm都在第14 天顯著下降，復水后回升（圖2C 和F）。

圖2 干旱脅迫條件下野牛草雌、雄株葉片相對含水量、PSII 最大光化學量子效率以及葉綠素含量的變化Fig. 2 Detection of relative leaf water content，the maximum quantum yield of PSII and chlorophyll content of female and male buffalograss under drought stress

2.3 干旱脅迫對野牛草抗氧化酶活性的影響

干旱脅迫條件下，野牛草雌株SOD 活性在干旱第14 天顯著上升，復水后相較于干旱第14 天顯著下降（圖3A）；野牛草雄株SOD 活性隨著干旱時間的增加呈先下降后上升的趨勢，復水后顯著下降（圖3E）。野牛草雌株在干旱處理下APX 活性呈先下降后上升的趨勢，在干旱第14 天達到最高，顯著高于第0 和7 天，復水后又下降（圖3B）；野牛草雄株APX 活性隨著干旱時間的增加而上升，在第14 天達到峰值，顯著高于第0 天以及第7 天，復水后APX 活性顯著下降，顯著低于干旱條件下APX 活性（圖3F）。野牛草雌株CAT 活性在干旱條件下呈先上升后下降的趨勢，復水后又顯著上升（圖3C）；雄株在整個處理過程中呈先下降后上升又下降的趨勢，干旱第0 天顯著高于其他處理時間（圖3G）。野牛草雌、雄株P(guān)OD 活性整體趨勢相同，呈先上升后下降的趨勢，在干旱第14 天達到峰值，顯著高于其他處理時間（圖3D 和H）。

圖3 干旱脅迫條件下野牛草抗氧化酶活性的檢測Fig.3 Detection of antioxidant enzyme activity in buffalograss under drought stress

2.4 干旱脅迫對野牛草抗氧化酶系統(tǒng)相關(guān)基因的影響

隨著干旱時間的延長，野牛草雌株FeSOD的表達水平?jīng)]有顯著變化，復水后顯著上升（圖4A）；雄株FeSOD的表達水平隨著干旱時間的延長先下降后上升，復水后下降，干旱第14 天達到峰值，顯著高于其他處理時間（圖4F）。野牛草雌株Cu/Zn-SOD的表達水平隨干旱時間的延長呈先下降后上升的趨勢，在復水后達到峰值，顯著高于干旱處理7 和14 d（圖4B）；雄株Cu/Zn-SOD的表達水平隨著干旱時間的延長先下降后上升，復水后下降，干旱第14 天達到峰值（圖4G）。野牛草雌株APX的表達水平隨著干旱時間的延長先下降后上升，復水后持續(xù)上升，在復水7 d 后達到峰值且顯著高于其他處理時間（圖4C）；雄株APX的表達水平隨著干旱時間的延長呈下降趨勢，復水后上升（圖4H）。野牛草雌、雄株CAT的表達水平均先下降后上升，其中雌株CAT表達水平復水后達到峰值（圖4D）、雄株CAT表達水平在干旱第0 天最高（圖4I）。野牛草雌株P(guān)OD的表達水平先下降后上升，復水后達到峰值（圖4E）；雄株P(guān)OD表達水平則在干旱條件下先下降后上升，復水后下降，在干旱第14 天達到峰值且顯著高于其他處理時間（圖4L）。

圖4 干旱脅迫條件下野牛草抗氧化酶系統(tǒng)相關(guān)基因相對表達量檢測Fig.4 Detection of relative expression levels of genes related to antioxidant enzyme system in buffalograss under drought stress

2.5 野牛草雌雄株對干旱脅迫的差異性分析

通過SPSS 軟件對同一處理天數(shù)下野牛草雌、雄株之間差異進行獨立樣本T檢驗得到表2。由表2 可知，在干旱處理0 d 時，F(xiàn)eSOD基因相對表達量在野牛草雌、雄株之間差異顯著，APX、CAT、Cu/Zn-SOD基因表達量以及CAT 活性存在極顯著差異。干旱處理第7 天時，野牛草雌雄株之間Chl、APX 活性以及CAT基因相對表達量差異顯著，RWC、CAT、SOD 活性以及Cu/Zn-SOD基因相對表達量存在極顯著差異。干旱第14 天時，CAT 活性差異顯著，SOD 活性、Cu/Zn-SOD、FeSOD、POD以及APX基因相對表達量存在極顯著差異。復水7 d 后，POD、SOD 以及CAT 活性存在極顯著差異，Cu/Zn-SOD基因相對表達量差異顯著。從表2 還可以看出，除了PSII 最大光化學量子效率外，其他指標均有至少一個處理天數(shù)在雌雄株之間存在顯著差異。

表2 野牛草雌、雄株同一處理天數(shù)之間的差異Table 2 Difference between female and male buffalograss for the same treatment days

3 討論

草坪質(zhì)量會隨著干旱脅迫的持續(xù)而下降［25］，本研究中野牛草雌、雄株葉片都隨著干旱時間的增加而變黃萎蔫，但是在復水后野牛草雌株葉片恢復狀態(tài)更好，因此從表型上看，野牛草雌株的抗旱性要強于雄株。葉片相對含水量是植物組織實際含水量占組織飽和含水量的百分比，常用來作為植物在遭受水分脅迫后的水分虧缺的參數(shù)［26］。在干旱脅迫對草原六月雪（Koeleria macrantha）影響的研究中，兩種不耐旱型品種RWC 顯著低于耐旱型品種［27］。本研究中野牛草雌雄株RWC 都隨著干旱時間增加而下降，復水后上升，在干旱第7 天雌株RWC 顯著高于雄株，證明在短期干旱脅迫下野牛草雌株相較于雄株可能更加耐旱。干旱脅迫會導致植物葉綠素含量下降［28］，一般來說葉綠素含量越高表明植物光合能力及抗性越強［29］。本研究中野牛草雌雄株Chl 隨著干旱-復水處理整體都呈下降趨勢，但是雌雄株之間除第7 天外均沒有顯著差異。金祎婷等［30］研究在全生育期干旱脅迫對‘青燕1號’燕麥（Avena sativa）PSII 最大光化學量子效率影響時發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫程度越高，對‘青燕1 號’Fv/Fm影響越大，且不同干旱脅迫程度下，其光合作用限制因素不同，重度脅迫下限制因素為非氣孔因素，主要表現(xiàn)為 PSⅡ反應(yīng)中心失活，光合電子傳遞受阻，其Fv/Fm數(shù)值顯著下降。本研究中野牛草雌、雄株Fv/Fm在干旱-復水處理過程中都呈相同的趨勢，在干旱第14 天都顯著降低，二者之間沒有顯著差異，Chl 含量和Fv/Fm的變化表明本研究中干旱處理抑制了野牛草雌、雄株的光合性能，但雌株和雄株之間的差異并不明顯。

抗氧化酶系統(tǒng)是植物應(yīng)對逆境脅迫的重要機制之一［31］。除CAT 活性外，野牛草雌、雄株抗氧化酶活性在干旱第7 天后都呈先上升后下降趨勢，且不同處理天數(shù)之間差異顯著，證明干旱脅迫下野牛草抗氧化酶都正常發(fā)揮作用。野牛草雌、雄株SOD 活性在干旱第7、14 天以及復水7 d 后具有顯著差異，且雌株活性高于雄株，證明野牛草雌株O-2的歧化能力強于雄株。這與馬少薇等［32］的研究相同，其研究結(jié)果表明干旱脅迫下黃柳（Salix gordejevii）雌株比雄株SOD 活性更強。野牛草雄株APX 活性在干旱第7 天顯著高于雌株，但雌雄株在干旱第14天以及復水7 d 沒有顯著性差異，在野牛草應(yīng)對長時間干旱時，雌株APX 活性變化更加明顯，表明雌株應(yīng)對干旱脅迫時APX 更快積累，應(yīng)對長時間干旱脅迫的能力可能更強。干旱脅迫下野牛草雌雄株P(guān)OD 活性變化趨勢一致且沒有顯著性差異，說明野牛草雌雄株之間POD 抗氧化能力相似，這可能與POD 參與其他植物細胞活動有關(guān)［33］。干旱第7 天后，野牛草雌、雄株CAT 活性變化趨勢完全相反，且在干旱第14 天野牛草雌株CAT 活性達到最低，說明野牛草雌株CAT 可能在干旱第14 天受到干旱脅迫影響導致活性降低，這與聞志彬等［34］發(fā)現(xiàn)CAT 活性在重度干旱脅迫下清除H2O2能力降低的結(jié)果一致。

野牛草雌株抗氧化酶基因表達量在復水后上調(diào)至峰值，與抗氧化酶活性變化并不一致，說明在野牛草雌株中抗氧化酶的合成可能同時受到其他基因的調(diào)控，但是其表達仍然受到干旱脅迫的誘導［35］。連玲等［14］對水稻抗氧化酶基因表達機制的研究結(jié)果表明，水稻抗氧化酶基因均受到干旱脅迫的誘導。野牛草雄株FeSOD、Zn/Cu-SOD、POD相對表達量在干旱第14 天達到峰值，與抗氧化酶活性變化相同，說明野牛草雄株上調(diào)FeSOD、Zn/Cu-SOD、POD相對表達量可以激活抗氧化酶的活性［36］。雄株APX以及CAT相對表達量在干旱第0 天最高后下降，復水后上升，抗氧化酶APX、CAT 活性在第14 天顯著上升，表明APX 以及CAT 活性與其基因表達水平存在時間上的差異，原因可能在于其他未知因素參與控制了基因的轉(zhuǎn)錄過程，也可能是干旱脅迫導致轉(zhuǎn)錄后調(diào)控過程中酶降解或失活［37］。這與Xu 等［38］研究干旱脅迫下草地早熟禾（Poa pratensis）抗氧化酶活性和基因表達模式對干旱和干旱后恢復的響應(yīng)研究結(jié)果一致?？偟膩碚f，野牛草雌、雄株之間抗氧化酶相關(guān)基因相對表達量變化趨勢不同，表明不同性別野牛草植株抗氧化酶基因表達在響應(yīng)干旱脅迫的過程中存在性別差異。

4 結(jié)論

綜上所述，本研究從生理與轉(zhuǎn)錄水平探究了野牛草雌、雄株對干旱脅迫響應(yīng)的差異。在干旱脅迫下，野牛草雌、雄株坪觀質(zhì)量、RWC 變化趨勢一致，都呈先下降后上升的趨勢。野牛草雌、雄株光合性能都受到干旱脅迫的抑制，兩者在干旱-復水過程中光合性能差異不明顯。除CAT 活性外，野牛草雌、雄株抗氧化酶活性在干旱第7天后都呈先上升后下降趨勢。干旱第7 天后，野牛草雌、雄株CAT 活性變化趨勢完全相反，野牛草雌株呈先下降后上升的趨勢。通過基因表達分析發(fā)現(xiàn)，野牛草雌株抗氧化酶基因表達量與抗氧化酶活性變化并不一致；野牛草雄株FeSOD、Zn/Cu-SOD、POD相對表達量與相應(yīng)抗氧化酶活性變化相同，APX以及CAT相對表達量與相應(yīng)抗氧化酶活性變化不一致。綜合來說，野牛草雌株抗旱性強于雄株，本研究發(fā)現(xiàn)了野牛草雌、雄株抗氧化系統(tǒng)在響應(yīng)干旱脅迫中存在差異，為雌雄異株植物抗旱的差異性研究提供了參考。