苜蓿源miR168b 跨界調(diào)控奶牛體內(nèi)乳脂相關(guān)靶基因的篩選

賈晶瑩，劉寶寶，馬云，段紅娟，蔡小艷*

（1. 寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川 750021；2. 寧夏回族自治區(qū)反芻動(dòng)物分子細(xì)胞育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧夏 銀川 750021）

microRNA（miRNA）是一類內(nèi)源性非編碼單鏈RNA 分子，長度一般為18～25 nt［1-2］。miRNA 通過靶向內(nèi)源性基因在動(dòng)植物生命過程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用，例如調(diào)節(jié)植物抗逆性，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長狀態(tài)，參與免疫應(yīng)答、進(jìn)行母嬰調(diào)節(jié)等，此外，miRNA 還可以作為疾病診斷的標(biāo)記因子［3-9］。越來越多的研究表明，miRNA 不僅可以靶向生物體內(nèi)源性基因，還可以跨界調(diào)節(jié)其他物種體內(nèi)的生物過程。經(jīng)典的跨界調(diào)控有水稻（Oryza sativa）來源的miR168 通過靶向小鼠肝臟內(nèi)的低密度脂蛋白受體銜接蛋白（LDLRAP1）減緩血液中低密度脂蛋白的清除［10］；金銀花（Lonicera japonica）水煎液中的miR2911 抑制流感病毒的復(fù)制，降低H1N1、H5N1 以及H7N9 病毒的死亡率，加速SARS-CoV-2 感染患者的陰性轉(zhuǎn)化［11-13］；大豆（Glycine max）來源的miR159a 能夠通過抑制GSK-3β 介導(dǎo)的NF-κB 和TGF-β1 途徑預(yù)防肝纖維化［14-15］。

苜蓿（Medicago sativa）作為“牧草之王”，含有較高的蛋白質(zhì)、均衡的氨基酸配比，豐富的礦物質(zhì)元素及微生物活性成分［16］。早在2012 年，我國就實(shí)施了“振興奶業(yè)苜蓿發(fā)展行動(dòng)”，提倡給奶牛飼喂優(yōu)質(zhì)牧草苜蓿，以提高牛奶乳蛋白率和乳脂率。已有研究表明，均衡日糧條件下，適當(dāng)增加反芻動(dòng)物苜蓿采食量，不僅可以增加牛、羊的日增重，還能夠顯著增加羊羔體內(nèi)多不飽和脂肪酸和共軛亞油酸的含量，提高牛奶產(chǎn)量，增加牛奶中乳蛋白率、乳脂率和乳糖率［17-20］。在飼草維持動(dòng)物健康和高效生產(chǎn)的研究中，關(guān)注點(diǎn)往往集中于飼草中傳統(tǒng)的營養(yǎng)素對(duì)動(dòng)物的作用，植物源miRNA 對(duì)動(dòng)物作用的研究較少。確定苜蓿來源的miRNA 對(duì)奶牛的跨界調(diào)控作用，為探究奶牛日糧的均衡配比提供了分子層面的支撐，對(duì)動(dòng)物分子營養(yǎng)與飼料研究具有重要意義。

課題組前期試驗(yàn)已經(jīng)篩選出在中苜1 號(hào)和新鹽52 號(hào)兩種苜蓿中差異表達(dá)的mtr-novel-miR54、mtr-miR156f，以及在兩種苜蓿中高表達(dá)的mtr-miR166a，并且通過高通量測序手段檢測了上述miRNA 在奶牛體內(nèi)的確存在。本研究基于對(duì)苜蓿源miRNA 影響牛奶品質(zhì)問題的思考與前期試驗(yàn)結(jié)果的分析，篩選了高乳脂奶牛和低乳脂奶牛中差異表達(dá)的苜蓿源miRNA，并對(duì)其進(jìn)行了靶基因預(yù)測分析與驗(yàn)證，以期為后續(xù)研究苜蓿源miRNA 靶向奶牛內(nèi)源性基因進(jìn)而調(diào)控牛奶乳脂率篩選具有參考性的靶基因。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 奶牛血液與牛奶采集 試驗(yàn)材料為高乳脂和低乳脂荷斯坦奶牛的牛奶和血液，于2021 年12 月采自寧夏農(nóng)墾賀蘭山奶業(yè)，采集奶牛全部為生產(chǎn)4 胎的奶牛，產(chǎn)犢間隔340～381 d，泌乳天數(shù)108～187 d，采樣牛編號(hào)為0001～0006，基本信息見表1。試驗(yàn)牛飼喂相同的平衡全混合日糧（表2）。篩選體細(xì)胞數(shù)在20 萬個(gè)·mL-1以內(nèi)，高乳脂組奶牛（high milk fat，HF）乳脂率＞4.2%，低乳脂組奶牛（low milk fat，LF）乳脂率＜3.5%，每組選擇3 頭奶牛進(jìn)行試驗(yàn)。

表1 采樣?；拘畔able 1 Basic information of sampling cattle

表2 日糧組成及營養(yǎng)水平（干物質(zhì)基礎(chǔ)）Table 2 The dietary composition and nutrient level （DM basis）

尾靜脈采血法直接將奶牛血液采集于含有抗凝劑的真空采血管內(nèi)。同一奶牛每天早、中、晚采集3 個(gè)時(shí)間點(diǎn)的牛奶，按4∶3∶3 比例混勻。將血液和牛奶低溫運(yùn)送回實(shí)驗(yàn)室，血液置于-20 ℃冰箱保存，牛奶置于-80 ℃冰箱保存，備用。

1.1.2 細(xì)胞 奶牛乳腺上皮細(xì)胞（bovine mammary epithelial cells，BMEC）和HEK-293T 細(xì)胞來自寧夏大學(xué)反芻動(dòng)物分子細(xì)胞育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室前期保存。

1.1.3 主要試劑 Trizol 試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒由Takara 公司（大連）提供。DMEM/F 12 培養(yǎng)基購于Hyclone 公司，胎牛血清（FBS）購于BI 公司。雙熒光素酶報(bào)告靶基因試劑盒購買自promega（貨號(hào)：E1910）公司。mtr-miR168b mimics 與NC 序列委托廣州銳博生物公司合成。

1.1.4 主要儀器 多功能酶標(biāo)儀（SYNERGY/LX，美國）、普通PCR 儀（T100，美國）和實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（CFX 96 Touch，美國）均為Bio-Rad 公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 牛奶DHI 檢測 混勻的奶牛牛奶委托寧夏農(nóng)牧廳DHI 測定中心進(jìn)行奶牛生產(chǎn)性能測定（dairy herd improvement，DHI），具體檢測指標(biāo)包括乳脂肪、乳蛋白、乳糖、總固形物以及尿素氮含量等。

1.2.2 牛奶和血液中總RNA 提取與反轉(zhuǎn)錄 利用Trizol 試劑盒對(duì)樣品進(jìn)行總RNA 提取。使用多功能酶標(biāo)儀測定總RNA 濃度，利用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA 質(zhì)量及完整性。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將提取的總RNA 反轉(zhuǎn)成cDNA，保存于-20 ℃冰箱，備用。

1.2.3 氧化試驗(yàn) 在10 μL 提取的牛血RNA 樣品中，加入10 mmol·L-1高碘酸鈉進(jìn)行混合，-20 ℃氧化40 min 后離心，加入1 mL 無水乙醇對(duì)沉淀進(jìn)行重懸，將懸液置于-20 ℃孵育過夜后再次離心，棄去上清液后加入20 μL 無酶水溶解沉淀，對(duì)氧化后的RNA 溶液中mtr-miR168b 和bta-miR-16a 進(jìn)行定量，驗(yàn)證植物源miRNA。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）測定miRNAs 表達(dá)量 除了前期試驗(yàn)結(jié)果篩選的mtr-novel-miR54、mtr-miR156f 和mtr-miR166a 外。本研究還選擇了已有跨界調(diào)控功能的植物源miR168 家族的mtr-miR168b 和mtr-miR168c-3p 兩個(gè)miRNAs。將上述5 個(gè)苜蓿源miRNAs 在奶牛血液和牛奶中的表達(dá)量進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量檢測。

根據(jù)成熟miRNAs 序列設(shè)計(jì)引物，試驗(yàn)所需引物使用Primer 5.0 軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)（表3），由通用生物系統(tǒng)（安徽）有限公司合成。以U6 作為內(nèi)參進(jìn)行RT-qPCR，反應(yīng)體系為預(yù)混液 TB Green Premix Ex Taq Ⅱ（Tli RNaseH Plus）10 μL，上下游引物各0.4 μL，DNA 樣品（100 ng·μL-1）2 μL，加入ddH2O 將反應(yīng)體系補(bǔ)全至20 μL。反應(yīng)程序如下：95 ℃，3 min；95 ℃，5 s；60 ℃，30 s；39 個(gè)循環(huán)，95 ℃，10 s。

表3 miRNAs 引物信息Table 3 Primer information of miRNAs

1.2.5 BMEC 轉(zhuǎn)染mtr-miR168b BMEC 培養(yǎng)基為含有10%胎牛血清，100 μg·mL-1青霉素，100 μg·mL-1鏈霉素的基礎(chǔ)DMEM/F12 培養(yǎng)基，在含5% CO2，37 ℃的恒溫加濕培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。在基礎(chǔ)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加5 μg·mL-1的胰島素，5 μg·mL-1的氫化可的松和20 ng·mL-1的催乳素即為誘導(dǎo)培養(yǎng)基。待細(xì)胞生長至60%左右融合度時(shí)，根據(jù)Lipo3000 轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。細(xì)胞轉(zhuǎn)染在6 孔板中進(jìn)行，每個(gè)轉(zhuǎn)染組設(shè)3 個(gè)重復(fù)，每孔加入50 nm mtr-miR168b mimics（mimics）或mtrmiR168b NC（NC），以NC 組為對(duì)照組，mimics 組為處理組進(jìn)行成脂標(biāo)志基因檢測。48 h 后更換為誘導(dǎo)培養(yǎng)基，此時(shí)記為誘導(dǎo)0 d。誘導(dǎo)期間每2 d 更換1 次培養(yǎng)基，每4 d 收集細(xì)胞對(duì)細(xì)胞內(nèi)成脂標(biāo)志基因進(jìn)行檢測，所測基因引物使用Primer 5.0 軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)（表4），由通用生物系統(tǒng)（安徽）有限公司合成。

表4 引物信息Table 4 Primer information

1.2.6 mtr-miR168b 在牛體內(nèi)的靶基因預(yù)測及功能富集分析 根據(jù)miRNAs 靶基因預(yù)測軟件TargetScan 提供的?；蛐畔ⅲc聯(lián)川生物平臺(tái)（https：//www.omicstudio.cn/index）聯(lián)合分析預(yù)測mtr-miR168b靶基因。對(duì)靶基因進(jìn)行GO 和KEGG 通路富集分析，篩選出參與調(diào)控乳脂合成的相關(guān)信號(hào)通路的靶基因。使用RNAhybrid 進(jìn)一步對(duì)靶基因進(jìn)行篩選。運(yùn)用Bgee 網(wǎng)站查找預(yù)測靶基因在牛組織內(nèi)的表達(dá)分?jǐn)?shù)。

1.2.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）測定表達(dá)量 對(duì)篩選出的與乳脂相關(guān)的靶基因進(jìn)行定量檢測。將mtrmiR168b mimics 和mtr-miR168b NC 分別轉(zhuǎn)染至BMEC，48 h 后收集細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞中預(yù)測靶基因進(jìn)行定量檢測。試驗(yàn)所需引物由Primer 5.0 軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)（表4），由通用生物系統(tǒng)（安徽）有限公司合成。以GAPDH作為內(nèi)參進(jìn)行RT-qPCR，反應(yīng)體系同1.2.4。

1.2.8 雙熒光素酶報(bào)告靶基因 根據(jù)STARD7和CPT1A的序列，使用Primer Premier 5 軟件設(shè)計(jì)包含mtrmiR-168b 種子區(qū)在內(nèi)的靶基因3' UTR 區(qū)引物（表4），并在引物5'端上分別添加Xho Ι 和Not Ι 的酶切位點(diǎn)和相應(yīng)的保護(hù)堿基。目的片段經(jīng)雙酶切和純化回收后，與psiCHECKTM-2 載體連接，構(gòu)建STARD7和CPT1A與Psicheck-2 野生型（WT-CPT1A）載體?；蛲蛔冃洼d體（MUT-CPT1A）委托上海生工生物公司合成，酶切位點(diǎn)與載體同上。將mtr-miR168b mimics 和mtr-miR168b NC 分別與構(gòu)建好的野生型和突變型載體共轉(zhuǎn)染至HEK-293T 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染試劑為Lipo 3000，轉(zhuǎn)染方法與說明書一致。轉(zhuǎn)染48 h 后，按照雙熒光素酶試劑盒說明書步驟收集細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞的熒光素酶活性進(jìn)行檢測。

1.3 數(shù)據(jù)分析

實(shí)時(shí)熒光定量PCR 結(jié)果用 2-ΔΔCt進(jìn)行處理，每組數(shù)據(jù)至少設(shè)置3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)和3 個(gè)技術(shù)學(xué)重復(fù)。使用GraphPad Prism 7 軟件的t檢驗(yàn)對(duì)RT-qPCR 結(jié)果和雙熒光結(jié)果作圖并進(jìn)行差異顯著性分析，P＜0.05 為差異顯著（*），P＜0.01 為差異極顯著（**）。

2 結(jié)果與分析

2.1 血液和牛奶采集牛的選擇

根據(jù)DHI 檢測結(jié)果篩選出3 頭高乳脂奶牛和3 頭低乳脂奶牛，對(duì)牛進(jìn)行重新編號(hào)方便后續(xù)試驗(yàn)。上述6 頭奶牛各項(xiàng)指標(biāo)見表5。其中，3 頭高乳脂奶牛牛號(hào)分別為0001、0002 和0003，牛奶中脂肪含量＞4.2%；3 頭低乳脂奶牛牛號(hào)分別為0004、0005 和0006，牛奶中脂肪含量＜3.5%。在此說明，高乳脂奶牛為采集樣品中乳脂含量相對(duì)較高且穩(wěn)定的3 頭奶牛，并不代表牛場中牛奶乳脂含量的最高水平。

表5 基于DHI 檢測的高乳脂與低乳脂奶牛的奶產(chǎn)量及奶品質(zhì)Table 5 Milk yield and quality of high-fat and low-fat dairy cows based on DHI detection

2.2 血液和牛奶中苜蓿源miRNA 的篩選與驗(yàn)證

對(duì)前期篩選出的mtr-novel-miR54、mtr-miR156f、mtr-miR166a，以及mtr-miR168b 和mtr-miR168c-3p 共5 個(gè)苜蓿源miRNAs 在牛血液和牛奶中的表達(dá)量進(jìn)行檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，上述苜蓿源miRNAs 在高乳脂奶牛（HF）和低乳脂奶牛（LF）的血液（圖1a）和牛奶（圖2a）中均可檢測到。

圖1 苜蓿源miRNAs 在奶牛血液中相對(duì)表達(dá)量Fig.1 Relative expression level of alfalfa miRNAs in bovine blood

圖2 苜蓿源miRNAs 在奶牛牛奶的相對(duì)表達(dá)量Fig.2 Relative expression level of alfalfa miRNAs in milk

在奶牛血液中，僅有mtr-miR168b 在低乳脂奶牛中的表達(dá)量極顯著高于在高乳脂奶牛中的表達(dá)量（P＜0.01；圖1b）。在奶牛牛奶中，mtr-miR168b 在低乳脂奶牛中的表達(dá)量顯著高于在高乳脂奶牛中的表達(dá)量（P＜0.05；圖2b）。氧化試驗(yàn)表明，與內(nèi)源性bta-miR-16a 相比，植物源mtr-miR168b 在被氧化后的牛血液RNA 中仍具有較高的表達(dá)水平（圖3），說明牛血液中的mtr-miR168b 來自植物，可以抵抗高碘酸鈉的氧化。

圖3 氧化前后牛血液中內(nèi)源性miRNA 與外源性miRNA 表達(dá)量檢測Fig. 3 The expression levels of endogenous and exogenous miRNA in bovine blood before and after oxidation

定量結(jié)果顯示，僅有mtr-miR168b 在高乳脂和低乳脂奶牛血液和牛奶中表達(dá)量穩(wěn)定且有顯著差異（P＜0.05），并且氧化試驗(yàn)證實(shí)了miR168b 的確來自植物miRNA，故對(duì)mtr-miR168b 在奶牛體內(nèi)的作用進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.3 mtr-miR168b 過表達(dá)抑制BMEC 中脂代謝基因的表達(dá)

為驗(yàn)證mtr-miR168b 高表達(dá)對(duì)奶牛乳脂的影響，構(gòu)建了mtr-miR168b mimics 處理后mtr-miR168b 在BMEC中不同誘導(dǎo)時(shí)間的相對(duì)表達(dá)量。發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)8 d 后，mtrmiR168b 的表達(dá)量仍極顯著上調(diào)（P＜0.01）（圖4a）。脂代謝相關(guān)基因PPARγ、SCD1、CEBP/β和SREBP1的表達(dá)量在mimics 組被抑制，且抑制作用在誘導(dǎo)第4和8 天顯著。說明mtr-miR168b 過表達(dá)抑制乳脂的合成，并且抑制作用隨著時(shí)間的推移而增加（圖4）。

圖4 mtr-miR168b 高表達(dá)抑制奶牛BMEC 乳脂的合成Fig.4 High expression of mtr-miR168b inhibits the synthesis of milk fat in cow mammary epithelial cells

2.4 mtr-miR168b 靶基因GO 功能富集分析

通過TargetScan 和RNAhybrid 預(yù)測得到的mtrmiR168b 靶基因中，有1834 條靶基因與GO 數(shù)據(jù)庫比對(duì)成功。將預(yù)測到的靶基因進(jìn)行GO 功能富集分析（圖5），結(jié)果顯示：注釋到生物過程層面顯著富集的功能或代謝路徑為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，DNA-模板、氧化還原過程和半橋粒組裝，分別有14、11 和10 條靶基因富集到上述功能。注釋到細(xì)胞成分層面顯著富集的功能或代謝路徑為細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核和膜的整體成分，分別有41、34 和34 條靶基因富集。注釋到分子功能層面顯著富集的功能條目為ATP 結(jié)合、鋅離子結(jié)合和肌動(dòng)蛋白結(jié)合，分別有19、18 和14 條靶基因富集。

圖5 mtr-miR168b 在牛體內(nèi)靶基因GO 功能富集分析Fig.5 Enrichment analysis of mtr-miR168b target gene GO function in cattle

2.5 mtr-miR168b 靶基因KEGG 功能富集分析

預(yù)測得到的mtr-miR168b 靶基因中，有296 條靶基因與KEGG 數(shù)據(jù)庫比對(duì)成功，獲得注釋。KEGG 的注釋結(jié)果按照KEGG 通路類型進(jìn)行分類，得到靶基因KEGG 通路類型分類圖（圖6）。對(duì)mtr-miR168b 的靶基因進(jìn)行Pathway 富集分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在靶基因注釋到的全部KEGG 通路中，N-聚糖生物合成（3.72%）、cGMP-PKG（環(huán)磷酸鳥苷酸-依賴性蛋白激酶）信號(hào)通路（2.37%）和血管平滑肌收縮（2.37%）為富集最顯著的信號(hào)通路。另外，甘油磷脂代謝（1.69%）通路也被顯著富集。

圖6 mtr-miR168b 在牛體內(nèi)靶基因KEGG 通路富集分析Fig.6 Enrichment analysis of mtr-miR168b target gene KEGG function in cow

2.6 脂代謝相關(guān)靶基因篩選

通過靶基因預(yù)測分析，得到部分與脂肪代謝相關(guān)的靶基因與信號(hào)通路，如SERINC1、CPT1A和STARD7等。通過網(wǎng)站查詢預(yù)測靶基因在牛奶、乳腺以及乳腺脂肪內(nèi)的表達(dá)評(píng)分。表達(dá)評(píng)分高，證明該基因在特定組織表達(dá)豐度高，具有更明顯的調(diào)控作用。由表6 可知，SERINC1、CPT1A和STARD7在牛奶和乳腺脂肪中的表達(dá)評(píng)分均高于80，而CLN8和CPTP在牛奶中的表達(dá)評(píng)分較低。SERINC1與磷脂生物合成和鞘脂代謝過程相關(guān)；STARD7參與脂質(zhì)代謝信號(hào)通路、甘油磷脂合成以及磷脂代謝信號(hào)通路；CPT1A參與脂肪酸β 氧化信號(hào)通路、AMPK 信號(hào)通路以及PPAR-α 信號(hào)通路。上述預(yù)測到的3 個(gè)mtr-miR168b 靶基因在牛奶和乳腺脂肪中具有較高的表達(dá)評(píng)分，且均參與脂質(zhì)代謝相關(guān)信號(hào)通路，可作為載體構(gòu)建的首選靶基因。

表6 mtr-miR168b 脂質(zhì)代謝靶基因與組織表達(dá)評(píng)分Table 6 mtr-miR168b lipid metabolism target gene and tissue expression score

2.7 實(shí)時(shí)熒光定量檢測靶基因

將mtr-miR168b mimics 和NC 分別轉(zhuǎn)染到BMEC 中，對(duì)上述結(jié)果中篩選出來的SERINC1、CPT1A和STARD7進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量。結(jié)果表明，CPT1A和STARD7mimics 組中基因表達(dá)量與NC 組相比均有顯著下調(diào)趨勢（P＜0.01），這為mtr-miR168b 與CPT1A和STARD7靶向關(guān)系提供了進(jìn)一步佐證（圖7）。

圖7 轉(zhuǎn)染后乳腺上皮細(xì)胞預(yù)測靶基因表達(dá)量Fig.7 Predicting target gene expression level of breast epithelial cells after transfection

2.8 雙熒光素酶報(bào)告驗(yàn)證mtr-miR168b 和CPT1A 基因靶向關(guān)系

構(gòu)建了CPT1A和STARD73' UTR-psiCHECKTM-2 重組雙熒光素酶報(bào)告基因載體。將靶基因質(zhì)粒與mtrmiR168b mimics 或NC 共轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞48 h 后進(jìn)行熒光素酶活性檢測，結(jié)果顯示：WT-STARD7+mtr-miR168b mimics 組較WT-STARD7+mtr-miR168b NC 組熒光素酶活性顯著下降（P＜0.01）。MUT-STARD7+mtrmiR168b mimics 組與MUT-STARD7+mtr-miR168b NC 組熒光素酶活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖8），CPT1A與STARD7熒光結(jié)果趨勢一致。這證明mtr-miR168b 與STARD7和CPT1A基因均具有靶向關(guān)系。

圖8 相對(duì)熒光素酶活性Fig.8 Relative luciferase activity

3 討論

多種植物或中草藥已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于畜禽飼料，用以提高養(yǎng)殖水平，改善肉品質(zhì)。已有報(bào)道稱，給豬灌喂或者讓其自由采食玉米（Zea mays），均可以在豬的脂肪和肌肉中檢測到豐富的玉米源miRNAs［21-22］。黎夢等［23］研究表明，給小鼠灌服植物源miRNAs 導(dǎo)致小鼠肌肉脂代謝比例顯著增加，附睪脂肪沉積顯著減少。此外，植物miR167e-5p，干燥堅(jiān)果中的miR159a 和miR156c 也被確定可以通過靶向動(dòng)物體內(nèi)源性基因調(diào)節(jié)脂肪的生成［24-25］。上述結(jié)果表明，植物源miRNAs 可以進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)，并參與畜禽體內(nèi)肌肉和脂肪形成的調(diào)節(jié)。本研究得到的結(jié)論與其一致，即苜蓿源miR168b 進(jìn)入奶牛體內(nèi)調(diào)節(jié)脂代謝。研究植物源miRNAs 對(duì)畜禽脂代謝相關(guān)靶基因的作用關(guān)系，對(duì)改善肉用家畜的肉品質(zhì)及乳用家畜的乳脂率具有重要意義。

本研究在正常飼喂的高乳脂和低乳脂奶牛的血液和牛奶中均檢測到苜蓿源miRNAs，這證明了苜蓿源miRNAs 可以通過采食進(jìn)入牛體內(nèi)。苜蓿源miRNA 隨著奶牛采食苜蓿進(jìn)入奶牛體內(nèi)，參與奶牛體內(nèi)的血液循環(huán)到達(dá)乳腺細(xì)胞，隨著乳腺細(xì)胞合成牛奶的過程最終進(jìn)入牛奶中，故在奶牛血液和牛奶中都可以檢測到苜蓿源miRNAs 的存在。同一組不同牛的血液和牛奶中，苜蓿源miRNAs 的表達(dá)量有較大的差異，這可能與牛自身的攝入量和代謝相關(guān)。其中，奶牛自身對(duì)miRNA 的代謝差異可能是導(dǎo)致miRNA 在不同奶牛體內(nèi)差異表達(dá)的主要原因。但mtr-miR168b 在高乳脂和低乳脂奶牛血液和牛奶中均穩(wěn)定存在，并且高乳脂組mtr-miR168b 的表達(dá)量顯著高于低乳脂組，故推測mtr-miR168b 在奶牛體內(nèi)靶向的基因中有與脂代謝密切相關(guān)的基因?；谏鲜鐾普?，通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染特異性提高了BMEC 中mtr-miR168b 的表達(dá)水平，結(jié)果表明mtr-miR168b 高表達(dá)后，脂代謝標(biāo)志基因PPARγ、SCD1、CEBP/β和SREBP1在BMEC 中的表達(dá)量均被抑制，且隨著時(shí)間推移，表達(dá)量下降更加明顯。為了進(jìn)一步闡明mtr-miR168b 對(duì)BMEC 脂肪生成影響的作用機(jī)制，對(duì)mtr-miR168b 靶基因進(jìn)行了功能富集分析，并篩選出了mtr-miR168b 與脂代謝密切相關(guān)的CPT1A和STARD7兩個(gè)靶基因（圖9）。

圖9 苜蓿源mtr-miR168b 影響奶牛乳腺上皮細(xì)胞脂質(zhì)代謝Fig.9 Summary of pathway by which mtr-miR168b from alfalfa influences lipid metabolism in BMECs

STARD7蛋白是一種脂質(zhì)結(jié)合蛋白，在脂質(zhì)運(yùn)輸、甘油磷脂合成信號(hào)通路中均發(fā)揮重要作用。并且已有研究表明，嘉興黑豬脂肪細(xì)胞內(nèi)的miR-206 通過靶向STARD7抑制了脂肪細(xì)胞的增殖［26］。CPT1 是脂肪分解代謝的關(guān)鍵酶，也是脂肪酸β 氧化過程中的限速酶，CPT1A是其中一種亞型基因。已有研究表明，CPT1A基因表達(dá)量與各肌肉組織肌內(nèi)脂肪含量呈顯著正相關(guān)關(guān)系，還可以減少小鼠肝臟中的脂肪變性［27-28］。STARD7主要調(diào)節(jié)的脂類為磷脂和鞘脂，而磷脂和鞘脂是包裹乳脂的乳脂球膜（milk fat globular membrane，MFGM）的主要組成成分［29］。已有研究表明，MFGM 磷脂的變化對(duì)牛乳的乳化性、穩(wěn)定性和理化性質(zhì)會(huì)產(chǎn)生一定影響，進(jìn)而改變牛乳品質(zhì)，并且如果牛乳中脂肪含量增加，則會(huì)形成比較大的脂肪球，這也揭示了脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)與脂肪球大小呈正相關(guān)的現(xiàn)象［30-31］。

mtr-miR168b 靶基因顯著富集在ATP 結(jié)合與GTP 結(jié)合條目，甘油磷脂通路和mTOR 信號(hào)通路。ATP 與GTP 之間結(jié)合與轉(zhuǎn)化可以通過三羧酸循環(huán)完成，是機(jī)體重要的供能方式，參與多種信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)，其中AMPK信號(hào)通路由于細(xì)胞內(nèi)ATP 減少、AMP/ATP 增加被激活。AMPK 信號(hào)通路通過調(diào)節(jié)葡萄糖和脂肪酸的攝入，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)膽固醇、糖原、蛋白質(zhì)、脂肪酸的合成與氧化，以滿足能量需求，同時(shí)調(diào)節(jié)機(jī)體脂代謝［32-33］。mTOR 有mTORC1 和mTORC2 兩個(gè)亞型，mTORC2 通過誘導(dǎo)AKT 蛋白氨基酸位點(diǎn)磷酸化激活A(yù)KT，激活的AKT 通過磷酸化2448 位點(diǎn)的蘇氨酸激活mTORC1，之后被完全激活的AKT/mTOR 信號(hào)通路開始調(diào)節(jié)細(xì)胞中脂肪的生成、葡萄糖的代謝和細(xì)胞的凋亡［34-35］。mtr-miR168b 的靶基因CPT1A同時(shí)位于AMPK 信號(hào)通路和mTOR 信號(hào)通路，此外STARD7基因參與甘油磷脂合成（R-HSA-1483206）代謝通路。故本研究推測mtr-miR168b 主要通過靶向CPT1A和STARD7基因參與AMPK、mTOR 和甘油磷脂合成信號(hào)通路，進(jìn)而調(diào)節(jié)奶牛體內(nèi)的脂代謝。并且CPT1A和STARD7基因與牛乳中乳脂率的調(diào)節(jié)也有一定聯(lián)系，這為mtr-miR168b 在基因水平調(diào)控奶牛乳脂代謝提供了驗(yàn)證方向。

4 結(jié)論

DHI 檢測篩選出高乳脂奶牛和低乳脂奶牛，并在兩組奶牛的血液和牛奶中均檢測到了苜蓿源miRNAs，其中mtr-miR168b 在高乳脂奶牛血液和牛奶中的表達(dá)量與低乳脂奶牛相比具有顯著差異。進(jìn)一步試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，mtrmiR168b 高表達(dá)抑制了BMEC 中脂代謝標(biāo)志基因PPARγ、SCD1、CEBP/β和SREBP1的表達(dá)量。為明確mtrmiR168b 對(duì)乳脂的調(diào)節(jié)機(jī)制，對(duì)mtr-miR168b 在牛體內(nèi)的靶基因進(jìn)行功能富集分析，發(fā)現(xiàn)預(yù)測靶基因主要與N-聚糖生物合成（3.72%）、cGMP-PKG 信號(hào)通路（2.37%）和甘油磷脂代謝通路（1.69%）顯著相關(guān)。雙熒光素酶報(bào)告驗(yàn)證了CPT1A和STARD7與mtr-miR168b 靶向關(guān)系，為后續(xù)驗(yàn)證苜蓿源miRNAs 調(diào)控奶牛乳脂提供了可進(jìn)一步驗(yàn)證的基因。