大狼毒對紫花苜蓿幼苗生理及內(nèi)源激素含量的影響

單貴蓮，馬祖艷，李嘉懿，劉洋，謝勇，劉佳，初曉輝

（1. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)科學(xué)系，云南 昆明 650201；2. 德州市慶云縣自然資源局，山東 德州 253700；3. 云南省林業(yè)和草原局，云南 昆明 650224；4. 云南省昆明市動物疫病預(yù)防控制中心，云南 昆明 650223；5. 香格里拉市林業(yè)和草原局，云南 迪慶 674499）

大狼毒（Euphorbia jolkinii），又名土瓜狼毒，屬大戟科多年生草本植物，廣泛分布于滇西北高寒草甸［1-3］。大狼毒根系發(fā)達(dá)且扎根深，產(chǎn)種量大，抗寒抗旱能力強(qiáng)，在高寒退化草地生境中有極強(qiáng)的生存優(yōu)勢，目前已成為滇西北退化高寒草甸的主要毒害草，被列為當(dāng)?shù)靥烊徊菰谋就寥肭种参铮╪ative invasive plant）［2-3］。有研究顯示，大狼毒在滇西北高寒草甸的入侵?jǐn)U散致使草地植物密度及可食牧草占比顯著下降，毒害草占比顯著增加，草地群落單一化，植物物種豐富度和多樣性顯著下降［4-5］。大狼毒的存在對草甸植物的多樣性具有顯著的負(fù)面影響，化感作用可能是大狼毒入侵草地物種多樣性銳減的主要原因之一［4］。

化感作用（allelopathy）是指植物在其生長發(fā)育過程中，通過釋放低分子有機(jī)酸、萜類、酚類等化感物質(zhì)改變其周圍微生態(tài)環(huán)境，進(jìn)而導(dǎo)致同一生境中植物之間相互排斥或促進(jìn)的一種自然現(xiàn)象［6］?；凶饔迷诓莸匮萏嬷邪l(fā)揮著十分重要的作用［7-10］。植物會通過化感作用增強(qiáng)競爭能力、影響伴生植物的萌發(fā)生長，進(jìn)而改變?nèi)郝湮锓N的分布格局［7，11-16］，驅(qū)動群落演替［9，16-18］。如劉雅婧等［12］研究表明，狼毒（Stellera chamaejasme）浸提液對紫花苜蓿（Medicago sativa）等3 種牧草萌發(fā)生長產(chǎn)生明顯的抑制作用。Zhu 等［13］研究表明，狼毒根系分泌物通過改變土壤有效養(yǎng)分和pH 值，進(jìn)而影響羊草（Leymus chinensis）的生長并引起群落的演替。靳瑰麗等［14］研究表明醉馬草（Achnatherum inebrians）水浸液對伴生植物種子萌發(fā)及幼苗生長產(chǎn)生不同程度的抑制作用，其抑制程度隨水浸液濃度增加而逐漸上升。王輝等［15］研究發(fā)現(xiàn)，舟葉橐吾（Ligularia cymbulifera）水浸液抑制了3 種牧草的種子萌發(fā)和幼苗生長，以根部抑制程度強(qiáng)于莖葉。李彥飛等［16］研究表明，大狼毒水浸提液對苜蓿種子萌發(fā)及幼苗生長產(chǎn)生化感抑制作用，以根部抑制作用強(qiáng)于莖葉和根部土壤。王紫媛等［17］研究指出，大狼毒水浸提液會對優(yōu)良牧草的種子萌發(fā)和幼苗生長產(chǎn)生化感抑制作用，以對種子萌發(fā)的抑制強(qiáng)于對幼苗生長的抑制。鄧文紅［18］研究顯示黑沙蒿（Artemisia ordosica）浸提液會影響伴生植物的萌發(fā)生長，進(jìn)而影響群落的演替。

大狼毒植株體內(nèi)含有的二萜、三萜、苯丙素類等化學(xué)物質(zhì)［19］究竟會引起牧草生長和生理上的哪些變化？目前還鮮見研究。據(jù)此，本研究以適宜滇西北高寒牧區(qū)自然氣候條件的‘牧歌401+Z’紫花苜蓿（M.sativa‘Amerigraze 401+Z’）為受體材料，開展大狼毒不同部位粉碎物對紫花苜蓿幼苗生長、生理及內(nèi)源激素含量的影響研究，通過研究探討大狼毒蔓延區(qū)草地物種多樣性銳減的原因，為評估大狼毒對草地物種多樣性的影響提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 大狼毒植株及根部土壤的獲取 2019 年8 月中旬大狼毒盛花期，于滇西北亞高山草甸挖取大狼毒完整植株，將根部和莖葉分開，清洗、晾曬、粉碎備用。同步采集土層深度為0～20 cm 的大狼毒根部周圍土壤（5 cm 范圍內(nèi)），風(fēng)干、搗碎備用。

1.1.2 紫花苜蓿來源及品種特性 受體材料為‘牧歌401+Z’紫花苜蓿（由北京正道種業(yè)有限公司提供），該品種產(chǎn)量高、品質(zhì)優(yōu)、抗性強(qiáng)，適合用于滇西北高寒牧區(qū)改良天然草地及建植人工草地［20］。

1.2 測定指標(biāo)與方法

參考周淑清等［21］的方法，將大狼毒粉碎物按不同用量（0、1、2、3 g）添加到穴盤中，通過粉碎物腐解釋放化感物質(zhì)的方法，開展其對紫花苜蓿生長及生理的影響研究。具體為：2020 年5 月中旬，分別稱取0 g（設(shè)為對照，CK）、1 g（Y1）、2 g（Y2）、3 g（Y3）大狼毒根、莖葉、根部土壤粉碎物，與珍珠巖混合均勻后放到體積為400 mL 的穴盤中（每用量設(shè)5 次重復(fù)），在每穴盤中播種50 粒紫花苜蓿種子，將穴盤放置在云南農(nóng)業(yè)大學(xué)草學(xué)基地溫室大棚，正常水肥管理，待苜蓿生長至分枝期，參照曾兵等［22］的方法，測定紫花苜蓿株高（垂直高度）、根系長度和單株鮮重。參照王學(xué)奎［23］的方法，采用分光光度法測定葉綠素a、b 含量，TTC 法測定根系活力，紫外吸收法測定過氧化氫酶（catalase，CAT）活性，NBT 光還原法測定超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性，比色法測定過氧化物酶（peroxidase，POD）活性。參照焦奎等［24］的方法，利用酶聯(lián)免疫法測定赤霉素（gibberellic acid，GA）、玉米素（zeatin，ZT）、吲哚乙酸（indoleacetic acid，IAA）、脫落酸（abscisic acid，ABA）含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 20.0 進(jìn)行One-way ANOVA 方差分析及Duncan 多重比較。參照Muhammas 等［25］的方法計(jì)算化感效應(yīng)指數(shù)（inhibitory rate，RI）及綜合化感效應(yīng)（synthetical effect，SE），計(jì)算公式為：

式中：C為對照組，T為處理組；RI和SE反映化感效應(yīng)的強(qiáng)弱，＜0 表示抑制效應(yīng)，＞0 表示促進(jìn)效應(yīng)，絕對值大小表示作用強(qiáng)度［25］。

2 結(jié)果與分析

2.1 大狼毒對紫花苜蓿幼苗生長的影響

與CK 相比，1 g 大狼毒根部土壤的添加可顯著提高苜蓿的株高（P＜0.05），2 和3 g 大狼毒根部土壤的添加對苜蓿株高無顯著影響；不同用量根、莖葉粉碎物的添加顯著降低了苜蓿的株高（P＜0.05），且降低程度隨添加量的增加而增加（圖1A）。與CK 相比，1 g 大狼毒根部土壤的添加對苜蓿根系的生長有一定的促進(jìn)作用，但促進(jìn)效果不顯著，2、3 g 大狼毒根部土壤的添加顯著促進(jìn)了苜蓿根系的生長（P＜0.05）；莖葉、根粉碎物的添加顯著抑制了苜蓿根系的生長（P＜0.05），且抑制作用隨添加量的增加而加強(qiáng)（圖1B）。與CK 相比，大狼毒根部土壤的添加對苜蓿鮮重?zé)o明顯影響；根、莖葉粉碎物的添加顯著抑制了苜蓿有機(jī)物質(zhì)的積累，導(dǎo)致苜蓿地上部單株鮮重顯著下降（P＜0.05），且下降幅度隨添加量的增加而增加（圖1C）。

圖1 大狼毒粉碎物對苜蓿幼苗形態(tài)的影響Fig.1 Effects of E. jolkinii crushed materials on alfalfa morphology

添加1 g 大狼毒根部土壤促進(jìn)了苜蓿幼苗的生長，添加2、3 g 大狼毒根部土壤對苜蓿幼苗生長無促進(jìn)作用。大狼毒根、莖葉粉碎物的腐解對苜蓿幼苗生長產(chǎn)生明顯的抑制作用，且抑制強(qiáng)度隨添加量的增加而加強(qiáng)，原因可能是大狼毒植株體內(nèi)含有的化學(xué)物質(zhì)抑制了受體植物的生長［19］。大狼毒不同部位粉碎物的綜合化感效應(yīng)以根強(qiáng)于莖葉，又以莖葉強(qiáng)于根部土壤（圖2）。

圖2 大狼毒粉碎物對苜蓿幼苗形態(tài)的綜合化感效應(yīng)Fig. 2 Synthetical effects of E. jolkinii crushed materials on alfalfa morphology

2.2 大狼毒對紫花苜蓿幼苗生理的影響

2.2.1 對葉綠素含量的影響 葉綠素含量是反映植物光合能力的一個(gè)重要指標(biāo)，葉綠素含量越高，植物光合能力越強(qiáng)［23］。與CK 相比，添加大狼毒根部土壤可增加苜蓿葉綠素a、b 含量，以添加2 g 處理葉綠素a、b 含量最高，比對照分別增加了30.0%和14.9%。大狼毒莖葉、根粉碎物的添加使紫花苜蓿葉綠素a、b含量顯著降低（P＜0.05），下降幅度隨添加量的增加而增加（圖3A，B）。

圖3 大狼毒粉碎物對苜蓿幼苗葉綠素含量的影響Fig.3 Effects of E. jolkinii crushed materials on alfalfa chlorophyll contents

2.2.2 對根系活力的影響 根系活力是根系功能的主要衡量指標(biāo)，其對植株地上部生長及營養(yǎng)狀況等有直接的影響［23］。與CK 相比，大狼毒根部土壤的添加可顯著增強(qiáng)苜蓿幼苗的根系活力（P＜0.05），莖葉、根粉碎物的添加會導(dǎo)致苜蓿幼苗根系活力顯著下降（P＜0.05），且下降幅度隨添加量的增加而增加，以添加根粉碎物下降最為顯著（圖4）。

圖4 大狼毒粉碎物對苜蓿幼苗根系活力的影響Fig. 4 Effects of E. jolkinii crushed materials on alfalfa root activity

2.2.3 對抗氧化酶的影響 SOD 是植物體內(nèi)抗氧化防御體系的關(guān)鍵酶，它可將O2-歧化成H2O2和O2［23］。與CK 相比，添加不同用量大狼毒根部土壤后，紫花苜蓿SOD 活性顯著下降；添加不同用量大狼毒莖葉、根粉碎物后，紫花苜蓿SOD 活性顯著增加（P＜0.05）（圖5A）。POD 和CAT 可以將植物體內(nèi)的H2O2分解成H2O 與O2，清除活性氧的積累，減少其對植物細(xì)胞的損害［23］。與CK 相比，添加不同用量大狼毒根部土壤處理下，紫花苜蓿POD 活性均無顯著變化；添加不同用量大狼毒莖葉、根粉碎物處理下，紫花苜蓿POD 活性顯著增強(qiáng)（P＜0.05）（圖5B）。添加1 g 大狼毒根部土壤處理下，紫花苜蓿CAT 活性下降不顯著，添加2、3 g 大狼毒根部土壤處理下，紫花苜蓿CAT 活性顯著降低（P＜0.05）；添加不同用量大狼毒莖葉和根粉碎物后，紫花苜蓿CAT 活性顯著增強(qiáng)（P＜0.05）（圖5C）。

圖5 大狼毒粉碎物對苜蓿抗氧化酶活性的影響Fig.5 Effects of E. jolkinii crushed materials on alfalfa antioxidant enzymes activity

大狼毒不同部位粉碎物的綜合化感效應(yīng)以根系強(qiáng)于莖葉，又以莖葉強(qiáng)于根部土壤。大狼毒根部土壤對受體植物生理平衡的維持有促進(jìn)作用，添加2 g 根部土壤處理下促進(jìn)效果最明顯，之后下降。大狼毒根、莖葉粉碎物的添加破壞了苜蓿的生理平衡，且破壞程度隨添加量的增加而增強(qiáng)，分析原因?yàn)榇罄嵌竞械幕形镔|(zhì)使苜蓿生理平衡受到破壞，苜蓿幼苗產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，體內(nèi)產(chǎn)生過量過氧化物，為清除過氧化物，維持膜系統(tǒng)穩(wěn)定及自身的生理平衡，苜?？寡趸富钚栽鰪?qiáng)（圖6）。

圖6 大狼毒粉碎物對苜蓿幼苗生理的綜合化感效應(yīng)Fig. 6 Synthetical effects of E. jolkinii crushed materials on alfalfa physiology

2.3 大狼毒對紫花苜蓿幼苗內(nèi)源激素含量的影響

GA 可促進(jìn)植物生長發(fā)芽、開花結(jié)果及果實(shí)發(fā)育［26］。 與CK 相比，大狼毒根、莖葉、根部土壤粉碎物的添加使苜蓿幼苗體內(nèi)GA 含量顯著下降（P＜0.05）。體現(xiàn)為：與CK 相比，添加1、2、3 g 大狼毒根部土壤處理后，紫花苜蓿幼苗體內(nèi)GA 含量分別下降了9.1%、11.3%和12.9%；添加1、2、3 g 大狼毒莖葉粉碎物處理后，GA 含量分別下降了10.7%、11.6%和13.0%；添加1、2、3 g 大狼毒根粉碎物處理后，GA 含量分別下降了11.6%、12.8%和14.9%（圖7A）。

圖7 大狼毒粉碎物對苜蓿幼苗內(nèi)源激素含量的影響Fig.7 Effects of E. jolkinii crushed materials on alfalfa endogenous hormone contents

ABA 作為一種脅迫響應(yīng)激素，啟動植物體內(nèi)一些保護(hù)反應(yīng)，從而使植物對外界非生物因子的脅迫具備一定的適應(yīng)性［26］。大狼毒根、莖葉、根部土壤粉碎物的添加使苜蓿幼苗體內(nèi)ABA 含量升高，與CK 相比差異顯著（添加1 g 根部土壤處理除外）（P＜0.05），上升幅度以莖葉、根粉碎物處理高于根部土壤處理（圖7B）。

ZT 屬于細(xì)胞分裂素的一種，其主要作用是控制細(xì)胞分裂、葉衰老和營養(yǎng)的分配等［26］。 與CK 相比，大狼毒根、莖葉、根部土壤粉碎物的添加使苜蓿幼苗體內(nèi)ZT 含量顯著下降（P＜0.05），且下降幅度隨添加量的增加而增加（圖7C）。

IAA 對植物的作用主要是促進(jìn)細(xì)胞的生長。與CK 相比，大狼毒根、莖葉、根部土壤粉碎物的添加顯著降低了苜蓿幼苗體內(nèi)的IAA 含量（P＜0.05），且下降幅度隨添加量的增加而增加。具體為：與CK 相比，添加1、2、3 g根部土壤處理下，紫花苜蓿幼苗體內(nèi)IAA 含量分別下降了3.7%、5.2%和10.2%；添加1、2、3 g 莖葉粉碎物處理后，IAA 含量分別下降了2.5%、5.2%和7.2%；添加1、2、3 g 根粉碎物處理后，IAA 含量分別下降了6.2%、7.5%和10.2%（圖7D）。

大狼毒對苜蓿幼苗內(nèi)源激素合成的綜合化感效應(yīng)為負(fù)值，即大狼毒粉碎物的添加抑制了苜蓿幼苗內(nèi)源激素的合成，且抑制強(qiáng)度隨粉碎物添加量的增加而增加；不同部位的抑制效果以根部土壤、根粉碎物強(qiáng)于莖葉粉碎物（圖8）。

圖8 大狼毒粉碎物對苜蓿幼苗內(nèi)源激素的綜合化感效應(yīng)Fig. 8 Synthetical effects of E. jolkinii crushed materials on alfalfa endogenous hormones

3 討論

前人研究指出，狼毒、黃花棘豆（Oxytropis ochrocephala）等草原毒害草可分泌化感物質(zhì)抑制其他植物的生長［12，26-30］。本研究表明，大狼毒根部土壤可促進(jìn)紫花苜蓿幼苗的生長，但促進(jìn)效果不明顯。原因可能是大狼毒強(qiáng)烈的養(yǎng)分競爭能力使其根部土壤中富集了較多的營養(yǎng)物質(zhì)［2］，根部土壤的添加增加了營養(yǎng)物質(zhì)的供給，因此促進(jìn)了苜蓿幼苗的生長。大狼毒植株粉碎物的添加抑制了苜蓿幼苗的生長，且抑制作用隨粉碎物添加量的增加而增強(qiáng)，原因可能是大狼毒植株體內(nèi)含有的化學(xué)物質(zhì)破壞了苜蓿幼苗的生理平衡，進(jìn)而影響其生長。

草地有毒植物體內(nèi)含有的化感物質(zhì)會對受體植物幼苗的生理代謝產(chǎn)生影響［28，30-32］。如程巍等［28］研究表明，狼毒根系水提液提高了4 種高寒草甸常見植物幼苗丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量和超氧化物歧化酶活性。李翔等［30］研究表明黃花棘豆水提液處理降低了燕麥（Avena sativa）幼苗的根系活力和葉綠素含量，提高了MDA含量及SOD、POD、CAT 活性。高玉蓮等［32］指出，狼毒根提取液會導(dǎo)致燕麥、高粱（Sorghum bicolor）MDA 含量增加，POD、SOD 活性增強(qiáng)。本研究顯示，大狼毒莖葉、根粉碎物的添加導(dǎo)致紫花苜蓿根系活力下降，葉綠素合成受阻，SOD、POD、CAT 等保護(hù)酶活性增強(qiáng)。表明大狼毒體內(nèi)所含化學(xué)物質(zhì)使紫花苜蓿幼苗組織產(chǎn)生過量過氧化物，為阻止細(xì)胞膜脂過氧化，維持膜系統(tǒng)穩(wěn)定及自身的生理平衡，紫花苜蓿幼苗啟動應(yīng)激反應(yīng)，通過提高SOD、POD、CAT 等保護(hù)酶活性來清除活性氧，維持膜系統(tǒng)穩(wěn)定。大狼毒根部土壤的添加增加了苜蓿生長環(huán)境中營養(yǎng)物質(zhì)的供給［2］，促進(jìn)了苜蓿幼苗葉綠素的合成，提高其根系活力，進(jìn)而促進(jìn)苜蓿幼苗的生長。

植物激素在植物生長發(fā)育及抗逆性等方面起重要的調(diào)控作用［33］。通過調(diào)控植物激素的合成與代謝影響植物生長是化感作用的重要途徑［34］。郭偉等［35］指出，化感物質(zhì)的添加會對生菜（Lactuca sativa）內(nèi)源激素產(chǎn)生影響，隨著化感物質(zhì)濃度的增加，生菜幼苗IAA、GA 含量逐漸降低，ABA 含量逐漸增加。季麗萍［36］研究表明，瑞香狼毒根水浸提液處理會導(dǎo)致紫花苜蓿幼苗ABA 含量升高，GA、ZT 含量降低。李保珠等［37］研究認(rèn)為在環(huán)境脅迫條件下，植物通過激活A(yù)BA 的合成，從而提高抗逆性。本研究表明，大狼毒粉碎物的添加使紫花苜蓿幼苗GA、IAA、ZT合成受阻，由此推測大狼毒體內(nèi)含有的化感物質(zhì)可能使紫花苜蓿幼苗細(xì)胞壁收縮，降低其對水分的吸收，α-淀粉酶合成受阻，植株體內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)不能積累，由此限制細(xì)胞生長分裂，影響膜系統(tǒng)的功能［34-35］，從而抑制紫花苜蓿的生長，加速其老化。

綜上，大狼毒體內(nèi)含有的化感物質(zhì)會破壞受體植物的生理平衡，降低GA、ZT、IAA 的合成，進(jìn)而影響受體植物的幼苗生長。對大狼毒入侵草地而言，其對伴生植物的化感抑制作用會導(dǎo)致草地物種多樣性降低［16］。補(bǔ)播優(yōu)良牧草是提高大狼毒型退化草地物種多樣性、恢復(fù)其畜牧業(yè)生產(chǎn)功能的常用措施，但選擇補(bǔ)播草種時(shí)必須考慮其化感耐受性［16］。今后，應(yīng)進(jìn)一步以披堿草（Elymus dahuricus）、多年生黑麥草（Lolium perenne）、西南野古草（Arundinella hookeri）、鴨茅（Dactylis glomerata）、紫花苜蓿、紅三葉（Trifolium pratense）、百脈根（Lotus corniculatus）等適宜高寒地區(qū)退化草地補(bǔ)播治理的優(yōu)秀草種為受體材料，開展不同草種化感耐受性方面的比較研究，篩選萌發(fā)生長受大狼毒化感影響較小的草種補(bǔ)播，促進(jìn)大狼毒入侵草地的恢復(fù)治理。

4 結(jié)論

大狼毒植株粉碎物的添加會導(dǎo)致紫花苜蓿根系活力下降，抗氧化酶活性增強(qiáng)，葉綠素及GA、ZT、IAA 合成受阻，進(jìn)而顯著抑制其幼苗生長（P＜0.05）。大狼毒根部土壤的添加一方面會促進(jìn)紫花苜蓿葉綠素的合成，提高其根系活力，另一方面又會阻礙GA、ZT、IAA 的合成，最終表現(xiàn)為對紫花苜蓿幼苗生長無顯著影響。大狼毒不同部位粉碎物對苜蓿幼苗生長及生理的綜合化感效應(yīng)強(qiáng)弱順序?yàn)楦鶑?qiáng)于莖葉，莖葉強(qiáng)于根部土壤，對內(nèi)源激素合成的綜合化感效應(yīng)強(qiáng)弱順序?yàn)楦客寥缽?qiáng)于根，根強(qiáng)于莖葉。