QuEChERS-高效薄層色譜法測定蔬菜中10 種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留

高猛峰 張維誼 梅 博 童金蓉 沈斯文 王 霞 宋宇迎 豐東升

（上海市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全中心， 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心 （上海）， 上海 201708）

擬除蟲菊酯是從菊花中提取的天然除蟲菊酯的合成衍生物， 由菊花酸酯及其酸和醇的鹵化衍生物組成[1]， 具有高效、 低毒、 穩(wěn)定等特點， 已經(jīng)發(fā)展為繼有機磷和氨基甲酸酯類殺蟲劑后全球應用較廣的第3 大類殺蟲劑。 目前， 已經(jīng)開發(fā)出70 多種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥， 主要包括氯氰菊酯、 溴氰菊酯、氯氟氰菊酯、 聯(lián)苯菊酯等， 適用于蔬菜、 水果等農(nóng)產(chǎn)品害蟲防治[2～3]。 相關(guān)研究表明擬除蟲菊酯類農(nóng)藥有蓄積性[4]， 長期接觸會引發(fā)神經(jīng)毒性、 生殖發(fā)育毒性等疾病[5～9]， 農(nóng)產(chǎn)品和農(nóng)業(yè)環(huán)境中擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留問題日趨嚴重， 存在較大潛在危害。2021 年， 我國頒布實施的GB 2763-2021 《食品安全國家標準 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》 對蔬菜中擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的殘留限量值進行了嚴格限定， 限量值范圍在0.01～10 mg/kg 不等， 其中大多數(shù)葉菜類蔬菜和蕓薹屬類蔬菜中的限量值在0.5 mg/kg 以上， 少部分茄果類蔬菜和瓜類蔬菜中的限量值在0.05～0.2 mg/kg 之間， 一些根莖類和薯芋類蔬菜中的限量值則低至0.01 mg/kg。 因此， 有必要建立簡單、 快速、 高效的蔬菜中擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的檢測分析方法， 以有效保障農(nóng)產(chǎn)品食用安全和人類健康。

高效薄層色譜 （High performance thin layer chromatography， HPTLC） 是一種特殊的液相色譜， 其利用物質(zhì)在同一吸附劑上吸附能力差異來進行分離， 根據(jù)目標物與標準品用同一方法所得色譜的斑點比移（Rf） 值進行定性分析， 根據(jù)斑點的灰度進行定量分析。 該方法具有前處理簡單、 可實現(xiàn)高通量分析、 成本低等優(yōu)點[10]。 目前HPTLC 已經(jīng)形成了標準化儀器操作平臺， 可以實現(xiàn)半自動化或全自動化， 進一步拓寬了應用范圍， 被廣泛地應用于食品中農(nóng)藥和獸藥殘留的檢測分析中[11～14]， 如陳啟飛[13]成功將HPTLC 應用于畜禽產(chǎn)品中的獸藥殘留檢測； YUE 等[14]將HPTLC 應用在茶葉中有機磷農(nóng)藥檢測分析中， 研究結(jié)果驗證了HPTLC 在大批量農(nóng)產(chǎn)品樣品檢測中的準確性和適用性。QuEChERS 是一種簡單、 經(jīng)濟、 快速、 準確、 高效的樣品前處理技術(shù)， 被廣泛應用于蔬菜、 水果等基質(zhì)的農(nóng)藥殘留分析中[15～17]。 本研究擬采用改良的一步式QuEChERS 前處理技術(shù)結(jié)合高效薄層色譜法，建立蔬菜樣品中10 種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的快速檢測方法。

一、 材料與方法

（一） 材料、 試劑與儀器大白菜、 番茄、 西葫蘆、 青菜、 空心菜、 結(jié)球甘藍等蔬菜樣品購于上海市農(nóng)貿(mào)市場。

10 種農(nóng)藥標準品： 甲氰菊酯、 氟胺氰菊酯、氰戊菊酯、 氯氟氰菊酯、 氯氰菊酯、 氟氰戊菊酯、溴氰菊酯、 氯菊酯、 聯(lián)苯菊酯、 氟氯氰菊酯（德國Dr.Ehrenstorfer 公司）。 乙腈、 石油醚（60～90℃）、三氯甲烷、 環(huán)己烷、 丙酮 （德國Merck 公司），QuEChERS 提取鹽包 （4 g 無水MgSO4、 1 g NaCl、1 g 檸檬酸鈉和0.5 g 檸檬酸氫二鈉） 和快速濾過型mPFC 凈化柱（北京科德諾思技術(shù)有限公司）。

高效薄層板、 毛細管、 層析缸、 BC-D1 高效農(nóng)藥殘留速測儀、 NS-D1 濃縮儀 （上海瑞鑫科技儀器有限公司）， Milli-Q 超純水機 （美國Millipore 公司）， 百分之一天平 （上海梅特勒集團有限公司）。

（二） 實驗方法

1.樣品前處理。 稱取10 g 均質(zhì)試樣 （精確至0.01 g） 于50 mL 塑料離心管中， 加入20 mL 乙腈，振搖1 min 后用濾紙過濾， 收集濾液， 向濾液中加入QuEChERS 提取鹽包， 劇烈振蕩1 min 后靜置3 min。 吸取1.5 mL 上清液經(jīng)mPFC 凈化柱一次凈化，準確吸取1.0 mL 凈化液至2.0 mL 離心管中， 后進行濃縮至干， 加入75 μL 石油醚（60～90℃） 復溶。

2.高效薄層色譜成像分析。 在層析缸中加入適量展開劑， 用定量毛細管分別吸取標準溶液和樣品處理溶液， 在薄層板基線處的固定位置上點樣，每個點至少間隔0.7 cm， 單塊板最多可點6 個點。點樣結(jié)束時用電吹風機熱風吹2 min， 然后將該薄層板放入層析缸中展開， 當展開劑到達溶劑前沿線時， 將薄層板取出并晾干。 將完成展開的薄層板放入顯色儀中， 顯色10 min 后取出， 放入成像分析儀中分析。

3.定性與定量分析。 成像分析儀中內(nèi)設(shè)兩種參比標樣物質(zhì)， 分別為20 μg/mL 氰戊菊酯和溴氰菊酯標準溶液。 根據(jù)參比標樣和樣品中各組分經(jīng)兩種展開劑處理后相對移動位置各不相同的特性， 同一樣品經(jīng)展開劑1 和展開劑2 分別展開， 進行二次分析來提高定性結(jié)果的準確性。 通過軟件自動掃描， 得到樣品中擬除蟲菊酯類農(nóng)藥斑點的Rf值和灰度積分值。 根據(jù)目標物與參照物用同一方法所得色譜斑點的Rf值進行定性分析， 根據(jù)圖譜斑點的灰度積分值進行定量分析。 一次實驗可以同時檢測兩種不同的擬除蟲菊酯類農(nóng)藥。

4.標準曲線。 將10 種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥按表1 分成5 組， 用石油醚分別配成0.5、 0.8、 1.2、1.5、 2.0 μg/mL 的混合標準工作溶液。 分析軟件將薄層板分為6 通道， 用毛細管吸取標準品分別點板， 0～1 號通道為標準對照， 2～5 通道分別為不同濃度的混合標準工作溶液， 通過展開劑1 和展開劑2 展開后成像分析。

5.樣品制備。 選用6 種具有代表性的蔬菜（包括簡單基質(zhì)大白菜、 番茄、 西葫蘆， 復雜基質(zhì)青菜、 空心菜、 結(jié)球甘藍） 作為樣品空白基質(zhì)， 通過空白基質(zhì)加標分別制備陰性樣品和陽性樣品。 （1）陰性樣品制備。 陰性樣品由36 個加標樣品組成，每種蔬菜稱取6 個平行樣， 添加濃度為0.25 mg/kg。 （2） 陽性樣品制備。 陽性樣品由72 個加標樣品組成， 每種蔬菜稱取12 個平行樣， 平均分為2 組， 每組6 個樣品。 分別加入不同濃度的標準液， 一組加標濃度為0.5 mg/kg， 另一組加標濃度為1.0 mg/kg。

二、 結(jié)果與分析

（一） 一步式QuEChERS 和傳統(tǒng)QuEChERS比較以西葫蘆作為簡單基質(zhì)， 青菜作為復雜基質(zhì)， 在添加水平為0.5 mg/kg 時， 比較了一步式QuEChERS 方法（簡稱本方法）和GB 23200.113-2018 《食品安全國家標準 植物源性食品中208 種農(nóng)藥及其代謝物殘留量的測定 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法》 中的傳統(tǒng)QuEChERS 方法（簡稱傳統(tǒng)方法）對10 種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥回收率的影響， 結(jié)果見表2。 由表2 可知， 對于簡單基質(zhì)， 本方法的回收率范圍為84%～94%， GB 23200.113-2018 標準方法的回收率范圍為88%～98%， RSD 均≤6%；對于復雜基質(zhì)， 本方法的回收率范圍為71%～111%， GB 23200.113-2018 標準方法的回收率范圍為74%～100%， RSD 均小于10%， 滿足實際檢測要求。 兩種方法的回收率差異較小， 準確度也基本一致。 但與傳統(tǒng)方法相比， 本方法不需借助其他輔助儀器， 前處理時間可控制在10 min 以內(nèi)，比標準方法更方便， 用時更短。 由此可見， 一步式QuEChERS 方法可以在較短的時間內(nèi)準確地完成蔬菜中10 種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的提取凈化前處理。

表2 10 種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的線性方程、 相關(guān)系數(shù)、 檢出限

（二） 固定相的選擇HPTLC 采用粒度分布很窄的微粒硅劑 （5～10 μm） 制備高效薄層板， 靈敏度和分辨率大大提高。 通常分辨率與吸附劑微粒半徑的平方成反比， 涂層厚度為0.2～0.25 mm， 硅膠粉粒度為 （8±2）μm。 展開速度與吸附劑顆粒半徑成正比， 故顆粒越小， 展開速度越慢， 但在分離效率提高了之后可以大大縮短展開距離。

本研究選擇具有熒光背景的薄層板作為固定相進行分析， 在紫外燈照射下， 目標條帶會在薄層板上猝滅形成黑斑， 無需顯色劑顯色[18]。 實驗分別比較了3 種不同的高效薄層板（硅膠板、 中性氧化鋁板和堿性氧化鋁板） 的分離效果， 經(jīng)展開劑上行展開后， 在254 nm 紫外燈下觀察， 不同固定相分離結(jié)果見圖1。 結(jié)果表明， 采用高效薄層硅膠板分離后斑點集中， 分離效果明顯， 而采用中性氧化鋁板和堿性氧化鋁板斑點分離不明顯。 因此， 選擇高效薄層硅膠板作為固定相開展后續(xù)實驗。

圖1 不同固定相的分離效果對比

（三） 展開劑的優(yōu)化為使得待測組分的Rf值在0.2～0.8 之間， 同時考慮擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的溶解性， 以弱極性溶劑環(huán)己烷為基礎(chǔ)體系， 加入丙酮、 乙酸乙酯、 三氯甲烷作為調(diào)節(jié)試劑來調(diào)節(jié)展開系統(tǒng)的極性。 前期預實驗發(fā)現(xiàn)， 甲氰菊酯、 氯氰菊酯和氰戊菊酯性質(zhì)相近，Rf值大小相近， 較難實現(xiàn)分離， 而其他幾種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥Rf值都有較大差異。 所以以分離甲氰菊酯、 氯氰菊酯和氰戊菊酯為主要目標， 比較了3 種調(diào)節(jié)試劑的分離效果，基礎(chǔ)溶劑與調(diào)節(jié)劑的配比均為9∶1 （V∶V）， 結(jié)果見圖2。 結(jié)果表明， 3 種展開系統(tǒng)斑點都較為清晰，其中采用環(huán)己烷-乙酸乙酯作為展開系統(tǒng)時， 氯氰菊酯和氰戊菊酯斑點較近且混標斑點中兩者重合，未有效分離； 經(jīng)環(huán)己烷-丙酮、 環(huán)己烷-三氯甲烷兩種展開系統(tǒng)展開后， 氯氰菊酯和氰戊菊酯斑點有一定距離， 分離效果較好。

圖2 不同展開系統(tǒng)的分離效果對比

對三氯甲烷、 環(huán)己烷、 丙酮等展開劑進行不同配比， 經(jīng)大量實驗， 得出兩種較為理想的復合展開劑， 分別是展開劑1 （三氯甲烷-環(huán)己烷， 10∶1，V∶V） 和展開劑2 （環(huán)己烷-丙酮， 9∶1.5，V∶V），分離效果見圖3。 10 種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥標準點斑點規(guī)整且分離明顯， 表明展開劑對擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的檢測結(jié)果無明顯干擾， 分離效果佳。 實際檢測中可利用展開劑2 對展開劑1 得到的分析結(jié)果進行確認， 避免假陽性的出現(xiàn)。 混合標準溶液按表1 中分組進行配制， 得到5 組混標， 混標經(jīng)展開劑1 和展開劑2 的展開效果見圖4。 如圖4 表示， 1～5 組混標可兩兩分離且在兩種展開劑下得到的展開距離各不相同， 得到兩組不同的Rf值； 同組混標中的兩種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥在展開劑1 下的展開距離差值相較于展開劑2 下的差值更小， 因而可通過在兩種不同展開劑下的差異進行二次分析來提高定性的準確度。

圖3 不同展開劑的薄層色譜圖

圖4 5 組混標的薄層色譜圖

（四） 標準曲線與檢出限以青菜為基質(zhì)， 采用基質(zhì)配標的方式考察了添加不同梯度濃度的10種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥標準溶液的線性范圍 （0.5、0.8、 1.2、 1.5、 2.0 mg/kg） 和檢出限。 以甲氰菊酯和氟胺氰菊酯為例， 線性濃度范圍內(nèi)的甲氰菊酯和氟胺氰菊酯的展開效果見圖5。 由圖5 可知， 樣品通過前處理之后， 展開區(qū)基本不存在影響結(jié)果判定的雜質(zhì)斑點， 雜質(zhì)都集中在薄層板點樣點的最上部。

圖5 甲氰菊酯和氟胺氰菊酯基質(zhì)加標溶液的薄層色譜圖

在0.5～2.0 mg/kg 線性范圍內(nèi)， 以10 種農(nóng)藥的添加濃度與對應的積分值進行線性回歸分析， 結(jié)果見表2。 由表2 可知， 10 種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的線性關(guān)系良好， 相關(guān)系數(shù)均大于0.96， 檢出限均為0.5 mg/kg。

（五） 準確度和精密度以加標回收率和RSD分別表征準確度和精密度， 在1 倍檢出限和2 倍檢出限的添加水平下進行加標回收實驗， 準確度和精密度結(jié)果見表3。 結(jié)果表明， 10 種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥在蔬菜中的平均回收率在91.0%～123.4%之間，RSD 在7.7%～15.4%之間， 所建方法具有較好的準確度和精密度。

表3 方法的準確度和精密度（n＝6）

（六） 靈敏度與特異性靈敏度以方法在實驗條件下達到實際檢出限時， 檢出陽性結(jié)果的陽性樣品數(shù)占總陽性樣品數(shù)的百分比表示； 特異性以方法在實驗條件下達到實際檢出限時， 檢出陰性結(jié)果的陰性樣品數(shù)占總陰性樣品數(shù)的百分比表示。 本研究所建方法對10 種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的檢測靈敏度和特異性考察結(jié)果見表4。 如表4 所示， 靈敏度均大于95%， 特異性均大于94%， 假陰性率均低于5%， 假陽性率均低于6%， 符合一般快速檢測產(chǎn)品技術(shù)評價要求。

表4 方法的靈敏度和特異性（%）

三、 結(jié)論

本研究基于改良的QuEChERS 前處理技術(shù)和高效薄層色譜法， 建立了蔬菜中10 種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的快速檢測方法， 將一步式QuEChERS 方法成功應用于擬除蟲菊酯類農(nóng)藥快速檢測。 方法學考察結(jié)果表明， 方法在0.5～2.0 mg/kg 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好， 準確度、 精密度、 靈敏度和特異性等方面均能滿足分析要求， 可實現(xiàn)多個樣品同時檢測，耗時短， 分析效率高， 45 min 內(nèi)可檢測8 個樣品。且方法在色譜展開過程中所用的有機溶劑少， 分析成本低， 環(huán)境污染小， 適合各基層推廣應用。

本文引用格式： 高猛峰， 張維誼， 梅博， 等.QuEChERS-高效薄層色譜法測定蔬菜中10 種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留 ［J］.農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量與安全，2023 （5）： 55-60.

GAO Mengfeng， ZHANG Weiyi， MEI Bo，et al.Simultaneous determination of ten pyrethroid pesticides in vegetables by QuEChERS coupled with high performance thin layer chromatography［J］.Quality and Safety of Agro-products， 2023 （5）： 55-60.