煙草種子直接誘導愈傷組織的方法探究

彭 也,許健成,余璐璐,何正權,徐 飛

(1.三峽大學 生物與制藥學院,宜昌 443002;2.武漢生物工程學院 應用生物技術研究中心,武漢 430415)

煙草(NicotianatabacumL.)為茄科煙草屬一年生草本植物,在我國南北方均有種植,主要用作工業(yè)原料,以及用于藥用麻醉、催汗和鎮(zhèn)痛等方面,應用范圍廣且具有較高的經濟價值[1]。煙草也是一種重要的模式植物,是研究細胞脫分化和再分化的理想材料,也是植物遺傳轉化和基因功能鑒定分析的重要載體[2]。

愈傷組織培養(yǎng)是獲得再生植株和遺傳轉化的基礎,已被廣泛應用于農業(yè)、園林等各項生產中,在細胞生物學、分子生物學和基因工程等研究領域也發(fā)揮著重要作用,因此,如何獲得優(yōu)良的愈傷組織對農業(yè)生產以及科學研究尤為重要。通過葉片外植體誘導煙草愈傷組織較為常見[3]。根和莖等組織也是適合誘導愈傷組織的材料[4]。采用葉片等作為外植體誘導愈傷,雖然技術成熟,但此類外植體來源耗時長,消毒過程中容易對外植體造成損傷,且操作過程污染率較高。若能以種子直接誘導愈傷,不僅能縮短獲得外植體的時間,且種皮能保護種子從而減少在消毒過程中的損傷,提高出愈率。然而較之小麥、玉米和水稻等作物,煙草利用種子誘導愈傷組織的技術體系鮮有報道。

愈傷組織的誘導除了受外植體的影響,還與培養(yǎng)基的類型和外源激素成分、比例等因素有關[5]。在培養(yǎng)植物愈傷組織的過程中,激素發(fā)揮著重要的作用。以往研究中,愈傷組織誘導多以MS為基礎培養(yǎng)基,再施加5種常用植物激素作為誘導劑,包括生長素類(auxins)的2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-dichlorophe noxyacetic acid,2,4-D)、萘乙酸(1-naphthaleneacetic acid,NAA)和3-吲哚丁酸(indole-3-butyric acid,IBA),以及細胞分裂素類(cytokinins)的6-芐氨基嘌呤(6-benzylami nopurine,6-BA)和激動素(kinetin,KT)[6-9]。不同外植體誘導愈傷的最佳激素配比不盡相同[8-9]。換言之,在培養(yǎng)基中引入不同比例的生長素和細胞分裂素,會影響誘導愈傷組織的成功率。

本研究以煙草種子為研究對象,探究不同濃度的2,4-D和6-BA激素配比對煙草愈傷組織形成的影響,并對誘導出的愈傷組織進行形態(tài)學和組織細胞學的比較觀察,旨在為利用煙草種子直接誘導愈傷組織提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試的煙草種子為普通煙草(NicotianatabacumL.cv NC89)。新鮮收取或儲藏期不超過3個月的種子用于研究。

1.2 方法

1.2.1 誘導培養(yǎng)基

以MS+3%蔗糖+0.8%瓊脂固體培養(yǎng)基作為基礎培養(yǎng)基,添加不同濃度2,4-D和6-BA兩種激素,用NaOH將培養(yǎng)基pH值調整到5.8～6.0。將配好的培養(yǎng)基高壓滅菌(0.15 MPa、121 ℃條件下滅菌20 min)后備用。

本實驗在前期研究中發(fā)現(xiàn),高濃度(>2.0 mg/L)的2,4-D和6-BA不利于種子誘導出愈傷組織,為進一步明確兩者對種子誘導愈傷的最佳條件,本研究在前期實驗的基礎上,設計了6個水平的2,4-D和6個水平的6-BA,共12種組合進行比較與分析。具體激素濃度處理方案如表1所示。

表1 不同誘導培養(yǎng)基中的激素組合

1.2.2 芽分化培養(yǎng)基

以MS+3%蔗糖+0.8%瓊脂固體培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基,添加0.3 mg/L NAA+2.35 mg/L 6-BA,用NaOH將培養(yǎng)基pH值調整到5.8～6.0。將配好的培養(yǎng)基高壓滅菌(0.15 MPa、121 ℃條件下滅菌20 min)后備用。

1.2.3 煙草種子的預處理

取適量煙草種子,用蒸餾水浸泡24 h后,用84消毒液消毒7～8 min,然后用無菌水清洗5次。將消毒后的煙草種子均勻接種在不同激素配比的愈傷組織誘導培養(yǎng)基上,轉入16 h光照[60～100 μmol/(m2·s)]/8 h黑暗,(25±1) ℃條件下進行愈傷組織誘導培養(yǎng)。

1.2.4 煙草愈傷組織觀察、統(tǒng)計與分析

實時記錄煙草愈傷組織誘導情況,并在體式顯微鏡(SteREO Discovery.V20,卡爾蔡司管理有限公司)下觀察愈傷組織生長狀況,比較不同激素配比誘導煙草種子愈傷組織情況的差異。

統(tǒng)計不同培養(yǎng)基上煙草種子誘導形成愈傷組織的數(shù)量,并計算誘導率;誘導率=(產生愈傷組織的種子數(shù)/接種的種子數(shù))×100%。本實驗中,以愈傷組織直徑≥1 mm定義為誘導出了愈傷組織。

1.2.5 煙草愈傷組織切片觀察

取誘導出的煙草愈傷組織,經FAA固定后,依次進行脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、粘片、展片、脫蠟、番紅固綠染色和封片操作后制成石蠟切片,并使用光學顯微鏡采集圖像信息[10-11]。

2 結果與分析

2.1 不同激素配比對煙草種子出愈速率的影響

為探究不同激素配比對煙草種子愈傷組織誘導的影響,采用不同濃度的2,4-D和6-BA進行組合處理煙草種子。結果表明:不同激素配比均能誘導出煙草種子愈傷組織,但出愈速度及愈傷形態(tài)存在明顯差異。種子在不含激素的培養(yǎng)基中正常生長,葉片和根系長勢好(對照組材料);相比之下,在僅含有1.0 mg/L 2,4-D的培養(yǎng)基中,種子萌發(fā)后的幼苗整體呈水漬狀,愈傷組織小且質量差(圖1)。在僅含有1.0 mg/L 6-BA的培養(yǎng)基中,種子萌發(fā)后未快速進入愈傷組織生長狀態(tài),而是呈現(xiàn)出較為明顯的根系發(fā)育,雖然其生長比對照組緩慢(圖1)。值得注意的是,種子在1.0 mg/L 2,4-D+(0.5～2.0)mg/L 6-BA激素配比條件下未見根系的發(fā)育,而胚軸基部逐漸分化出愈傷組織(圖1)。同樣,種子在1.0 mg/L 6-BA+(0.5～2.0)mg/L 2,4-D激素配比培養(yǎng)條件下也能逐漸培養(yǎng)出愈傷組織(圖1)。

空白對照(CK)及不同激素配比處理7 d(a)和14 d(b)愈傷組織生長狀態(tài),濃度(mg/L)。

統(tǒng)計愈傷組織出愈速率發(fā)現(xiàn),雖然培養(yǎng)兩周后2,4-D和6-BA組合均能誘導煙草種子長出愈傷,且出愈率為100%,但在不同2,4-D和6-BA濃度配比培養(yǎng)基上長出愈傷的速度和大小不同。煙草種子在1.0 mg/L 2,4-D的培養(yǎng)基中,搭配0.5～2.0 mg/L 6-BA可較快誘導出愈傷組織(表2);當用1.0 mg/L 2,4-D搭配0.1 mg/L 6-BA培養(yǎng)時,種子出愈速率較慢。相比之下,煙草種子在1.0 mg/L 6-BA的培養(yǎng)基中,搭配0.1～2.0 mg/L 2,4-D誘導愈傷組織能力較差,在培養(yǎng)的前7 d出愈率低于40%(表2);盡管如此,1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L 2,4-D在10 d以后出愈率明顯提升,愈傷大小和質量也較好。

表2 不同激素組合對出愈率的影響

2.2 不同激素配比對愈傷組織生長的影響

進一步比較分析不同激素配比對誘導出的愈傷組織后期生長的影響,將獲得的愈傷組織繼續(xù)培養(yǎng)至21 d后,通過愈傷組織的致密性、顏色、直徑和鮮重綜合評估愈傷組織的質量。結果表明,在不同激素配比的誘導培養(yǎng)基中愈傷組織質量存在顯著差異。在僅含有1.0 mg/L 2,4-D的培養(yǎng)基中,幼苗下胚軸及根部仍保持著明顯的玻璃化現(xiàn)象,其膨大的下胚軸及根部呈透明水浸狀,愈傷組織生長最慢,直徑和鮮重在所有處理組中最小,最終無法呈現(xiàn)出良好的愈傷組織(圖2,表3);在僅含有1.0 mg/L 6-BA的培養(yǎng)基中,幼苗發(fā)育有短且粗壯的根系,根部周圍產生少量的白色松散狀愈傷組織,誘導出的愈傷組織體積小,質量不佳(圖2)。當培養(yǎng)基中含有1.0 mg/L 2,4-D搭配0.5～1.0 mg/L 6-BA時,誘導出的愈傷組織長勢較好,這些愈傷組織的輪廓層次較清晰,呈淡綠色半透明堆塊狀,在體積和質量上與僅使用2,4-D激素誘導的愈傷相比都有明顯優(yōu)勢(圖2)。相比之下,1.0 mg/L 6-BA搭配0.5～2.0 mg/L 2,4-D處理條件下,愈傷組織塊也進一步膨大,但較為松散,尤其是2,4-D濃度高于1.5 mg/L時(圖2)。

空白對照(CK)及愈傷組織培養(yǎng)至21 d后的顯微觀察;隨機取3株材料用體式顯微鏡觀察并拍照;濃度(mg/L)。圖中標尺長度為2 mm。

表3 不同激素組合誘導愈傷組織的比較分析

總體來看,當培養(yǎng)基中含1.0 mg/L 2,4-D時,隨著6-BA的濃度減小愈傷組織的玻璃化程度會增加;當培養(yǎng)基中含有1.0 mg/L 6-BA,隨著2,4-D濃度的增加愈傷組織越松散(圖2,表3)。其中,1.0 mg/L 2,4-D+1.0 mg/L 6-BA組合誘導出的愈傷組織淡綠色,堆塊狀,體積較大;0.1 mg/L 2,4-D+1.0 mg/L 6-BA組合誘導出的愈傷組織淡綠色,較致密。綜合分析,1.0 mg/L 2,4-D+1.0 mg/L 6-BA和0.1 mg/L 2,4-D+1.0 mg/L 6-BA這兩種激素配比是誘導煙草愈傷組織的最佳組合。

2.3 胚性愈傷組織的誘導及不定芽的分化

為進一步分析獲得的愈傷組織是否具有可誘導分化能力,移取培養(yǎng)30 d的愈傷組織到芽分化培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。結果表明,分化培養(yǎng)7 d后,取自0.1 mg/L 2,4-D+1.0 mg/L 6-BA培養(yǎng)基中生長的愈傷組織開始分化出不定芽[圖3(a)]。相比之下,取自1.0 mg/L 2,4-D+1.0 mg/L 6-BA培養(yǎng)基中生長的愈傷組織未分化出芽,但愈傷組織的體積持續(xù)增大[圖3(b)]。將這兩種愈傷組織進行切片觀察發(fā)現(xiàn),前者具有分生細胞團結構,其細胞體積較小,排列規(guī)整緊密且邊界明顯,具有旺盛的細胞分裂能力,屬于胚性細胞[圖3(c)];后者細胞的排列不規(guī)則,細胞核較小,屬于非胚性細胞[圖3(d)和(e)]。結果表明,0.1 mg/L 2,4-D+1.0 mg/L 6-BA的激素配比可用于誘導致密型胚性愈傷組織,適合用于再分化等實驗。1.0 mg/L 2,4-D+1.0 mg/L 6-BA的激素配比可用于誘導非胚性愈傷組織,這種愈傷組織可長期保持旺盛的生長。

3 討論與結論

外植體的選擇及愈傷誘導能力是影響煙草基因工程進展和種質資源創(chuàng)新的重要因素。雖然離體葉片作為外植體誘導煙草愈傷組織的技術已較為成熟,但仍存在誘導率低、前期準備周期長等局限性。以往的研究表明,外植體離合子胚階段越遠,就需要越多的細胞重編程過程形成胚性愈傷;合子胚中的細胞很容易發(fā)生體細胞胚胎發(fā)生,也具有較強的分裂能力,是誘導愈傷組織較合適的外植體材料[5,12-13]。考慮到成熟種子含有合子胚,本實驗以成熟煙草種子作為外植體材料,探索并建立了直接利用種子誘導出愈傷組織的體系,尤其是能分化出胚性愈傷組織的誘導方法。

基于本研究,在MS基礎培養(yǎng)基中加入一定濃度范圍(0.1～2.0 mg/L)的2,4-D和6-BA可促進煙草種子向愈傷組織生長,但誘導出的愈傷組織大小和質量差異明顯。相比之下,1.0 mg/L 2,4-D+1.0 mg/L 6-BA的組合條件最適合煙草種子誘導松散的非胚性愈傷組織,0.1 mg/L 2,4-D+1.0 mg/L 6-BA的組合條件下最適合煙草種子誘導致密的胚性愈傷組織。本研究結果與利用煙草葉片等外植體在誘導愈傷組織時所適用的激素濃度存在明顯差異。以往研究顯示,煙草葉片誘導愈傷時采用的2,4-D激素濃度為1.0～2.0 mg/L[9,14];而關于6-BA的激素濃度選擇,董行健等[15]采用0.20 mg/L 6-BA,而岳彩鵬等[16]采用0.5 mg/L 6-BA誘導煙草葉片愈傷組織。這些濃度對本研究中種子誘導愈傷也適用,但不是最佳的濃度比例,表明同一材料不同組織部位愈傷組織的誘導受激素比例的差異調控。

植物激素對體外植物組織培養(yǎng)有重要的影響,其中,生長素和細胞分裂素一直被認為是誘導外植體生成愈傷組織的關鍵激素,前者主要通過誘導體細胞獲得干細胞特性形成愈傷組織,后者主要刺激愈傷組織再分化形成離體苗[17-19]。本實驗采用的生長素和細胞分裂素分別是2,4-D和6-BA,兩者均是組織培養(yǎng)中最常用的激素,對啟動植物細胞脫分化過程十分重要[6,19]。本研究發(fā)現(xiàn)僅使用2,4-D或6-BA處理煙草種子時,誘導生成的愈傷組織呈水浸狀透明色,無法發(fā)育成質量良好的愈傷塊。當在培養(yǎng)基中同時添加2,4-D和6-BA后才能誘導出質量較好的愈傷組織,這表明兩種激素在愈傷組織的誘導過程中存在協(xié)調作用[6,17,20]。盡管如此,不同外植體愈傷誘導的最佳激素配比不盡相同,這其中的生化、分子機理還有待進一步深入研究。