食品安全菌生產蔗糖異構酶的研究進展

陳慧玲,沈浩天,姜 晨,李憲臻,郭小宇

(大連工業(yè)大學 生物工程學院 微生物資源與催化實驗室,大連 116033)

蔗糖作為一種易于吸收的營養(yǎng)素,能夠為有機體快速提供能量,但過量攝入蔗糖容易引起肥胖及糖尿病等健康問題。因此,蔗糖的健康替代品——異麥芽酮糖引起了研究者的關注。與蔗糖相比,異麥芽酮糖具有耐酸性高、吸濕性低、非致齲齒性和安全性高,在血液中分解緩慢,不刺激胰島素分泌,避免脂肪過度積累等優(yōu)點[1]。異麥芽酮糖在自然界中含量低,且難以使用化學方法合成,主要利用微生物轉化法及酶轉化法生產。但微生物轉化法存在分離提取較困難、生產強度弱等缺點,工業(yè)上一般采用酶轉化法生產異麥芽酮糖[2]。酶轉化法的關鍵是蔗糖異構酶(SIase),該酶亦稱異麥芽糖合酶、蔗糖α-葡萄糖基轉移酶和海藻糖合酶。蔗糖異構酶主要通過微生物發(fā)酵獲得,如非食品安全級菌株大腸桿菌(Escherichiacoli)、食品安全級菌株枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)、乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)等。與非食品安全級菌株相比,食品安全級菌株不存在熱原和內毒素等安全問題,其表達的酶制劑、抗體等可直接用于食品藥物,所以利用食品安全級菌株進行蔗糖異構酶的異源表達備受關注[3]。本文總結了近十年的文獻報道和最新進展,系統(tǒng)闡述了蔗糖異構酶的來源、結構、催化機制和在食品安全菌株中的異源表達進展。

1 蔗糖異構酶概述

1.1 蔗糖異構酶的來源微生物及性質

蔗糖異構酶來源菌株的篩選及分離工作始于20世紀50年代,Ralf等[4]從甜菜廠排放的廢水中第一次篩選并分離出可以產生蔗糖異構酶的紅色精朊桿菌(Protaminobacterrubrum)。經過60多年的研究,已經分離獲得多種能夠合成蔗糖異構酶的微生物[4],如分散泛菌(Pantoeadispersa)、紅色精朊桿菌(Protaminobacterrubrum)、腸桿菌(Enterobactersp.)、大黃歐文氏菌(Erwiniarhapontici)、嗜中酸假單胞菌(Pseudomonasmesoacidophila)、普城沙雷氏桿菌(Serratiaplymuthica)、克雷伯氏桿菌(Klebsiellapneumoniae)和放射性土壤桿菌(Agrocbacteriumradiobacter)。將這些生產蔗糖異構酶的微生物按照其生產的蔗糖異構酶的催化主產物進行分類,主要分為兩類微生物[5]:(1)以催化主產物為異麥芽酮糖的異麥芽酮糖產生菌,主要以P.dispersaUQ68J、Klebsiellasp.LX3為代表,該類生產菌的異麥芽酮糖的轉化效率達到60%～90%;(2)以催化主產物為海藻酮糖的海藻酮糖產生菌,主要以P.mesoacidophilaMX-45、A.radiobacterNX-232為代表,該類生產菌的海藻酮糖的轉化效率達到80%～95%。

不同微生物來源的蔗糖異構酶都是單亞基分子,蛋白分子質量大部分集中在62～70 ku,其等電點大多小于7.0,屬于酸性蛋白質,S.plymuthicaATCC15928的蔗糖異構酶等電點偏高,為9.0。蔗糖異構酶反應的最適溫度在30～40 ℃,最適pH在5.0～6.0,如表1所示。蔗糖異構酶與蔗糖反應的溫度和pH對產物組成有一定的影響,P.dispersaUQ68J蔗糖異構酶與底物的反應溫度從20 ℃升到40 ℃時,異麥芽酮糖與其他產物比例從21∶1降低至8∶1;當pH 3.0時,K.planticolaUQ14S蔗糖異構酶無異構活性,但隨著pH值的增加,異麥芽酮糖成為主要產物。此外,不同來源的蔗糖異構酶的底物親和力存在較大差異,E.rhaponticiNX-5的Km達到257 mmol/L,而P.dispersaUQ68J的Km僅為40 mmol/L。

表1 不同來源的蔗糖異構酶的相關性質[2]

1.2 蔗糖異構酶的結構

為探索不同蔗糖異構酶轉化蔗糖的主產物不同的原因,對多種蔗糖異構酶的晶體結構進行X射線衍射解析。經蔗糖異構酶三級結構的分析,發(fā)現(xiàn)各種轉化蔗糖形成不同主產物的蔗糖異構酶三級結構具有高度相似性,都是由N-結構域、C-結構域和亞結構域組成的單亞基分子,如圖1所示[2,6-9]。其中,N-結構域是一個(β/α)超二級結構,是蔗糖異構酶最重要的部分。在N-結構域中,Asp241、Glu295、Asp369、His145和His368(編號參照于1M53)這5個高度保守的氨基酸構成蔗糖異構酶的催化口袋,參與底物的催化[6-9],Glu295可以作為酸催化劑使蔗糖α1-β1糖苷鍵的氧質子化導致底物水解,Asp241親核攻擊異頭碳的氫原子形成葡萄糖基-酶中間體,Asp369與葡萄糖基的O2和O3形成氫鍵,His145和His368分別與O6、O2形成氫鍵[7]。在活性位點附近存在一個保守的序列,該序列與酶的特異性有關,在蔗糖異構化過程中影響產物的比例。主產物為異麥芽酮糖的蔗糖異構酶其保守的序列為RLDRD序列,而主產物為海藻酮糖的蔗糖異構酶的序列為RYDRA,與RLDRD相比存在兩個堿基的差異[8]。

(a)主產物為異麥芽酮糖的蔗糖異構酶三維結構;(b)主產物為海藻酮糖的蔗糖異構酶三維結構。

1.3 蔗糖異構酶的反應機理

進一步探索蔗糖異構酶轉化蔗糖的主產物不同的原因,研究了蔗糖異構酶生成異麥芽酮糖或海藻酮糖的機理。Véronèse等[10]從沙雷菌ATCC 15928中純化了蔗糖異構酶并提出了分子內重排的設想。Ravaud等[7]以來源于P.mesoacidophilaMX-45的蔗糖異構酶作為研究對象提出兩步雙置換機制。Véronèse等[11]基于動力學分析提出蔗糖異構酶作用原理為乒乓機制。對蔗糖異構酶活性位點反應機制預測為(1)蔗糖異構酶與蔗糖結合形成復合物;(2)酶活性位點的Glu的羧基離子作為酸催化劑,使蔗糖α1-βα1糖苷鍵的氧質子化;活性位點的Asp攻擊蔗糖的C1氫原子,使C1氫原子脫質子,形成葡萄糖基-酶中間體[7];(3)果糖基異構形成異麥芽酮糖或海藻酮糖[7,11];(4)蔗糖水解生成果糖和葡萄糖。催化過程如圖2所示。蔗糖異構酶催化機理的研究為后續(xù)蔗糖異構酶分子改造提供理論基礎。

圖2 蔗糖異構酶催化蔗糖的過程[11]

2 利用食品安全菌異源表達蔗糖異構酶的進展

目前已有大量關于利用野生菌發(fā)酵生產蔗糖異構酶的報道,但存在周期長、發(fā)酵液成分復雜、分離純化復雜等缺點,無法實現(xiàn)工業(yè)化生產[1]。因此,利用工程菌異源表達蔗糖異構酶轉化蔗糖生產異麥芽酮糖是工業(yè)生產異麥芽酮糖的主流。

2.1 食品安全菌株概述

重組微生物在工業(yè)領域主要被用作表達宿主來生產蛋白質。用于食品和醫(yī)療領域的蛋白質因其特殊性,在安全方面具有更高的要求,如不能包含或產生毒素、熱原和過敏源物質等[12],因而需要采用食品級微生物進行表達使其符合食品安全或醫(yī)藥安全標準。被一般公認安全(Generally Recognized As Safe,GRAS)的微生物主要有真菌中的酵母菌、細菌中的枯草芽孢桿菌和乳酸菌等。

2.1.1 酵母表達系統(tǒng)

酵母是基因工程常用的底盤細胞,由于遺傳操作簡單、培養(yǎng)成本低等優(yōu)點,被廣泛用于各種小分子和大分子化合物的生產[13]。目前常用的酵母主要為畢赤酵母(Pichiapastoris)、解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)等。

畢赤酵母廣泛應用于食品藥品生產。畢赤酵母具有強啟動子AOX(醇氧化酶基因),可用甲醇嚴格調控異源表達的水平;發(fā)酵培養(yǎng)中不含蛋白,分離純化簡單;外源基因能以高拷貝數(shù)整合到畢赤酵母基因組中,結構穩(wěn)定不易丟失[14]等優(yōu)點。目前,已有上千種蛋白在畢赤酵母系統(tǒng)中得到成功表達,如黃原膠內切酶[15]。

解脂耶氏酵母是非常規(guī)半子囊酵母,被認為是非致病性的,因其對pH、高鹽濃度和有機化合物有高耐受性;可以利用廉價碳源生長;有高效表達外源蛋白的能力,表達的外源蛋白不會被自身的蛋白酶降解;蛋白表達糖基化程度低等優(yōu)點[16],多種蛋白已成功在該系統(tǒng)中異源表達,如葡萄糖氧化酶[17]。

釀酒酵母由于遺傳背景清楚、遺傳操作簡單;可以進行蛋白翻譯后修飾;發(fā)酵工藝簡單,成本低廉;能將外源蛋白分泌到培養(yǎng)基中;不攜帶病毒,在蛋白生產方面極具優(yōu)勢,并被認為是用于生產食品和保健產品的安全菌株[13]。因此,釀酒酵母是目前工業(yè)領域應用較多的表達宿主,如細胞色素還原酶[18]等在釀酒酵母中實現(xiàn)高水平異源表達。

2.1.2 芽孢桿菌表達系統(tǒng)

枯草芽孢桿菌(B.subtilis)發(fā)酵歷史悠久,不產生毒素和致熱致敏原,故被歸為食品級微生物范疇[12]。枯草芽孢桿菌無密碼子偏好性,其蛋白分泌能力強且不易形成包涵體;本身擁有高效的信號肽和分子伴侶,可以將蛋白質分泌到培養(yǎng)基中,方便目的蛋白的分離和純化,可降低成本[19]。由于這些優(yōu)良特性,枯草芽孢桿菌表達系統(tǒng)已被構建用于各種蛋白的生產中,如淀粉酶[20]等。

橋石芽孢桿菌(Brevibacilluschoshinensis)作為食品與醫(yī)藥行業(yè)領域的商業(yè)食品安全菌株,發(fā)酵過程中無需純氧的補充,發(fā)酵成本低;蛋白表達量高、單位體積細胞產率高[21]。目前,橋石芽孢桿菌表達系統(tǒng)已經成功用于多種外源蛋白的表達,如磷脂酶D[22]等。

2.1.3 乳酸乳球菌表達系統(tǒng)

乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)作為全球公認安全的微生物,具有分泌蛋白能力強、表達產物純化簡單、非致病性等特點,是異源蛋白表達和分泌的理想宿主[23]。隨著基因工程的發(fā)展,乳酸乳球菌表達系統(tǒng)被進一步探索,通過多個誘導型和組成型啟動子成功構建乳酸乳球菌表達系統(tǒng)高效表達外源蛋白,如多銅氧化酶[24]。

2.2 利用食品安全菌異源表達蔗糖異構酶的研究進展

由于食品級表達系統(tǒng)存在巨大應用潛力,其已成為分子生物學研究熱點[12]。故蔗糖異構酶在食品安全級宿主中的異源表達,如畢赤酵母(Pichiasp.)、解脂耶氏酵母(Y.lipolytica)、枯草芽孢桿菌(B.subtilis)、橋石芽孢桿菌(B.choshinensis)和乳酸乳球菌(L.lactis),取得突破性進展。

2.2.1 酵母表達系統(tǒng)生產蔗糖異構酶

Cao等[25]將來自Klebsiellasp.LX3的蔗糖異構酶編碼基因PalI構建在畢赤酵母中,重組酶的酶活力為36.6 U/mL。羅科[26]將來源于紅色精朊桿菌的蔗糖異構酶進行突變獲得一個突變體PRSiQRY,將其構建到pPICZA載體,表達載體pPicZa-PRSi-QRY轉入畢赤酵母X33獲得重組菌株,蔗糖異構酶的胞外酶活力達到1 219 U/mL。宋蕾等[27]對Klebsiellasp.LX3的蔗糖異構酶編碼基因PalI進行密碼子優(yōu)化,將優(yōu)化后的PalI成功在解脂耶氏酵母中異源表達,酶活力達到916 U/mg。Zhang等[28]將P.dispersaUQ68J中編碼蔗糖異構酶的基因構建在解脂耶氏酵母中重組表達,酶活力最高為7.43 U/mL,異麥芽酮糖轉化效率高達97.8%。

2.2.2 芽孢桿菌表達系統(tǒng)生產蔗糖異構酶

Wu等[29]使用穿梭質粒pHA01,將來自E.rhaponticiNX-5的蔗糖異構酶首次在枯草芽孢桿菌WB800中過表達,全細胞酶活力達到5.2 U/mL。王兵兵[30]將來源于Klebsiellasp.LX3的蔗糖異構酶編碼基因PalI構建到pHT43質粒上并于B.subtilisWB800中表達,并通過定點誘變將459位Ser和452位Arg置換為Ala,導致50 ℃下蔗糖異構酶的半衰期增加11倍,顯著提高了熱穩(wěn)定性,并略微改善了異麥芽酮糖的產物比。劉軍彤[21]將來源于P.dispersaUQ68J的蔗糖異構酶基因成功在橋石芽孢桿菌中異源表達,胞外蔗糖異構酶酶活力達到138 U/mL。在此基礎上鄒亮[31]通過啟動子優(yōu)化獲得最優(yōu)啟動子Papr,其介導的重組菌BCpNapr-SI的胞外上清液酶活力最高,為85.1 U/mL。

2.2.3 乳酸乳球菌表達系統(tǒng)生產蔗糖異構酶

Park等[32]首次報道了來自Enterobactersp.FMB-1的蔗糖異構酶在乳酸乳球菌MG1363中的異源表達,通過使用自誘導啟動子(P170)和優(yōu)化的信號肽(SP310mut2),重組蔗糖異構酶成功地在乳酸乳球菌胞外分泌表達,異麥芽酮糖轉化率達到72%。乳酸乳球菌表達系統(tǒng)已成為生產蔗糖異構酶的新興系統(tǒng),但其遺傳背景尚不清楚,需要進一步探索。

2.3 利用食品安全菌株異源表達蔗糖異構酶存在的問題

目前,各種來源的蔗糖異構酶已成功在多種食品級安全菌株中實現(xiàn)異源表達,但工業(yè)大規(guī)模生產上仍存在一些影響因素:(1)游離的蔗糖異構酶穩(wěn)定性差、易被降解和污染、重復使用率低、發(fā)酵培養(yǎng)基中成分復雜、背景蛋白多、分離純化繁瑣復雜,導致工業(yè)生產成本增加,并且胞內的蔗糖異構酶需要離心破碎,步驟多,損耗大,因而后續(xù)可以研究蔗糖異構酶的固定化;(2)現(xiàn)有的食品級重組菌株蔗糖異構酶的表達水平依舊達不到工業(yè)大規(guī)模生產的要求,導致大批量工業(yè)化生產價格過高,因而構建高效的食品級基因工程菌仍是蔗糖異構酶大規(guī)模生產的關鍵;(3)蔗糖異構酶與蔗糖反應生成異麥芽酮糖或海藻酮糖的同時還伴隨葡萄糖和果糖等副產物的生成,為了進一步提高蔗糖異構酶的轉化效率,需要分析關鍵區(qū)域對蔗糖異構酶催化性能的影響,提高底物轉化的特異性,通過分子生物學方法改造蔗糖異構酶編碼基因中的相關區(qū)域,提高其轉化效率。

3 提高食品安全菌中蔗糖異構酶表達的優(yōu)化策略

由于利用食品級安全菌株工業(yè)大規(guī)模生產蔗糖異構酶存在限制因素,因而提出多種優(yōu)化策略提高食品安全菌中蔗糖異構酶的表達水平,如將游離酶固定化、優(yōu)化啟動子和信號肽、優(yōu)化培養(yǎng)基和發(fā)酵條件。但由于食品級安全菌轉化效率低、篩選方法繁瑣、無法進行簡易的高通量篩選等因素,直接在食品級安全菌株中進行的蔗糖異構酶蛋白質工程還未涉及。

3.1 蔗糖異構酶在食品安全菌的固定化

近年來,蛋白質展示技術取得巨大進展。Lee等[33]使用錨定蛋白的糖基磷脂酰肌醇(GPI)錨定附著信號序列,將來自腸桿菌FMB-1的蔗糖異構酶成功展示在釀酒酵母EBY100的細胞表面,與游離酶相比,釀酒酵母EBY100細胞表面的蔗糖異構酶熱穩(wěn)定性顯著增強;Li等[34]將P.dispersa的蔗糖異構酶編碼基因,以細胞壁蛋白Pir1為錨蛋白,成功地在解脂耶氏酵母細胞表面表達,其異麥芽糖轉化率為93%,且重復使用12次后轉化效率仍能達到80%;吳琦等[35]將錨定蛋白Pir1與Klebsiellasp.LX3的蔗糖異構酶編碼基因融合,在解脂耶氏酵母細胞表面展示,酶活力達到4 694.6 U/g細胞干重。固定在細胞表面的蔗糖異構酶有較好的pH穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性,其二糖產物與單糖副產物的比例可達到91∶9;Zhang等[36]使用枯草芽孢桿菌的孢子外膜蛋白CotX作為錨定蛋白將來自E.rhaponticiNX-5的蔗糖異構酶顯示在B.subtilis168孢子上,被錨定的蔗糖異構酶具有較高的生物活性和穩(wěn)定性,對從農業(yè)殘留物中、未經處理的甜菜糖蜜和大豆粉經濟生產異麥芽酮糖,轉化率達到92%;Zheng等[37]利用糖基磷脂酰肌醇(GPI)-細胞壁蛋白(CWP)錨定信號序列構建P.dispersa蔗糖異構酶表面展示載體,并成功地在解脂耶氏酵母細胞表面展示,其酶活力達到2 910.3 U/g細胞干重。與游離的蔗糖異構酶相比,該酶有較好的熱穩(wěn)定性,且以低成本的甘蔗糖蜜為底物時,經過9批加工后,異麥芽糖的轉化率仍保持在85%。

3.2 啟動子和信號肽優(yōu)化

信號肽或啟動子優(yōu)化是提高酶表達或分泌的常用方法。Guo等[38]采用半合理方法篩選出13個候選信號肽,比較其對KsLX3-SIase分泌的影響,結果表明,信號肽WapA最有效地引導KsLX3-SIase分泌到培養(yǎng)基中,搖瓶培養(yǎng)顯示其酶活力為23.0 U/mL;鄒亮[31]對啟動子進行優(yōu)化,考察了組成型啟動子Papr、Pnpr、Pamy和誘導型啟動子Pxyl對蔗糖異構酶在B.choshinensis的轉錄水平,發(fā)現(xiàn)啟動子Papr調控的蔗糖異構酶的胞外酶活力最高,達到85.1 U/mL;Zhang等[39]又利用強組成型TEF啟動子,通過在解脂耶氏酵母中過度表達來自P.dispersionUQ68J的蔗糖異構酶,獲得了高水平的分泌蔗糖異構酶,其酶活力達到49.3 U/mL。

3.3 培養(yǎng)基和發(fā)酵條件優(yōu)化

除啟動子和信號肽優(yōu)化外,發(fā)酵培養(yǎng)基組成和發(fā)酵條件的優(yōu)化也是提高酶活性或表達水平的常用策略。培養(yǎng)基優(yōu)化的重點是碳源、氮源和無機鹽的組成和含量。劉軍彤[21]將改造過的蔗糖異構酶克隆至宿主B.brevis中,并對該培養(yǎng)基氮源進行優(yōu)化,當?shù)礊?.5 g/L的多聚蛋白胨和8.5 g/L的牛肉浸膏時,酶活力最高達138 U/mL,是優(yōu)化前TM培養(yǎng)基的2.7倍;張賀朋等[40]對培養(yǎng)基中的蔗糖含量進行優(yōu)化,當蔗糖含量為12%時,發(fā)酵液中蔗糖異構酶轉化蔗糖的二糖產物與單糖副產物的比值達到92∶1;宋蕾等[27]對重組解脂耶氏酵母培養(yǎng)基的碳源、氮源、無機鹽進行正交實驗分析,確定最優(yōu)條件為80 g/L果糖,2%含氮量的蛋白胨,0.5 mol/L NaCl,其酶活力達到251.96 U/mL,是優(yōu)化前的2.9倍。發(fā)酵條件如溶氧量、發(fā)酵溫度等也是影響蛋白表達以及催化產物組成的一大因素。劉軍彤[21]對發(fā)酵過程中的攪拌速度進行優(yōu)化,當轉速為400 r/min時,蔗糖異構酶的酶活力提高到190 U/mL;鄒亮[31]探究發(fā)酵溫度對重組菌B.choshinensis/pNCMO2-SI在3 L發(fā)酵罐中的菌體生長濃度與酶活水平的影響時發(fā)現(xiàn),30 ℃是最優(yōu)溫度,酶活力最高達到275 U/mL。

4 展望

目前,異麥芽酮糖作為一種安全的蔗糖替代品的市場需求迅速增長,蔗糖生物轉化生產異麥芽糖已取得重大進展。然而,在工業(yè)生產中仍然存在一些問題,如食品安全級菌株的分泌水平低、熱穩(wěn)定性弱、蔗糖異構酶的應用性能差。為了解決上述問題,可以對表達宿主菌株和蔗糖異構酶編碼基因分別進行改造。在表達宿主菌株改造方面:(1)敲除宿主細胞相關蛋白基因,防止外源蛋白被降解;(2)改造宿主細胞的細胞膜和細胞壁,提高外源蛋白轉運效率;(3)對宿主細胞進行碳氮代謝調控優(yōu)化、基因組精簡等新型策略;(4)提高基因轉錄水平和穩(wěn)定性。在蔗糖異構酶編碼基因改造方面:(1)提高外源蛋白折疊效率;(2)利用蛋白質工程,對蔗糖異構酶進行定向進化或對編碼基因如活性位點附近氨基酸殘基、底物結合相關氨基酸殘基進行定點突變,提高蔗糖異構酶的穩(wěn)定性、酶活力、特異性等;(3)蔗糖異構酶的產物特異性不僅是保守序列RLDRD單獨決定的,還存在多個調控區(qū)域的協(xié)同作用[7],需要進一步探索和修飾蔗糖異構酶的關鍵位點,提高蔗糖異構酶在工業(yè)生產中的應用性能。