姜黃素抑制脊髓組蛋白甲基化在大鼠急性疼痛中的作用

王存斌

（天津市北辰醫(yī)院麻醉科，天津 300400）

術后急性疼痛（Acute post surgery pain，APSP）主要是患者受到外源性手術刺激后所產(chǎn)生的一系列生理、心理等應激反應。APSP一般發(fā)生在術后的24～72 h之內，會增加患者機體疼痛負擔，不利于機體的康復[1]。組蛋白是真核生物染色體的基本結構單位，組蛋白包括H1、H2A、H2B、H3、H4五種類型，組蛋白H3K9甲基化是指組蛋白H3第九位賴氨酸殘基在組蛋白甲基轉移酶的催化下發(fā)生了甲基化修飾[2]。研究發(fā)現(xiàn)HAT抑制劑ACA可降低小鼠切口痛模型脊髓組蛋白H3K9的表達[3]。神經(jīng)病理性疼痛大鼠組蛋白H3K9甲基化表達增加[4]，姜黃素對神經(jīng)系統(tǒng)的生理功能和病理生理過程有諸多影響，可減輕神經(jīng)炎癥反應，抑制慢性疼痛的外周或中樞敏化[5]，還可減輕大鼠的手術后疼痛，促進手術創(chuàng)傷的恢復[6]，但具體機制尚不明確。本研究擬評價姜黃素對大鼠急性切口痛及脊髓組蛋白甲基化的調節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

健康成年雄性清潔級Wistar大鼠，體重200～250 g，周齡6～8 w，由中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心提供，動物許可證號：SCXK（軍）-2012-0004。采用隨機數(shù)字表法將成功鞘內置管的48只健康雄性Wistar大鼠分成4組（n=12）：對照組（D組），疼痛模型組（I組），姜黃素組（C組），二甲基亞砜組（DMSO組）

1.2 方法

1.2.1 鞘內置管[7]

Wistar大鼠經(jīng)腹腔注射10%戊巴比妥3 mL·kg-1麻醉后，取俯臥位于后正中L5-6間隙作長約3 cm的縱行切口，逐層分離筋膜、肌肉，切斷L5-6的棘間韌帶，充分暴露L5-6間隙。大鼠脊柱向前彎曲，提起L5椎板，針頭刺破黃韌帶和硬膜，經(jīng)破口置入PE0503導管，向上置入2 cm，有腦脊液流出，大鼠出現(xiàn)甩尾反射即為置管成功。導管另一端經(jīng)皮下隧道引出于頭頸部，外露3 cm固定，火燒密封導管頭部，避免腦脊液流出。

1.2.2 切口痛大鼠模型[8]

參照Brennan[8]等方法制備切口痛大鼠模型。大鼠在異氟醚麻醉后，取俯臥位，固定大鼠，取其左后足趾部，消毒、鋪巾，從后跟0.5 cm處向前做一長約1 cm的縱行切口，動作盡量輕柔保持肌腱及神經(jīng)不被離斷，輕壓傷口止血后撒上抗生素，縫合切口。術畢大鼠均采用單籠飼養(yǎng)，注意保溫，觀察大鼠情況。

1.2.3 分組給藥

D組不做任何操作，行為學測試前30 min通過鞘內置管單次注射生理鹽水10 μL；I組切口痛建模前30 min通過鞘內置管單次注射生理鹽水10 μL ；C組切口痛建模前30 min通過鞘內置管單次注射姜黃素（批號：31027-02-3，Alexis公司，美國）10 μL（50 μg·μL-1）；DMSO組切口痛建模前30 min通過鞘內置管單次注射10%二甲基亞砜（批號：58-59-4，上海免基實業(yè)有限公司）10 μL。

1.3 大鼠的機械性痛閾（Mechanical paw withdrawal threshold，MWT）及熱痛閾（Thermal paw withdrawal latency，TWL）

分別于建模前24 h（T0），切口痛建模后1 h（T1）、3 h（T2）、6 h（T3）時，測定大鼠的機械性痛閾（MWT）和熱痛閾（TWL）。將大鼠放入固定器內，左足趾放置于YSL-3E型電子壓痛儀（濟南益延科技發(fā)展有限公司）的尖形壓頭下施壓，當大鼠出現(xiàn)嘶鳴或掙扎時停止施壓，記錄壓力，測定3次，間隔15 min，取平均值即為MWT。將大鼠放在YSL-6B型智能熱板儀（濟南益延科技發(fā)展有限公司）的玻璃罩內，溫度設定為55℃，記錄大鼠左足出現(xiàn)舔足或逃避動作的時間，測定3次，間隔15 min，取平均值即為TWL。為避免大鼠燙傷，TWL的測定時間不超過30 s。

1.4 免疫組化法檢測甲基化H3K9表達水平

分別于T1、T3時點疼痛行為學測量后，取6只大鼠，在異氟醚麻醉下取出其L4-5節(jié)段脊髓，采用免疫組化法檢測甲基化H3K9表達水平。脊髓組織放入4%甲醛中固定24 h，常規(guī)脫水、透明、包埋，切片，脫蠟，山羊血清封閉，滴加甲基化H3K9抗體（Cell Signaling Technology公司，美國），4℃孵育24 h；滴加辣根過氧化物酶標記的兔抗鼠IgG二抗（北京中杉金橋生物公司），37℃孵育30 min；DAB顯色，蘇木精復染細胞核，光鏡下進行觀察，細胞核呈棕黃色為陽性細胞，應用Image-Pro Plus圖像分析系統(tǒng)測定光密度值，反映甲基化H3K9表達水平。

1.5 統(tǒng)計學處理

采用SPSS17.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±SD）表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 一般行為學的改變

建模前各組大鼠活動狀態(tài)良好，建模后各組大鼠狀態(tài)良好，傷口未裂開、未感染。但I組和DMSO組活動顯著減少。

2.2 四組大鼠整體MWT的比較

與D組比較，C組、I組和DMSO組T0時點比較無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），T1-3時點MWT降低（P＜0.05）；與I組比較，T1-3時點DMSO組MWT指標無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），T1-3時點C組MWT升高（P＜0.05），見表1。

表1 四組大鼠各時點MWT整體比較（±SD，n=12）

表1 四組大鼠各時點MWT整體比較（±SD，n=12）

注：與D組比較，aP＜0.05；與I組比較，bP＜0.05。

MWT(pa)組別 T0 T1 T2 T3 D組 201.8±5.37 203.8±3.36 203.9±3.31 204.3±3.24 I組 203.2±4.17 32.92±1.37 a 31.73±1.71 a 31.93±2.29 a C組 202.5±3.88 52.84±2.90 a b 57.12±2.81 a b 54.30±2.19 a b DMSO組 202.6±6.63 32.38±1.67 a 32.07±1.80 a 32.37±2.71 a

2.3 四組大鼠整體TWL的比較

與D組比較，C組、I組和DMSO組T0時點比較無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），T1-3時點TWL縮短（P＜0.05）；與I組比較，T1-3時點DMSO組MWL指標無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），T1-3時點C組TWL延長（P＜0.05），見表2。

表2 四組大鼠各時點TWL整體比較（±SD，n=12）

表2 四組大鼠各時點TWL整體比較（±SD，n=12）

注：與D組比較，aP＜0.05；與I組比較，bP＜0.05。

TWL(s)組別 T0 T1 T2 T3 D組 5.42±0.305 5.335±0.204 5.258±0.220 5.248±0.176 I組 5.341±0.243 2.032±0.154 a 2.008±0.099 a 2.067±0.096 a C組 5.276±0.270 3.095±0.133 a b 3.027±0.118 a b 3.142±0.109 a b DMSO組 5.376±0.195 2.064±0.141 a 2.088±0.146 a 2.087±0.125 a

2.4 病理學的變化

各組間比較大鼠脊髓均無炎性細胞的浸潤，脊髓細胞未發(fā)現(xiàn)水腫、壞死，組織細胞機構與形態(tài)正常，見圖1。

2.5 組蛋白H3K9甲基化表達的變化

與D組比較，I組、C組和DMSO組T1和T3時點脊髓甲基化H3K9表達上調（P＜0.05）；與I組比較，C組T1和T3時點脊髓甲基化H3K9表達下調（P＜0.05），DMSO組指標無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），見表3，圖2。

表3 組蛋白H3K9甲基化表達的比較（±SD，n=6）

表3 組蛋白H3K9甲基化表達的比較（±SD，n=6）

注：與D組比較，aP＜0.05；與I組比較，bP＜0.05。

組別 H3K9甲基化表達T1 T3 D組 0.304±0.013 0.303±0.012 I組 0.649±0.025a 0.652±0.024a C組 0.406±0.019ab 0.406±0.014ab DMSO組 0.648±0.024 0.651±0.025

3 討論

姜黃素是姜科植物姜黃中最重要的有效成分，通過多種作用機制發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用，緩解不同類型的疼痛，改善患者預后[9,10]。關于姜黃素在鎮(zhèn)痛方面的研究主要以背根神經(jīng)節(jié)、脊髓背角、相關炎癥因子以及酶活性為主[11,12]，研究顯示大鼠模型對應的熱痛敏以及機械性痛敏明顯減輕，這種鎮(zhèn)痛作用與對脊髓被根神經(jīng)節(jié)中相關物質的抑制有關，如p-CREB、p-ERK以及c-fos等[13,14]。此外，脊髓背角以及脊髓被根神經(jīng)節(jié)中kBp65受到抑制以及CX3C含量的下降也是神經(jīng)病理性疼痛減輕的主要機制，這也是姜黃素用于神經(jīng)病理性疼痛的重要作用機理[15]。研究指出，通過鞘內注射姜黃素可以將脊髓TOLL樣受體4、白細胞介素-1β、腫瘤壞死因子α水平降低，而對應的脊髓IL-10含量水平則會明顯提升，通過這一作用機制減輕了大鼠模型對應的疼痛感，也就是說姜黃素在發(fā)揮鎮(zhèn)痛期間過程中與脊髓TOLL樣受體4信號通路以及促炎性因子的調節(jié)作用有關[16,17]。

神經(jīng)病理性疼痛作為一類慢性疼痛疾病，患者血清中的皮質醇濃度存在異常，采用姜黃素治療后可以降低血清中的皮質醇濃度，使其逐漸恢復到正常水平，并對背根神經(jīng)節(jié)、脊髓背角等11-β羥基固醇脫氫酶活性產(chǎn)生抑制，使得患者在臨床上疼痛程度降低[18]。在建立大鼠模型后，通過使用姜黃素進行治療，模型大鼠的痛敏改善明顯，這與脊髓背角神經(jīng)元細胞凋亡減少有著密切關系[19]。當前關于姜黃素在鎮(zhèn)痛方面的研究主要以背根神經(jīng)節(jié)、脊髓背角、相關炎癥因子以及酶活性為主，在不同作用機理方面也都進行了相關的研究，不過目前尚無達成共識，并且目前研究方向多以病理性疼痛為主，而對急性疼痛報道比較少。

本實驗中，與對照組比較，切口痛組、姜黃素組及DMSO組機械性痛及熱痛閾值均顯著下降，而與切口痛組和DMSO組比較，姜黃素組機械性痛及熱痛閾值有所上升，提示姜黃素對急性切口痛大鼠的急性痛有鎮(zhèn)痛作用；與對照組比較，切口痛組、姜黃素組及DMSO組組蛋白H3K9甲基化表達水平均顯著上升，而與切口痛組和DMSO組比較，姜黃素組組蛋白H3K9甲基化表達水平有所下降，提示姜黃素對急性切口痛大鼠的鎮(zhèn)痛作用可能與抑制組蛋白H3K9甲基化表達有關。

綜上所述，姜黃素可以減輕大鼠的急性疼痛，并降低了脊髓組蛋白甲基化水平的表達。