從腸道菌群動(dòng)態(tài)變化及炎癥因子探討溫病濕熱證實(shí)質(zhì)

紀(jì)麗純，羅子清，馬利娟，林樫，趙可偉，林興棟（. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 50405；. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，廣東 廣州 50405；. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，廣東 廣州 5078）

目前，在溫病濕熱證領(lǐng)域，用以“環(huán)境+飲食+生物因子”為原則的“病證結(jié)合”模式[1]進(jìn)行模型復(fù)制的方法現(xiàn)已較為成熟，但此復(fù)制方法忽略了現(xiàn)實(shí)中人體質(zhì)差異造成的濕熱偏重不同之象[2]。有研究者以“實(shí)則陽(yáng)明，虛則太陰”[2]為理論基礎(chǔ)，以中氣虛實(shí)的不同，結(jié)合復(fù)合模型復(fù)制方式，創(chuàng)立濕熱偏重不同的溫病濕熱證動(dòng)物模型[3-6]，但尚未形成客觀的模型評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，溫病濕熱證“濕”“熱”實(shí)質(zhì)還未明確。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明許多疾病的發(fā)生發(fā)展都伴隨著腸道菌群的變化[7]。腸道菌群作為一種非侵入性的生物標(biāo)志及具有前景性的藥物作用靶點(diǎn)，具有應(yīng)用于嶺南濕熱證的模型研究的潛力[8]。目前尚未見(jiàn)濕熱偏重的溫病濕熱證小鼠腸道菌群動(dòng)態(tài)演變的研究。故本研究擬通過(guò)研究模型復(fù)制及治療過(guò)程中腸道菌群動(dòng)態(tài)變化及炎癥因子探討溫病濕熱證實(shí)質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物BALB/c 小鼠，雄性，SPF 級(jí)，4 周齡，18～22 g，購(gòu)于珠海百試通生物科技有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（粵）2020-0051，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：44822700009801。該研究經(jīng)過(guò)廣州中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，倫理號(hào)：20220616003。

1.2 飼料高脂飼料由廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，組成為：普通飼料94.5%，豬油5%，膽固醇0.5%。普通飼料由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.3 病毒株、藥物及試劑

1.3.1 病毒株 流感病毒H1N1/PR8 株，廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心生物安全二級(jí)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.3.2 藥物及配制 飲片均購(gòu)于廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院。藥材第1遍加10倍體積的水，浸泡30 min，煎沸40 min；第2 遍加5 倍體積的水，煎沸30 min；合并2次濾液，減壓濃縮至目標(biāo)濃度，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。所有方劑藥物組成及用量參考全國(guó)中醫(yī)藥行業(yè)高等教育“十二五”規(guī)劃教材《方劑學(xué)》（2012年第3 版，李冀主編）。根據(jù)人與小鼠體表面積計(jì)算法，各方劑濃縮藥液濃度如下（以20 g小鼠灌胃體積0.2 mL計(jì)算），小承氣湯：酒大黃12 g、厚樸6 g、枳實(shí)9 g，濃度0.351 g·mL-1。附子理中湯：炮附子9 g、人參9 g、炮干姜9 g、白術(shù)9 g、炙甘草9 g，濃度為0.585 g·mL-1。三仁湯：杏仁15 g、滑石18 g、通草6 g、白蔻仁6 g、竹葉6 g、厚樸6 g、薏苡仁18 g、法半夏15 g，濃度為1.17 g·mL-1。白虎加蒼術(shù)湯：知母18 g、石膏50 g、蒼術(shù)9 g、粳米9 g、炙甘草6 g，濃度為1.196 g·mL-1。糞菌液配制：壓迫法收集對(duì)照組小鼠糞便，參照相關(guān)文獻(xiàn)研究[9-10]，制備后分裝放-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 試劑 4%多聚甲醛通用型組織固定液，美國(guó)Biosharp 公司，批號(hào)：22 202441；TRIzol，美國(guó)invitrogen 公司，批號(hào)： 368704；iTaq Universal SYBR Green Supermix，美國(guó)Bio-Rad公司，批號(hào)：64 477446；Ultrapure RNA Kit 超純RNA 提取試劑盒，江蘇康為世紀(jì)生物科技股份有限公司，批號(hào)：10522；HiScriptⅡQ RT SuperMix for qPCR，南京諾唯贊生物科技有限公司，批號(hào)：017E2221LA；AQP3 抗體（批號(hào)：73d8862）、AQP4 抗體（批號(hào)：21m7017），江蘇親科生物研究中心有限公司；小鼠IFN-γELISA檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：071504003109670715）、小鼠IL-4 ELISA檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：071504003202660715）、小鼠IL-1β ELISA檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：071504003204590715），上海江萊生物科技有限公司；引物，北京擎科生物技術(shù)有限公司廣州分公司；EDTA（PH8.0）抗原修復(fù)液、EDTA（PH9.0）抗原修復(fù)液、檸檬酸（PH6.0）抗原修復(fù)液、PBS 緩沖液、3%雙氧水、BSA、正常兔血清、蘇木素染液、蘇木素分化液、蘇木素返藍(lán)液、中性樹(shù)膠、組化試劑盒DAB顯色劑、HE染液，均為武漢賽維爾生物科技有限公司。氯化鈉、氯化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、無(wú)水乙醇、二甲苯、乙醚均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.4 儀器RXZ 智能型人工氣候箱，寧波江南儀器廠； AC24S1型ESCO-生物安全柜，新加坡藝思高科技有限公司；BCD-133EN 電冰箱，青島海爾股份有限公司；L530 型離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司； LF26-MESJ 分析天平，香港佳立國(guó)際有限公司；ETC811 基因擴(kuò)增儀，蘇州東勝興業(yè)科學(xué)儀器有限公司；CFX connect 熒光定量PCR 儀，美國(guó)Bio-Rad 公司；Elx800 酶標(biāo)儀，美國(guó)Bio-Tek 公司；YC-D205 型超聲波加濕器，北京亞都環(huán)?？萍加邢薰?；Centrifuge 5424R 型冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf 公司；IVC 獨(dú)立空氣換氣系統(tǒng)，馮氏實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)備有限公司；病理切片機(jī)，上海徠卡儀器有限公司；KD-P型組織攤片機(jī)，浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司；GT1001型組化筆，美國(guó)Gene tech公司；Nikon Eclipse E100 型顯微鏡，日本尼康公司；KF-SCI-005 型數(shù)字病理切片掃描儀，寧波江豐生物信息技術(shù)有限公司。

1.5 動(dòng)物分組及處理小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為：對(duì)照組（A）；病毒組（B）；濕重于熱組（C），包括：濕模組（C1）、濕治組（C2）、濕糞組（C3）；熱重于濕組（D），包括：熱模組（D1）、熱治組（D2）、熱糞組（D3）等8 組，每組12 只。A 組給予普通飼料，自由攝食及飲水。其余小鼠給予高脂飼料，置于人工氣候箱（溫度30.5～31.5 ℃，相對(duì)濕度85%～95%），每天10 h，自由飲水?dāng)z食，同時(shí)C 組灌服小承氣湯，D組灌服附子理中湯，其余小鼠灌服生理鹽水，每日1 次，每次0.2 mL，連續(xù)10 d。第11 天，在乙醚輕度麻醉下，A 組小鼠以生理鹽水滴鼻，其余小鼠用2LD 50 的H1N1/PR8 滴鼻感染[11-12]，每只0.05 mL。感染后不再放入氣候箱，連續(xù)觀察72 h。第14天開(kāi)始，C3、D3組灌服糞菌液；C2組灌服三仁湯，D2 組灌服白虎加蒼術(shù)湯，其余小鼠灌服生理鹽水，均每日1 次，持續(xù)4 d。從第1 天開(kāi)始觀察并記錄小鼠的精神狀態(tài)、活動(dòng)度、被毛情況、飲食量、體質(zhì)量、糞便情況等。每天按相關(guān)研究[13]的方法測(cè)量體溫，重復(fù)3次。實(shí)驗(yàn)第0、10、13、17天以壓迫法采集糞便后置于無(wú)酶EP 管中，于-80 ℃保存。第18 天摘眼球取血，頸椎脫臼處死，摘取肺組織和結(jié)腸組織（回盲部下1 cm 處），肉眼觀察肺部病變，拍照記錄。剪開(kāi)結(jié)腸，用預(yù)冷的生理鹽水清洗、吸干、分段，一段用多聚甲醛固定，其他組織放-80 ℃保存。

1.6 檢測(cè)指標(biāo)

1.6.1 qPCR 檢測(cè)肺病毒mRNA 約取肺組織20 mg，提取總mRNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA（37 ℃/15 min，85 ℃/5 s）。用SYBR Green 進(jìn)行擴(kuò)增，總體系為20 μL，40 個(gè)循環(huán)。以β-Actin 作為內(nèi)參，進(jìn)行測(cè)定（95 ℃/3 min；95 ℃/10 s；60 ℃/30 s；72 ℃/20 s）。引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.6.2 免疫組化法檢測(cè)AQP3、AQP4 結(jié)腸切片經(jīng)烘片、脫蠟、脫水及抗原修復(fù)處理檢測(cè)AQP3、AQP4，用Image-Pro Plus（IPP）6.0 軟件測(cè)定各組光密度（OD）值。

1.6.3 ELISA法檢測(cè)血清IL-1β、IFN-γ、IL-4含量用ELISA試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，具體操作步驟按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.6.4 腸道菌群16S rDNA測(cè)序 收集各組不同時(shí)間點(diǎn)糞便，委托廣東美格基因科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。按照說(shuō)明書(shū)提取菌群DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA 的完整性和純度，用NanoDropOne 檢測(cè)濃度和純度。選擇帶barcode 的引物（擴(kuò)增片段：16S rDNA V3V4 區(qū)，片段大小470 bp，338 F：5’-ACTC CTACGGGAGGCAGCA-3’，R：5’-GGACTACHVGG GTWTCTAAT-3’）及PremixTaq（TaKaRa）進(jìn)行擴(kuò)增，純化后，采用高通量測(cè)序平臺(tái)Hiseq 或Miseq 進(jìn)行測(cè)序，將數(shù)據(jù)上傳至美格生物云平臺(tái)（http://cloud.magigene.com/）進(jìn)行分析。統(tǒng)計(jì)OTU中g(shù)enus（屬）分類水平序列信息，選取相對(duì)豐度在0.01%以上的分類群，以豐度前15 分類繪制相對(duì)豐度分布圖，并進(jìn)行beta多樣性分析、菌群物種組成及差異分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為計(jì)量資料，運(yùn)用SPSS 27.0和GraphPad Prism 9.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和作圖。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，當(dāng)組間差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí)，運(yùn)用Bonferroni 法進(jìn)行多重比較。數(shù)據(jù)若滿足方差齊性，采用單因素方差分析；若不滿足方差齊性，則采用非參數(shù)檢驗(yàn)（Kruskal-Wallis檢驗(yàn)）。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況觀察模型復(fù)制后，除對(duì)照組外其他小鼠均出現(xiàn)不同程度的弓背、閉眼、嗜睡懶動(dòng)、皮毛聳立、精神萎靡和飲食飲水量減少等現(xiàn)象，其中以濕模組最嚴(yán)重；濕重于熱組出現(xiàn)便溏，熱重于濕組出現(xiàn)便干結(jié)，部分小鼠有肛周污穢或脫肛現(xiàn)象。

2.2 體質(zhì)量和體溫變化情況見(jiàn)圖1。與對(duì)照組比較，各組小鼠體質(zhì)量先上升，在攻毒后開(kāi)始出現(xiàn)不同程度下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；各組小鼠體溫大多在36.0～37.0 ℃之間，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖1 各組小鼠體質(zhì)量和體溫變化情況Figure 1 Changes of body mass and temperature in mice

2.3 肺組織觀察及肺病毒mRNA 變化圖2 顯示，與對(duì)照組比較，感染后小鼠肺組織呈水腫樣腫脹，肺部變大，表面瘀斑瘀血。與病毒組比較，經(jīng)過(guò)復(fù)合因素處理的濕模組和熱模組瘀斑瘀血加重。

圖2 各組小鼠肺組織形態(tài)圖Figure 2 Histomorphological illustration of lung of mice

表2顯示，病毒組肺病毒mRNA相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組，濕模組高于熱模組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示病毒感染模型成功。不同證候?qū)Σ《緩?fù)制的影響有差異，與熱證比較，濕證明顯提升病毒的相對(duì)表達(dá)量（P＜0.05）。

表2 各組肺病毒mRNA 相對(duì)表達(dá)量（ ±s，n=3）Table 2 The relative mRNA expression of pulmonary virus（ ±s，n=3）

表2 各組肺病毒mRNA 相對(duì)表達(dá)量（ ±s，n=3）Table 2 The relative mRNA expression of pulmonary virus（ ±s，n=3）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與病毒組比較，#P＜0.05；與濕模組比較，▲P＜0.05

mRNA 相對(duì)表達(dá)量0.00±0.00 1.00±0.10*12.83±1.31*#2.01±0.25 0.55±0.04 0.40±0.04*#▲0.37±0.04 0.97±0.08組別對(duì)照組病毒組濕模組濕治組濕糞組熱模組熱治組熱糞組

2.4 結(jié)腸AQP3、AQP4 表達(dá)量表3、圖3顯示，與對(duì)照組比較，病毒組AQP3 和AQP4 表達(dá)增加，棕色區(qū)域較多，顏色較深；濕模組AQP3 表達(dá)減少而AQP4增加；熱模組AQP3和AQP4表達(dá)均增加；用方劑干預(yù)后，AQP3 表達(dá)濕治組增加而熱治組減少，AQP4 表達(dá)濕治組減少而熱治組增加。通過(guò)軟件分析，與對(duì)照組比較，各組OD值的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖3 免疫組化法檢測(cè)各組結(jié)腸AQP3、AQP4 的表達(dá)（×40）Figure 3 Detection of AQP3 and AQP4 expressions in colonic tissue by immunohistochemistry（×40）

表3 各組結(jié)腸中AQP3、AQP4 的OD 值（ ±s，n=3）Table 3 The OD value of AQP3 and AQP4 in each group of colon（ ±s，n=3）

表3 各組結(jié)腸中AQP3、AQP4 的OD 值（ ±s，n=3）Table 3 The OD value of AQP3 and AQP4 in each group of colon（ ±s，n=3）

組別對(duì)照組病毒組濕模組濕治組濕糞組熱模組熱治組熱糞組AQP3 170.92±3.45 175.84±8.88 168.63±3.95 170.76±1.40 174.26±5.38 175.23±3.39 163.16±5.15 175.47±3.56 AQP4 159.07±9.55 171.18±16.11 175.97±12.70 166.88±2.49 174.08±6.86 172.84±5.72 176.93±10.07 170.41±7.04

2.5 ELISA 法檢測(cè)血清中IL-1β、IFN-γ、IL-4 的含量見(jiàn)表4。與對(duì)照組比較，其他各組均出現(xiàn)不同程度IL-1β、IFN-γ升高及IL-4降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與濕模組比較，熱模組的IL-1β、IFN-γ 明顯升高，IL-4 明顯下降，這提示了“濕”“熱”模型炎癥程度不同，濕重于熱組炎癥程度高于熱重于濕組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。方劑干預(yù)對(duì)炎癥因子有反向調(diào)節(jié)作用。糞菌液干預(yù)后，濕糞組IL-1β、IFN-γ明顯下降，IL-4明顯升高，而熱糞組則相反，提示糞菌液對(duì)不同證候作用不一致，能明顯降低濕證炎癥程度。

表4 各組小鼠血清IL-1β、IFN-γ、IL-4 含量比較（ ±s，n=8）Table 4 The contents of IL-1β，IFN-γ and IL-4 in serum of mice（ ±s，n=8）

表4 各組小鼠血清IL-1β、IFN-γ、IL-4 含量比較（ ±s，n=8）Table 4 The contents of IL-1β，IFN-γ and IL-4 in serum of mice（ ±s，n=8）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與病毒組比較，#P＜0.05；與濕模組比較，▲P＜0.05；與熱模組比較，△P＜0.05

IFN-γ/IL-4 0.06 0.59 1.63 1.00 0.79 0.50 0.33 1.29組別對(duì)照組病毒組濕模組濕治組濕糞組熱模組熱治組熱糞組IL-1β/（pg·mL-1）10.80±1.53 60.57±8.64*86.54±7.25*#78.24±7.22 69.37±6.76▲56.70±2.75*▲51.32±3.31 81.62±1.22△IFN-γ/（pg·mL-1）5.50±0.38 13.39±1.97*19.25±1.68*#17.38±1.70 15.37±1.59▲12.50±0.63*▲11.25±0.77 18.14±1.22△IL-4/（pg·mL-1）95.70±8.68 22.60±1.88*11.79±0.93*#17.32±1.54▲19.50±1.99▲25.24±1.32*▲34.16±2.51△14.10±0.92△

2.6 腸道菌群分析

2.6.1 腸道菌群群落組成和相對(duì)豐度 對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)腸道菌群進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)在genus水平優(yōu)勢(shì)物種主要有Lactobacillus（乳酸菌）、Ruminococcaceae_UCG-014（瘤胃菌UCG-014）、Bacteroides（擬桿菌）、Alistipes（另枝菌）、Lachnospiraceae_NK4A136_group（毛螺菌科_NK4A136）、Candidatus_Saccharimonas、Roseburia、 Muribaculum、 Staphylococcus（葡萄球菌）、Ruminococcaceae_UCG-013（瘤胃菌UCG-013）、Ruminiclostridium_6（瘤胃梭菌-6）、Ruminococcus_1（瘤胃球菌_1）、Candidatus_Arthromitus（分節(jié)絲狀菌）、Corynebacterium_1（棒狀桿菌-1）、Lachnoclostridium（毛梭菌屬）、Jeotgalicoccus、Turicibacter（螺旋桿菌）、A2、Blautia、Ruminiclostridium（瘤胃梭菌）及其他菌種。

見(jiàn)圖4，在模型復(fù)制后，Muribaculum、Ruminococcus_1、Candidatus_Arthromitus 和Lactobacillus 相對(duì)豐度降低，而Staphylococcus、Corynebacterium_1和Jeotgalicoccus 增加；攻毒后第13 天，Candidatus_Saccharimonas 和Jeotgalicoccus 相對(duì)豐度降低，而Turicibacter和A2增加；到第17天，Blautia、Ruminococcus_1和Ruminiclostridium相對(duì)豐度增加。

圖4 不同階段各組腸道菌群群落相對(duì)豐度Figure 4 Relative abundance of intestinal microflora communities at different stages

2.6.2 腸道菌群beta多樣性分析 見(jiàn)圖5、圖6。通過(guò)聚類分析顯示在第0 天，各組菌群相對(duì)接近；從第10 天起組間菌群開(kāi)始產(chǎn)生差異，到第17 天，濕重于熱組和熱重于濕組間菌群存在差異。主坐標(biāo)分析（PCoA）顯示第0 天各組分布相對(duì)集中，組間差異較小，從第10 天開(kāi)始組間菌群產(chǎn)生差異，到第17 天，組間菌群差異增大；其次，各組間菌群多樣性產(chǎn)生變化，濕模組多樣性更大，與熱模組存在差異，這可能與模型復(fù)制過(guò)程中“濕”“熱”性質(zhì)、小鼠個(gè)體差異及干預(yù)效果有關(guān)。

圖5 各組群落聚類分析Figure 5 Cluster analysis of communities

圖6 各組主坐標(biāo)分析（PCoA）Figure 6 Principal coordinate analysis（PCoA）

2.6.3 物種差異分析 通過(guò)對(duì)豐度有顯著性差異的物種進(jìn)行LEfSe 分析（見(jiàn)圖7），結(jié)果表明，病毒組優(yōu)勢(shì)菌群是Pseudogracilibacillus；濕治組優(yōu)勢(shì)菌群是Actinobacteria、Corynebacterium_1和Corynebacteriaceae和Corynebacteriales；熱重于濕組優(yōu)勢(shì)菌群是Brevibacteriaceae、Brevibacterium 和Micrococcales、Micrococcaceae、Enteractinococcus和Bacillaceae。

圖7 各組LDA 值分布柱狀圖和物種進(jìn)化分支圖Figure 7 Histogram of LDA value distribution and cladogram of species evolution

通過(guò)對(duì)濕模組和熱模組的物種進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)（圖8），結(jié)果表明，濕模組和熱模組差異優(yōu)勢(shì)菌群是Lactobacillus、 Staphylococcus、 Ruminococcaceae_UCG-014和Bacteroides等。

圖8 各組“濕”“熱”組間差異顯著性檢驗(yàn)圖示Figure 8 Significance test for the differences between “damp” and “heat” groups

3 討論

溫病濕熱證是由內(nèi)、外濕相引，感染邪氣致病。有研究者[3-5]在感染前給實(shí)驗(yàn)動(dòng)物灌服寒涼中藥如小承氣湯、大黃煎液等，使其損傷脾胃功能造成中氣虛，建立濕重于熱模型；或灌服溫?zé)嵝再|(zhì)的中藥，如大黃附子湯[5]，建立熱重于濕模型。對(duì)于熱重于濕模型，因熱重于濕者多中氣實(shí)，病在陽(yáng)明胃經(jīng)，故選用溫補(bǔ)中焦脾胃陽(yáng)氣的藥物如附子理中湯可能更為適合[2]。吳鞠通在《溫病條辨》中提出濕重于熱者予三仁湯、宣清導(dǎo)濁湯等，熱重于濕者予白虎加蒼術(shù)湯、三石湯等，濕熱并重予杏仁滑石湯、中焦宣痹湯等[2]，使中醫(yī)藥辨證治療溫病濕熱證理論體系更加完善。因此，本研究選擇小承氣湯和附子理中湯作為模型復(fù)制中藥，以三仁湯、白虎加蒼術(shù)湯作為治療方劑。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究認(rèn)為，水在人體內(nèi)的運(yùn)輸和代謝是通過(guò)水通道蛋白來(lái)完成[14]，水通道蛋白的異常表達(dá)可能是濕病形成的客觀條件之一[15]，其中結(jié)腸AQP3、AQP4 與水液的重吸收關(guān)系密切[14]，表達(dá)降低，結(jié)腸對(duì)水的吸收減少，可能出現(xiàn)腹瀉[14，16]，而表達(dá)升高，可導(dǎo)致結(jié)腸對(duì)水的吸收增加而導(dǎo)致便秘[15，17-18]。萬(wàn)瀅聰[19]等發(fā)現(xiàn)AQP3 含量變化可視為“濕熱”之邪侵襲機(jī)體的特殊變化。濕熱證小鼠結(jié)腸AQP3表達(dá)量的改變可能與溫病濕熱證的“濕邪內(nèi)停”相關(guān)[20]。而本研究發(fā)現(xiàn)熱模組AQP3 表達(dá)較濕模組增加，這與謝婧[21]研究結(jié)果相一致。

研究認(rèn)為，濕熱證與炎癥密切相關(guān)[22-27]。流感病毒感染機(jī)體后，病毒在機(jī)體內(nèi)大量増殖，激活體內(nèi)免疫系統(tǒng)，同時(shí)釋放細(xì)胞因子。溫病濕熱證在炎癥因子、紊亂的水液代謝等作用下，濕熱互結(jié)，溫病濕熱證的核心病機(jī)為“濕阻”[28]?！读驐l辨·卷下》曰：“夫濕乃重濁之邪，其傷人也最廣”。許華沖[29]研究表明，濕邪能導(dǎo)致流感病毒擴(kuò)增量的增加。本研究發(fā)現(xiàn)“濕”能明顯提高流感病毒復(fù)制。李華峰[26-27]、劉葉[12]和莊凌云[30]等研究發(fā)現(xiàn)濕熱證模型小鼠IFN-γ、IL-4存在變化，畢倩宇等[31]研究發(fā)現(xiàn)小鼠感染H1N1 病毒后，IL-4 水平明顯升高。張俊英[5]研究發(fā)現(xiàn)“濕”“熱”模型組之間IL-1β 存在差異。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，病毒組、濕模組和熱模組均出現(xiàn)不同程度的IL-1β、IFN-γ表達(dá)升高和IL-4降低，通過(guò)方劑反證，發(fā)現(xiàn)方劑有反向調(diào)節(jié)作用，提示濕熱因素和病毒因素共同作用造成IL-1β、IFN-γ、IL-4 變化，“濕”跟“熱”表現(xiàn)程度不同，濕重組炎癥程度高于熱重組，提示炎癥因子IL-1β、IFN-γ、IL-4 可能是溫病濕熱證致病機(jī)制之一，“濕”對(duì)炎癥因子影響作用更大些。研究[32-33]表明，糞菌液能增加益生菌豐度、改善Th1/Th2（IFN-γ/IL-4）平衡，采用清熱化濕法治療可逆轉(zhuǎn)菌群失調(diào)[34]。經(jīng)糞菌液干預(yù)后，濕糞組Th1/Th2 趨于平衡，炎癥程度減輕，而熱糞組Th1/Th2 失衡加重，“濕”“熱”表現(xiàn)不同，以方測(cè)證，推測(cè)糞菌液可能有祛濕效果，具體機(jī)制還需深入研究。

謝婧[21]研究發(fā)現(xiàn)溫病濕熱證濕熱偏重小鼠腸道菌群豐度降低且存在差異。王婷[25]研究發(fā)現(xiàn)濕熱證模型大腸桿菌屬、腸球菌屬、梭菌屬等菌群過(guò)度增長(zhǎng)。陳弋[8]研究發(fā)現(xiàn)腸球菌屬和梭菌屬可能分別是“濕”“熱”的特征性菌屬?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明許多疾病的發(fā)生發(fā)展都伴隨著腸道菌群的變化[7]，尋找證候表型的特征性菌群譜和代謝物，可推動(dòng)證候客觀化研究的進(jìn)展[34]。本研究發(fā)現(xiàn)濕熱證模型復(fù)制過(guò)程中Clostridia、 Mollicutes、 Gammaproteobacteria 和Actinobacteria 豐度增加，而B(niǎo)acilli 和Saccharimonadi豐度降低。通過(guò)差異性分析，推測(cè)“濕”“熱”模型組差異優(yōu)勢(shì)菌群是Lactobacillus、Staphylococcus、Ruminococcaceae_UCG-014、Bacteroides 等。這提示Bacteroides（擬桿菌）可能是“濕”的優(yōu)勢(shì)菌屬，而Lactobacillus（乳酸菌）、Staphylococcus（葡萄球菌）可能是“熱”的優(yōu)勢(shì)菌屬。

本研究通過(guò)復(fù)合因素構(gòu)建濕熱證“濕”“熱”偏重病毒性肺炎模型，在模型復(fù)制后，各模型組均出現(xiàn)明顯體質(zhì)量下降、飲食飲水減少、弓背、倦怠、便溏或者便干結(jié)等情況。感染小鼠肺組織出現(xiàn)充血、腫脹和肺病毒相對(duì)表達(dá)量明顯升高，這表明濕熱證病毒性肺炎小鼠模型復(fù)制成功[1]。同時(shí)發(fā)現(xiàn)水通道蛋白、炎癥因子和腸道菌群的變化并用中藥方劑進(jìn)行反證，發(fā)現(xiàn)三仁湯和白虎加蒼術(shù)湯對(duì)水通道蛋白、炎癥因子有調(diào)節(jié)作用，這印證了濕熱證模型“濕重于熱”和“熱重于濕”的復(fù)制成功。

綜上所述，本研究提示溫病濕熱證“濕”“熱”實(shí)質(zhì)可能與腸道菌群、炎癥因子IL-1β、IL-4、IFN-γ和結(jié)腸AQP3、AQP4相關(guān)，各因素對(duì)“濕”“熱”貢獻(xiàn)程度有區(qū)別，這也可能是防治濕熱證的作用機(jī)制。