基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、分子對接及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)探討二至丸改善認(rèn)知障礙的作用機(jī)制

陳淑云，羅子清，王紫琪，秦鈺云，呂錦瀚，汪蕊，趙威（廣州中醫(yī)藥大學(xué)科技創(chuàng)新中心，廣東 廣州 510405）

認(rèn)知障礙泛指各種原因?qū)е碌牟煌潭鹊恼J(rèn)知功能損害，是由于患者主管記憶、語言、注意力、執(zhí)行決策和視空間等腦區(qū)的神經(jīng)組織發(fā)生了不同程度的損傷而引起，從輕度的認(rèn)知功能損害到嚴(yán)重的癡呆，發(fā)病原因廣泛[1]。認(rèn)知障礙分為輕度認(rèn)知障礙和血管性認(rèn)知障礙，目前我國輕度認(rèn)知障礙患者已近2 500萬，根據(jù)數(shù)據(jù)推測到2050年其患病率會達(dá)到現(xiàn)在的3 倍[2]。臨床研究[3-4]發(fā)現(xiàn)，增強(qiáng)膽堿能遞質(zhì)系統(tǒng)功能、拮抗Ca2+內(nèi)流能改善認(rèn)知功能，延緩認(rèn)知障礙進(jìn)程，但其發(fā)病機(jī)制目前仍未能完全闡明。年齡是影響認(rèn)知障礙發(fā)病率的主要因素，隨著我國社會逐步老齡化，尋找并開發(fā)防治認(rèn)知障礙的藥物具有重要意義。

二至丸由女貞子、墨旱蓮組成，具有補(bǔ)益肝腎、滋陰涼血的功效，在保肝補(bǔ)腎、改善骨質(zhì)疏松、圍絕經(jīng)期綜合征、免疫調(diào)節(jié)、抗衰老、改善神經(jīng)系統(tǒng)疾病等方面具有廣泛的藥理活性[5]。研究發(fā)現(xiàn)，二至丸能夠改善D-gal致衰老小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力及海馬神經(jīng)元形態(tài)，通過改善大腦能量代謝障礙、抗氧化應(yīng)激、調(diào)節(jié)神經(jīng)突觸可塑性等多方面實(shí)現(xiàn)神經(jīng)保護(hù)作用[6]；能夠改善阿爾茨海默?。ˋD）模型SAMP8 小鼠學(xué)習(xí)記憶能力，調(diào)節(jié)其海馬組織中多種蛋白質(zhì)的表達(dá)，主要涉及代謝、糖酵解/糖異生、程序性壞死等相關(guān)通路蛋白[7]；還可能通過促進(jìn)能量代謝與囊泡運(yùn)輸，同時(shí)減少Aβ的生成與神經(jīng)細(xì)胞的氧化損傷來達(dá)到治療AD 的作用[8]。故本研究擬采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法、分子對接技術(shù)及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)探討二至丸治療認(rèn)知障礙的可能作用機(jī)制，并篩選相關(guān)活性成分，以期為后續(xù)研究提供新的參考方向。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫及軟件中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php）、Pubchem數(shù)據(jù)庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）、 Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫（http://old.swisstargetprediction.ch）、DisGeNET V5.0 數(shù)據(jù)庫（https://www.disgenet.org）、OMIM數(shù)據(jù)庫（https://omim.org）、GenCards數(shù)據(jù)庫（http://www.genecards.org）、UniProt 數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org）、Cytoscape 3.8.0 軟件、Venny 2.1 可視化平臺（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）、OmicShare 云 平 臺（https://www.omicshare.com） 、STRING 平臺（https://string-db.org）、DAVID 6.8 數(shù)據(jù)庫（hops：//david.ncifcr.gov/home.jsp）、PDB 數(shù)據(jù)庫（https://www.rcsb.org）、Discovery Studio（DS）2.5 軟件（https://www.neotrident.com）。

1.2 動物昆明種小鼠80只，SPF級，雌雄各半，體質(zhì)量（20±5）g，購于廣東省醫(yī)學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（粵）2020-2023。本動物實(shí)驗(yàn)經(jīng)過廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會審批，動物倫理批文號：20220610001。

1.3 主要儀器CFX96 Touch 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀，伯樂（上海）公司；DMI8 型正置熒光顯微鏡，德國徠卡公司；Morris水迷宮及視頻分析系統(tǒng)，廣州飛迪生物科技有限公司。

1.4 藥品及試劑女貞子飲片（批號：210415）、墨旱蓮飲片（批號：35421006），均購自河北仁心藥業(yè)有限公司，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)趙威副研究員鑒定，分別為木犀科植物女貞（LigustrumlucidumAit.）的干燥成熟果實(shí)和菊科植物鱧腸（EcliptaprostrataL.）的干燥地上部分。多奈哌齊（批號：JZ000R3R），上海凱為化學(xué)科技有限公司；氫溴酸東莨菪堿（貨號：51-3-43），成都曼思特生物科技有限公司；總RNA提取試劑盒（貨號：DP424），天根生化科技（北京）有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（貨號：RR036A）、qPCR 試劑盒（貨號：RR820A），TAKARA 寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；HE 染液（貨號：G1005），武漢賽維爾生物公司。

1.5 二至丸水煎煮制備按照1∶1質(zhì)量比例稱取女貞子、墨旱蓮中藥飲片，加10 倍量超純水，預(yù)先浸泡1 h后再煎煮1 h，提取2次，合并濾液，濃縮并調(diào)整濃度為含生藥3 g·mL-1，分裝保存，備用。

1.6 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析及分子對接驗(yàn)證

1.6.1 二至丸活性成分篩選 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索得到119 個(gè)女貞子化學(xué)成分、48 個(gè)墨旱蓮化學(xué)成分，然后以口服生物利用度（Oral bioavailability，OB）≥30%、藥物相似性（Drug likeness，DL）≥0.18 為標(biāo)準(zhǔn)，篩選二至丸的活性成分。通過查閱文獻(xiàn)資料，補(bǔ)充對認(rèn)知障礙具有潛在作用價(jià)值的化學(xué)成分，完成二至丸活性成分?jǐn)?shù)據(jù)庫構(gòu)建。

1.6.2 二至丸治療認(rèn)知障礙的潛在作用靶點(diǎn)篩選 通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫獲得二至丸活性成分的作用靶點(diǎn)，未找到對應(yīng)靶點(diǎn)的活性成分通過Pubchem 數(shù)據(jù)庫和Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測，設(shè)定物種為人，檢索結(jié)果匯總、去重。利用UniProt 數(shù)據(jù)庫的UniProtKB 搜索功能，通過輸入蛋白名稱并限定物種為“Home Sapiens”，將檢索得到的所有蛋白靶點(diǎn)校正為其官方名稱，即得到二至丸活性成分作用靶點(diǎn)。在OMIM、DisGeNET 和GenCards 數(shù)據(jù)庫中以“Cognitive impairments”為關(guān)鍵詞檢索認(rèn)知障礙相關(guān)基因，通過UniProt 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行靶點(diǎn)信息確認(rèn)，并將結(jié)果篩選匯總后去重，即得認(rèn)知障礙疾病相關(guān)靶點(diǎn)。將二至丸活性成分作用靶點(diǎn)和認(rèn)知障礙疾病相關(guān)靶點(diǎn)輸入Venny 2.1 可視化平臺，取二者的交集靶點(diǎn)（共同靶點(diǎn)），即為二至丸治療認(rèn)知障礙的潛在作用靶點(diǎn)。

1.6.3 潛在作用靶點(diǎn)的蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將“1.6.2”項(xiàng)下的交集靶點(diǎn)在線導(dǎo)入STRING 平臺，選擇“Multiple Proteins”模式，蛋白種屬設(shè)為“Home Sapiens”，設(shè)置最低相互作用閾值為“Medium_confidence≥0.4”，其余參數(shù)為默認(rèn)值，隱藏游離節(jié)點(diǎn)，建立潛在作用靶點(diǎn)的PPI 網(wǎng)絡(luò)。利用Cytoscape 3.8 軟件的CytoNCA 插件工具分析靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)，通過度值（Degree）篩選出二至丸治療認(rèn)知障礙的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.6.4 “藥物-活性成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 通過Cytoscape 3.8軟件將二至丸治療認(rèn)知障礙的關(guān)鍵靶點(diǎn)與二至丸的組方藥物-活性成分-作用靶點(diǎn)數(shù)據(jù)進(jìn)行匹配后，構(gòu)建“藥物-活性成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)”可視化網(wǎng)絡(luò)，并利用Network Analyzer 插件功能對網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治觯Y選出二至丸治療認(rèn)知障礙的關(guān)鍵活性成分及核心靶點(diǎn)。

1.6.5 GO 功能及KEGG 通路富集分析 利用DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫對二至丸治療認(rèn)知障礙的關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能及KEGG 通路富集分析。GO 功能富集分析包括生物學(xué)過程（Biological process，BP）、分子功能（Molecular function， MF）和細(xì)胞組分（Cellular component，CC）。結(jié)果根據(jù)錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）≤0.05、P＜0.05進(jìn)行篩選，對所得條目以條形圖或氣泡圖形式進(jìn)行可視化展示。

1.6.6 分子對接驗(yàn)證 選擇“藥物-活性成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)分析得到的二至丸治療認(rèn)知障礙的前3位關(guān)鍵活性成分與前5位核心靶點(diǎn)；通過PubChem數(shù)據(jù)庫下載關(guān)鍵活性成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)，通過PDB 數(shù)據(jù)庫下載相應(yīng)蛋白受體；采用Discovery Studio（DS）2.5 軟件的CDOCKER模塊對核心靶點(diǎn)蛋白受體和活性成分小分子配體進(jìn)行分子對接，配體-受體結(jié)合構(gòu)象的結(jié)合能越低，說明該結(jié)合構(gòu)象越穩(wěn)定，反映受體分子與配體之間結(jié)合的可能性越大。

1.7 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

1.7.1 動物分組、造模及給藥 小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，隨機(jī)分為6 組：空白組、模型組、多奈哌齊組（3 mg·kg-1）及二至丸低、中、高劑量組（1.75、3.5、7.0 g·kg-1），每組10 只?？瞻捉M小鼠給予生理鹽水（10 mL·kg-1）腹腔注射，其余各組小鼠腹腔注射東莨菪堿3 mg·kg-1·d-1造模；每日灌胃給藥1 次，二至丸及多奈哌齊組預(yù)給藥5 d 后，造模同時(shí)連續(xù)給藥14 d，空白組及模型組給予等體積蒸餾水灌胃（20 mL·kg-1）。

1.7.2 新物體識別實(shí)驗(yàn) 給藥結(jié)束后進(jìn)行新物體識別實(shí)驗(yàn)，檢測小鼠認(rèn)知記憶水平。前2 d，將各組小鼠放入40 cm × 40 cm × 40 cm的行為箱中，適應(yīng)10 min后將小鼠放回原飼養(yǎng)籠中，每次實(shí)驗(yàn)結(jié)束后用75%乙醇進(jìn)行場地清理，以減少嗅覺提示。正式實(shí)驗(yàn)當(dāng)天，將各組小鼠按照編號順序分別放入行為箱中，同時(shí)箱內(nèi)放入2個(gè)相同物體，熟悉10 min后將小鼠放回原飼養(yǎng)籠中；2 h后將各組小鼠依次放入行為箱中進(jìn)行測試，箱內(nèi)放入2個(gè)不同物體，記錄每只小鼠對新舊物體的探索次數(shù)；計(jì)算：新物體識別指數(shù)（%）=新物體探索次數(shù)/（新物體探索次數(shù)+舊物體探索次數(shù)）×100%。

1.7.3 海馬組織病理學(xué)觀察 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后將小鼠麻醉處死，冰上迅速剝離大腦并取出海馬組織；取海馬體的一半，用4%中性多聚甲醛溶液固定后，經(jīng)梯度乙醇脫水、石蠟包埋、切片、HE染色、梯度乙醇脫水、中性樹膠封片等步驟，在光學(xué)顯微鏡下觀察海馬組織病理變化，并進(jìn)行圖像采集。

1.7.4 qRT-PCR 法檢測海馬組織AKT、p-AKT、PI3K mRNA 表達(dá)水平 采用試劑盒提取海馬組織總RNA 后，按照TAKARA RR036A 試劑盒說明書步驟進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。然后進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系為25 μL，反應(yīng)條件：95 ℃、30 s；95 ℃、5 s，60 ℃、30 s，共40個(gè)循環(huán)。結(jié)果以β-actin 作為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計(jì)算各組目的基因的表達(dá)水平。引物設(shè)計(jì)、合成由寶生物工程（大連）有限公司完成，引物序列見表1。

表1 PCR 引物序列Table 1 Primer sequences for PCR

1.7.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析；計(jì)量資料以均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示；多組間比較采用單因素方差分析（One- way ANOVA），兩兩比較采用LSD 檢驗(yàn)，方差不齊則用Dunnett’s T3檢驗(yàn)；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 二至丸治療認(rèn)知障礙的潛在作用靶點(diǎn)通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫檢索女貞子、墨旱蓮的化學(xué)成分，并按照OB≥30%、DL≥0.18 的標(biāo)準(zhǔn)篩選，共得到21 個(gè)活性成分；進(jìn)一步通過查閱文獻(xiàn)資料[9-13]，補(bǔ)充了對認(rèn)知障礙具有潛在作用價(jià)值的活性成分4個(gè)，分別是紅景天苷、特女貞苷、芹菜素和旱蓮甘A；二至丸的25 個(gè)活性成分信息見表2。通過TCMSP 數(shù)據(jù)、Pubchem 數(shù)據(jù)庫、Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫對25 個(gè)活性成分進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測，結(jié)果匯總?cè)ブ睾蠊搏@得252 個(gè)靶點(diǎn)基因。通過OMIM、DisGeNET 和GenCards 數(shù)據(jù)庫檢索、篩選及匯總?cè)ブ睾?，共得? 766個(gè)認(rèn)知障礙疾病相關(guān)靶點(diǎn)。將二至丸活性成分作用靶點(diǎn)和認(rèn)知障礙疾病相關(guān)靶點(diǎn)輸入Venny 2.1 可視化平臺，取二者的交集靶點(diǎn)（共同靶點(diǎn)），即得二至丸治療認(rèn)知障礙的潛在作用靶點(diǎn)200 個(gè)，結(jié)果見圖1。

圖1 二至丸治療認(rèn)知障礙的潛在作用靶點(diǎn)Figure 1 Potential targets of Erzhi Pills in the treatment of cognitive impairments

表2 二至丸的活性成分基本信息表Table 2 Basic information table of active components of Erzhi Pills

2.2 二至丸治療認(rèn)知障礙的潛在作用靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)通過STRING數(shù)據(jù)庫進(jìn)行二至丸治療認(rèn)知障礙的潛在作用靶點(diǎn)的PPI 分析，并將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0軟件中，構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)（見圖2），該網(wǎng)絡(luò)包含199 個(gè)節(jié)點(diǎn)，3 442 條邊。利用Cytoscape 3.8 軟件的CytoNCA插件工具分析靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)，以度值（Degree）＞2 倍平均度值（70）為條件，篩選出二至丸治療認(rèn)知障礙的關(guān)鍵靶點(diǎn)22 個(gè)（見表3），包括絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1（AKT1）、抑癌基因（TP53）、白細(xì)胞介素6（IL6）、胰島素（INS）和血管內(nèi)皮生長因子A（VEGFA）等，可能在二至丸治療認(rèn)知障礙中起到重要作用。

圖2 二至丸治療認(rèn)知障礙潛在作用靶點(diǎn)的PPI 網(wǎng)絡(luò)Figure 2 PPI network of potential targets of Erzhi Pills in the treatment of cognitive impairments

表3 二至丸治療認(rèn)知障礙的關(guān)鍵靶點(diǎn)Table 3 Key targets of Erzhi Pills in the treatment of cognitive impairments

2.3 二至丸治療認(rèn)知障礙的“藥物-活性成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)將二至丸治療認(rèn)知障礙的22 個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)與二至丸的組方藥物-活性成分-作用靶點(diǎn)數(shù)據(jù)進(jìn)行匹配，通過Cytoscape 3.8.0 軟件構(gòu)建“藥物-活性成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)” 可視化網(wǎng)絡(luò)（見圖3），共有40個(gè)節(jié)點(diǎn)、88 條邊構(gòu)成；圖中綠色的八邊形節(jié)點(diǎn)代表二至丸中的藥物，藍(lán)色圓形節(jié)點(diǎn)代表活性成分，方形節(jié)點(diǎn)代表關(guān)鍵靶點(diǎn)，靶點(diǎn)顏色默認(rèn)按度值從高到低以顏色由黃色漸變到紅色表示。利用Network Analyzer插件功能對網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治?，篩選出排前3位的關(guān)鍵活性成分槲皮素、木犀草素、芹菜素，排前5位的核心靶點(diǎn)PTGS2、CASP3、PPARG、AKT1、ESR1，上述靶點(diǎn)主要與炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、脂質(zhì)代謝、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、衰老及細(xì)胞增殖相關(guān)。

圖3 二至丸治療認(rèn)知障礙的“藥物-活性成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)Figure 3 “Chinese medicinals-active components-key targets” network of Erzhi Pills in the treatment of cognitive impairments

2.4 GO 功能及KEGG 通路富集分析二至丸治療認(rèn)知障礙的關(guān)鍵靶點(diǎn)的GO 功能富集分析結(jié)果見圖4，細(xì)胞組分主要涉及胞外間隙、細(xì)胞外區(qū)域、細(xì)胞質(zhì)和RNA 聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物等細(xì)胞元件；生物學(xué)過程主要涉及一氧化氮生物合成過程的正調(diào)控、有機(jī)環(huán)化合物的反應(yīng)、抑制凋亡、RNA 聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、促進(jìn)蛋白質(zhì)磷酸化和基因表達(dá)等；分子功能主要涉及相同蛋白質(zhì)結(jié)合、酶結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、蛋白磷酸酶結(jié)合和一氧化氮合酶調(diào)節(jié)活性等。

圖4 二至丸治療認(rèn)知障礙的關(guān)鍵靶點(diǎn)GO 功能富集分析Figure 4 GO enrichment analysis of the key targets of Erzhi Pills in the treatment of cognitive impairments

KEGG 通路富集分析結(jié)果見圖5，圖中氣泡大小代表該通路富集的基因數(shù)量，顏色代表富集顯著性。結(jié)果顯示，二至丸治療認(rèn)知障礙的關(guān)鍵靶點(diǎn)可能主要集中在癌癥通路、HIF-1 通路、TNF 通路、PI3K-AKT通路等，其可能主要通過抗炎、抗氧化途徑改善認(rèn)知障礙。

圖5 二至丸治療認(rèn)知障礙的關(guān)鍵靶點(diǎn)KEGG 通路富集分析Figure 5 KEGG pathway enrichment analysis of the key targets of Erzhi Pills in the treatment of cognitive impairments

2.5 分子對接驗(yàn)證選取“藥物-活性成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)分析得到的關(guān)鍵活性成分槲皮素、木犀草素、芹菜素分別與核心靶點(diǎn)PTGS2、CASP3、PPARG、AKT1、ESR1 進(jìn)行分子對接，結(jié)果見表4。結(jié)合能越低則代表受體與配體的親和力越好，通常認(rèn)為結(jié)合能小于-4.25 kcal·mol-1提示配體與受體有一定的結(jié)合活性，小于-5.0 kcal·mol-1有較好的結(jié)合活性，小于-7.0 kcal·mol-1有強(qiáng)烈的結(jié)合活性[14]。結(jié)果表明，3 個(gè)活性成分與5個(gè)核心靶點(diǎn)均有較好的結(jié)合活性及穩(wěn)定性，展現(xiàn)了良好的親和力。

表4 二至丸治療認(rèn)知障礙的關(guān)鍵活性成分與核心靶點(diǎn)分子對接結(jié)果Table 4 Molecular docking results of key components and core targets of Erzhi Pills in the treatment of cognitive impairments

2.6 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果

2.6.1 二至丸對認(rèn)知障礙小鼠新物體識別指數(shù)的影響 結(jié)果見圖6。與空白組相比，模型組小鼠的新物體識別指數(shù)顯著下降（P＜0.001），說明認(rèn)知障礙模型建立成功。與模型組相比，多奈哌齊組及二至丸低、中、高劑量組小鼠的新物體識別指數(shù)顯著升高（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001）。

圖6 二至丸對認(rèn)知障礙小鼠新物體識別指數(shù)的影響（ ±s，n=10）Figure 6 Effect of Erzhi Pills on novel object discrimination coefficient in mice with cognitive impairments（ ±s，n=10）

2.6.2 二至丸對認(rèn)知障礙小鼠海馬組織CA2、DG 區(qū)病理變化的影響 結(jié)果見圖7。與空白組相比，模型組小鼠海馬組織CA2、DG 區(qū)細(xì)胞皺縮、排列較紊亂，多數(shù)細(xì)胞核固縮明顯，部分細(xì)胞破碎或消失。與模型組相比，多奈哌齊組小鼠海馬組織CA2、DG區(qū)細(xì)胞排列整齊規(guī)則、染色均勻、輪廓清晰，細(xì)胞核清晰，胞質(zhì)飽滿且呈淡紅色；二至丸給藥組小鼠海馬組織CA2、DG 區(qū)細(xì)胞排列稍整齊，細(xì)胞間隙減小，胞核顏色較淺、固縮減輕，胞質(zhì)飽滿且呈淡紅色。結(jié)果說明，二至丸能一定程度上改善東莨菪堿致認(rèn)知障礙小鼠的海馬神經(jīng)元損傷。

圖7 二至丸對認(rèn)知障礙小鼠海馬組織CA2、DG 區(qū)病理變化的影響（HE 染色，×100）Figure 7 Effects of Erzhi Pills on pathological changes of hippocampal CA2 and DG regions in mice with cognitive impairments（HE staining，×100）

2.6.3 二至丸對認(rèn)知障礙小鼠海馬組織AKT、p-AKT、PI3K mRNA 表達(dá)的影響 結(jié)果見圖8。與空白組相比，模型組小鼠海馬組織AKT、p-AKT、PI3K mRNA 表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.01，P＜0.001）。與模型組相比，多奈哌齊組及二至丸低、中、高劑量組小鼠海馬組織AKT mRNA 表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.01），多奈哌齊組及二至丸低劑量組小鼠海馬組織p-AKT mRNA 表達(dá)明顯上調(diào)（P＜0.05，P＜0.01），多奈哌齊組及二至丸低、中劑量組小鼠海馬組織PI3K mRNA表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.001）。

圖8 二至丸對認(rèn)知障礙小鼠海馬組織AKT、p-AKT、PI3K mRNA 表達(dá)的影響（ ±s，n=3）Figure 8 Effects of Erzhi Pills on mRNA expressions of AKT，p-AKT and PI3K in hippocampus of mice with cognitive impairments（ ±s，n=3）

3 討論

通過對二至丸治療認(rèn)知障礙的“藥物-活性成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，篩選出排前3 位的關(guān)鍵活性成分槲皮素、木犀草素、芹菜素，三者均是天然黃酮類化合物。研究[15-16]表明，槲皮素能夠保護(hù)神經(jīng)元免受氧化損傷，減少脂質(zhì)過氧化，抑制Aβ聚集，調(diào)控MAPK 及PI3K/AKT/GSK3β 通路逆轉(zhuǎn)tau 蛋白磷酸化，減少神經(jīng)纖維纏結(jié)和突觸功能障礙；槲皮素還可以通過下調(diào)促炎因子如NF-κB、iNOS 來抑制神經(jīng)炎癥，并促進(jìn)神經(jīng)元再生。木犀草素具有抗炎、抗氧化等多種藥理作用，可通過HIF-1α 調(diào)控AKT/mTOR 和ERK/MAPK 信號通路，抑制癌細(xì)胞增殖和遷移[17]。芹菜素能通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT/mTOR 信號通路，促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡和自噬，保護(hù)神經(jīng)突和細(xì)胞活力；減少Caspase-3/7 介導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡，調(diào)控ERK/CREB/BDNF 通路來改善學(xué)習(xí)記憶障礙[18-19]。

PTGS2、CASP3、PPARG、AKT1、ESR1、TP53等可能是二至丸治療認(rèn)知障礙的核心靶點(diǎn)。PTGS2為前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2，作為炎性反應(yīng)的重要介質(zhì)，其主要存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)皮層和海馬神經(jīng)元。PTGS2水平異常會損傷神經(jīng)元，導(dǎo)致認(rèn)知功能損害[20-21]。CASP3基因編碼凋亡執(zhí)行蛋白天冬氨酸蛋白水解酶3（Caspase-3），參與調(diào)控蛋白水解及細(xì)胞凋亡過程[22]。PPARG 基因編碼過氧化物酶體增殖物激活受體γ，可調(diào)節(jié)炎癥介質(zhì)的基因表達(dá)[23]。AKT1 作為一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，參與炎癥疾病的發(fā)生發(fā)展[24]。TP53 屬于已知的一類經(jīng)典的抑癌基因，能調(diào)控細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)，抑制血管生成，從而干預(yù)細(xì)胞的增殖、分化及凋亡[25]。ESR1即雌激素受體1，調(diào)控血管生成，參與心血管疾病及抑郁癥的病理過程，影響認(rèn)知學(xué)習(xí)水平[26-28]。

GO 功能富集分析結(jié)果顯示，二至丸可能通過調(diào)控細(xì)胞凋亡、促進(jìn)轉(zhuǎn)錄翻譯和蛋白活化參與生物過程。KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)，二至丸可能主要通過抗炎、抗氧化途徑改善認(rèn)知功能障礙，主要涉及癌癥通路、HIF-1 通路、TNF 通路、PI3K/AKT 通路等。分子對接結(jié)果顯示，二至丸的關(guān)鍵活性成分槲皮素、木犀草素、芹菜素與核心靶點(diǎn)PTGS2、CASP3、PPARG、AKT1、ESR1 均有較好的結(jié)合活性及穩(wěn)定性，展現(xiàn)了良好的親和力。上述核心靶點(diǎn)與PI3K/AKT 信號通路明顯相關(guān)，表明二至丸可能通過PI3K/AKT 信號通路改善認(rèn)知功能障礙。PI3K/AKT 信號通路是細(xì)胞內(nèi)廣泛存在的信號傳導(dǎo)途徑，為人體經(jīng)典的信號通路之一，參與細(xì)胞生長、增殖、凋亡和自噬等的調(diào)控，與認(rèn)知障礙關(guān)系密切。PI3K 是細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要分子，是由調(diào)節(jié)亞基p85 和催化亞基p110 構(gòu)成的二聚體，其活化主要依靠質(zhì)膜附近的底物，包括信號轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合物和多種生長因子，通過激活受體酪氨酸激酶（RTK），從而引起PI3K 自磷酸化?；罨腜I3K能夠通過改變AKT 蛋白結(jié)構(gòu)而使其活化激活，并以磷酸化作用激活下游mTOR，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[29-30]。有研究報(bào)道，乳脂球表皮生長因子8（MFG-E8）可通過下調(diào)NF-κB、上調(diào)PI3K/AKT來調(diào)控星形膠質(zhì)細(xì)胞A1或A2表型，從而改善認(rèn)知功能障礙[31]；溫膽湯可通過調(diào)控PI3K/AKT/mTOR信號通路來提升精神分裂癥模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力[32]；回神顆?？赏ㄟ^調(diào)控P13K/AKT 信號通路改善老年癡呆模型APPswe/PS1△E9雙轉(zhuǎn)基因小鼠的認(rèn)知功能障礙[33]。PI3K/AKT 及其下游信號通路可能是治療神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的重要策略。本研究進(jìn)一步通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，二至丸能改善東莨菪堿致認(rèn)知障礙小鼠的認(rèn)知記憶功能，一定程度上修復(fù)海馬神經(jīng)元損傷，上調(diào)AKT、p-AKT、PI3K 基因表達(dá)。表明二至丸可能通過激活PI3K/AKT 信號通路，從而改善東莨菪堿致認(rèn)知障礙小鼠的認(rèn)知記憶功能。

綜上所述，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、分子對接及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)初步預(yù)測了二至丸治療認(rèn)知障礙關(guān)鍵活性成分、靶點(diǎn)及通路。二至丸治療認(rèn)知障礙的作用可能是通過槲皮素、木犀草素、芹菜素等關(guān)鍵活性成分，作用于PTGS2、CASP3、PPARG、AKT1、ESR1等核心靶點(diǎn)，通過PI3K/AKT 通路、HIF-1 通路、TNF通路等多條信號通路來實(shí)現(xiàn)的。本研究可為二至丸治療認(rèn)知障礙的進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)及臨床研究提供參考，但相關(guān)研究結(jié)果仍有待進(jìn)一步的生物學(xué)驗(yàn)證。