蒼術(shù)酮對(duì)人肝癌細(xì)胞MHCC97-H 增殖、遷移、侵襲、凋亡的影響及機(jī)制研究

金源源，麥靜愔，平鍵，陳建杰，成揚(yáng)，，4 （. 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院，上海 00；. 上海市中醫(yī)醫(yī)院，上海 0007；. 上海中醫(yī)藥大學(xué)肝腎疾病病證教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 00；4. 上海市中醫(yī)臨床重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 00）

原發(fā)性肝癌是全球最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一[1]，位居我國(guó)癌癥死因的第2位[2]。研究[3]表明，腫瘤患者主要死于癌癥的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，抑制癌細(xì)胞的遷移、侵襲是肝癌防治的關(guān)鍵。中草藥及其有效活性成分是研發(fā)新型抗腫瘤藥物的重要來(lái)源。蒼術(shù)酮是從中藥蒼術(shù)中提取的有效成分，具有抗炎、保肝、抗病毒、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫等多種藥理作用[4-5]。研究[4，6]表明，蒼術(shù)酮對(duì)皮膚癌、胃癌、結(jié)直腸癌等多種癌細(xì)胞具有顯著的抑制作用，提示其具有成為抗腫瘤藥物的潛力。故本研究擬以具有高轉(zhuǎn)移潛能的人肝癌細(xì)胞系MHCC97-H 為研究對(duì)象，觀察蒼術(shù)酮對(duì)其增殖、遷移、侵襲、凋亡的影響，探討蒼術(shù)酮抗腫瘤的潛在分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞人肝癌細(xì)胞MHCC97-H，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。將MHCC97-H 細(xì)胞置于含有10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中，在飽和濕度、37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3 d換液，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞傳代后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥品及試劑蒼術(shù)酮（批號(hào)：AFBH1703），純度（HPLC）≥98%，成都埃法生物科技有限公司；10%胎牛血清（批號(hào)：10099-141）、DMEM 培養(yǎng)基（批號(hào)：10564-011），均購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher 公司；DMSO（批號(hào)：D5879），美國(guó)Sigma-Aldrich 公司；CCK- 8 試劑盒（批號(hào)： C0038）、 PBS（批號(hào)：C0221A）、RIPA 裂解液（批號(hào)：P0013B）、TBST（批號(hào)：ST677）、胰蛋白酶（批號(hào)：C0201）、SDS-PAGE凝膠（批號(hào)：0012A），均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；兔一抗B 細(xì)胞淋巴瘤2（Bcl-2，批號(hào)：ab241548）、 Bcl- 2 關(guān)聯(lián)X 蛋白（Bax， 批號(hào)：ab182733）、裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Cleaved caspase-3，批號(hào)：ab2302）、N-鈣黏蛋白（N-cad，批號(hào)：ab245117）、E-cad（批號(hào)：ab40772）、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA，批號(hào)：ab21027）、波形蛋白（Vimentin，批號(hào)：ab24525）、基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP-2，批號(hào)：ab92536）、MMP-9（批號(hào)：ab38898）、金屬蛋白酶組織抑制因子2（TIMP-2，批號(hào)：ab231176）、GAPDH（批號(hào)：ab8245）抗體及HPR標(biāo)記的山羊抗兔二抗（批號(hào)：ab151752），均購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司；Annexin V- FITC 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：556547），美國(guó)Beckman Coulter 公司；Transwell 小室（批號(hào)：3412），上海百賽生物技術(shù)股份有限公司。

1.3 主要儀器Heracell 150i 型細(xì)胞培養(yǎng)箱，美國(guó)Thermo Fisher 公司； iMark 型多功能酶標(biāo)儀、PowerPacTMHC型電泳儀、Mini Trans-Blot Cell型轉(zhuǎn)膜儀，美國(guó)Bio-Rad 公司；AccuriTMC6 型流式細(xì)胞儀，美國(guó)Beckman Coulter 公司；IX 73型倒置顯微鏡，日本OLYMPUS公司。

1.4 CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞活性取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MHCC97-H細(xì)胞，用0.25%胰酶消化，重懸，以每孔5×103個(gè)細(xì)胞接種于96孔板。孵育24 h，細(xì)胞貼壁后吸棄原培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組加入100 μL 不同濃度的蒼術(shù)酮溶液（5、10、15、20、25、30 μmol·L-1），對(duì)照組和空白組（無(wú)細(xì)胞）加入100 μL 培養(yǎng)基，每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔。孵育24 h 后，每孔加入10 μL CCK-8 溶液，孵育4 h后，采用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長(zhǎng)處的光密度（OD）值。計(jì)算：細(xì)胞存活率（%）=（OD實(shí)驗(yàn)組-OD空白組）/（OD對(duì)照組-OD空白組）×100%，并用GraphPad Prism 8.0軟件分析蒼術(shù)酮的半數(shù)抑制濃度（IC50）。

1.5 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MHCC97-H 細(xì)胞，以每孔1×103個(gè)細(xì)胞接種于6孔板。孵育24 h，細(xì)胞貼壁后吸棄原培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組加入終濃度為5、10、20 μmol·L-1的蒼術(shù)酮溶液，對(duì)照組加入培養(yǎng)基，每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔；在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2周，每3 d換液1次。細(xì)胞集落形成后，用1 mL 4%多聚甲醛溶液固定15 min，再用1 mL 0.5%結(jié)晶紫染色15 min；PBS 洗滌，室溫下干燥，倒置顯微鏡下記錄大于10個(gè)細(xì)胞的集落數(shù)。

1.6 Transwell 遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MHCC97-H細(xì)胞，以每孔1×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔板。孵育24 h，細(xì)胞貼壁后吸棄原培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組加入終濃度為5、10、20 μmol·L-1的蒼術(shù)酮溶液，對(duì)照組加入培養(yǎng)基，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，干預(yù)細(xì)胞24 h。細(xì)胞消化、離心、PBS洗滌后，以DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為2.5×105個(gè)·mL-1。在Transwell 小室上層加入200 μL 細(xì)胞懸液，下室加入500 μL完全培養(yǎng)基，37 ℃下培養(yǎng)24 h。用4%多聚甲醛溶液固定30 min 后，以0.1%結(jié)晶紫染色20 min，清洗染液后風(fēng)干。劃開(kāi)小室基膜，取下濾膜，放置在載玻片上，在顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野觀察遷移細(xì)胞數(shù)，并拍照記錄。

1.7 Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力將Matrigel 基質(zhì)膠（5 mg·mL-1）置于4 ℃冰箱過(guò)夜融化，用DMEM 培養(yǎng)基將基質(zhì)膠稀釋為1 mg·mL-1；以每小室50 μL 包被上室，輕微震蕩使液面平整，37 ℃下孵育待膠凝固；余下步驟同“1.6”項(xiàng)。

1.8 Annexin V/PI 雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MHCC97-H細(xì)胞，以每孔1×106個(gè)細(xì)胞接種于6孔板。孵育24 h，細(xì)胞貼壁后吸棄原培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組加入終濃度為5、10、20 μmol·L-1的蒼術(shù)酮溶液，對(duì)照組加入培養(yǎng)基，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，干預(yù)細(xì)胞24 h。PBS 洗滌2 次，胰酶消化，離心收集細(xì)胞。使用Annexin V-FITC 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒進(jìn)行細(xì)胞染色后，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.9 Western Blot 法檢測(cè)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MHCC97-H 細(xì)胞，以每孔1×106個(gè)細(xì)胞接種于6 孔板；孵育24 h，細(xì)胞貼壁后吸棄原培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組加入終濃度為5、10、20 μmol·L-1的蒼術(shù)酮溶液，對(duì)照組加入培養(yǎng)基；每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，干預(yù)細(xì)胞24 h。收集細(xì)胞后，用RIPA裂解液裂解細(xì)胞并提取總蛋白，以BCA法測(cè)定蛋白濃度；各組取等量蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳、硝酸纖維素膜轉(zhuǎn)膜；5%脫脂牛奶封閉后，加入一抗α-SMA、Vimentin、E-cad、N-cad、MMP-2、MMP-9、TIMP-2、Bcl-2、Bax、Cleaved caspase-3（均為1∶1 000），4 ℃下孵育過(guò)夜；TBST洗膜后，加入二抗（1∶5 000），37 ℃下孵育1 h；TBST再次洗膜后，加化學(xué)發(fā)光試劑顯影并掃描。采用ImageJ 圖像分析軟件分析蛋白條帶灰度值，以GAPDH為內(nèi)參，對(duì)目的蛋白進(jìn)行半定量分析。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析；計(jì)量資料以均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示；多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），兩兩比較采用Tukey 檢驗(yàn)；以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 蒼術(shù)酮對(duì)MHCC97-H 細(xì)胞活性的影響結(jié)果見(jiàn)圖1。經(jīng)蒼術(shù)酮0、5、10、15、20、25、30 μmol·L-1處理24 h 后，MHCC97-H 細(xì)胞的存活率分別為96.04%、86.49%、77.58%、70.51%、57.67%、51.61%、39.92%，蒼術(shù)酮干預(yù)MHCC97-H 細(xì)胞24 h 的IC50為24.97 μmol·L-1。因此，結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)置蒼術(shù)酮低（5 μmol·L-1）、中（10 μmol·L-1）、高（20 μmol·L-1）濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 蒼術(shù)酮對(duì)MHCC97-H 細(xì)胞活性的影響（ ±s，n=3）Figure 1 Effect of atractylone on activity of MHCC97-H cells（ ±s，n=3）

2.2 蒼術(shù)酮對(duì)MHCC97-H 細(xì)胞增殖能力的影響結(jié)果見(jiàn)圖2。與對(duì)照組比較，蒼術(shù)酮10、20 μmol·L-1干預(yù)2周后，MHCC97-H細(xì)胞集落數(shù)顯著減少（P＜0.01）；與5 μmol·L-1組比較，蒼術(shù)酮10、20 μmol·L-1組細(xì)胞集落數(shù)顯著減少（P＜0.01），且呈濃度依賴性。結(jié)果表明，蒼術(shù)酮能夠抑制MHCC97-H細(xì)胞增殖。

圖2 蒼術(shù)酮對(duì)MHCC97-H 細(xì)胞增殖能力的影響（ ±s，n=3）Figure 2 Effect of atractylone on proliferation of MHCC97-H cells（ ±s，n=3）

2.3 蒼術(shù)酮對(duì)MHCC97-H 細(xì)胞遷移能力的影響結(jié)果見(jiàn)圖3。與對(duì)照組比較，蒼術(shù)酮5、10、20 μmol·L-1組MHCC97-H細(xì)胞遷移數(shù)均顯著減少（P＜0.05，P＜0.01）；與5 μmol·L-1組比較，蒼術(shù)酮20 μmol·L-1組MHCC97-H 細(xì)胞遷移數(shù)顯著減少（P＜0.01）。結(jié)果表明，蒼術(shù)酮能夠抑制MHCC97-H細(xì)胞遷移。

圖3 蒼術(shù)酮對(duì)MHCC97-H 細(xì)胞遷移能力的影響（結(jié)晶紫染色，×200； ±s，n=3）Figure 3 Effect of atractylone on migration of MHCC97-H cells（Crystal violet staining，×200； ±s，n=3）

2.4 蒼術(shù)酮對(duì)MHCC97-H 細(xì)胞侵襲能力的影響結(jié)果見(jiàn)圖4。與對(duì)照組比較，蒼術(shù)酮5、10、20 μmol·L-1組MHCC97-H 細(xì)胞侵襲數(shù)均顯著減少（P＜0.01）；與5 μmol·L-1組比較，蒼術(shù)酮10、20 μmol·L-1組MHCC97-H 細(xì)胞侵襲數(shù)均顯著減少（P＜0.01）。結(jié)果表明，蒼術(shù)酮能夠抑制MHCC97-H細(xì)胞侵襲。

圖4 蒼術(shù)酮對(duì)MHCC97-H 細(xì)胞侵襲能力的影響（結(jié)晶紫染色，×200； ±s，n=3）Figure 4 Effect of atractylone on invasion of MHCC97-H cells（Crystal violet staining，×200； ±s，n=3）

2.5 蒼術(shù)酮對(duì)MHCC97-H 細(xì)胞凋亡率的影響結(jié)果見(jiàn)圖5。與對(duì)照組比較，蒼術(shù)酮10、20 μmol·L-1組的MHCC97-H 細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0.01），呈明顯的濃度依賴性。結(jié)果表明，蒼術(shù)酮能夠促進(jìn)MHCC97-H細(xì)胞凋亡。

圖5 蒼術(shù)酮對(duì)MHCC97-H 細(xì)胞凋亡率的影響（ ±s，n=3）Figure 5 Effect of atractylone on apoptosis rate of MHCC97-H cells（ ±s，n=3）

2.6 蒼術(shù)酮對(duì)MHCC97-H 細(xì)胞EMT 相關(guān)蛋白表達(dá)的影響結(jié)果見(jiàn)圖6。與對(duì)照組比較，蒼術(shù)酮5、10、20 μmol·L-1組MHCC97-H細(xì)胞α-SMA、Vimentin、N-cad、MMP-2、MMP-9 蛋白表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.01），TIMP-2 蛋白表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.05，P＜0.01），蒼術(shù)酮10、20 μmol·L-1組MHCC97-H 細(xì)胞E-cad蛋白表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.01）。

圖6 蒼術(shù)酮對(duì)MHCC97-H 細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（ ±s，n=3）Figure 6 Effects of atractylone on EMT-related proteins of MHCC97-H cells（ ±s，n=3）

2.7 蒼術(shù)酮對(duì)MHCC97-H 細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響結(jié)果見(jiàn)圖7。與對(duì)照組比較，蒼術(shù)酮5、10、20 μmol·L-1組MHCC97-H 細(xì)胞Bcl-2 蛋白表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.01），Cleaved caspase-3、Bax 蛋白表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.01），且呈濃度依賴性。

圖7 蒼術(shù)酮對(duì)MHCC97-H 細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（ ±s，n=3）Figure 7 Effects of atractylone on apoptosis-related proteins of MHCC97-H cells（ ±s，n=3）

3 討論

原發(fā)性肝癌是消化系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤，我國(guó)原發(fā)性肝癌死亡病例約占全球的47%[2]。目前臨床上多采取綜合性個(gè)體化治療方案，但肝癌的5年生存率只有12.1%[7]。研究[8-9]表明，聯(lián)合中藥治療肝癌具有明顯的增效減毒作用，有助于延長(zhǎng)患者生存時(shí)間，改善其生活質(zhì)量。蒼術(shù)酮是從蒼術(shù)中提取的一種揮發(fā)油，具有抗腫瘤作用，可抑制HepG2、MCG803和HCT-116 等腫瘤細(xì)胞增殖[4]。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)[10]表明，蒼術(shù)酮可通過(guò)抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞HT29的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域及調(diào)控PI3K-AKT-mTOR信號(hào)通路，促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果表明，蒼術(shù)酮可抑制高轉(zhuǎn)移性人肝癌細(xì)胞MHCC97-H 的增殖、遷移和侵襲，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，具有顯著的抗肝癌活性，以20 μmol·L-1蒼術(shù)酮的作用最為顯著。

遷移和侵襲是惡性腫瘤的兩大生物學(xué)特征。細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）和基底膜的降解是癌細(xì)胞遷移和侵襲的必要條件[11]。在惡性腫瘤進(jìn)展中，腫瘤細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）被激活，上皮細(xì)胞失去E-cad 等細(xì)胞間連接分子，獲得N-cad、Vimentin、α-SMA等細(xì)胞前后極性和細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白，同時(shí)腫瘤細(xì)胞合成、分泌基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs），進(jìn)一步調(diào)控EMT 相關(guān)蛋白，降低細(xì)胞間黏附作用，改變細(xì)胞形態(tài)，增強(qiáng)細(xì)胞遷移和侵襲能力[12-15]。MMP-2和MMP-9是MMPs 家族的主要成員，可以降解基底膜和ECM，破壞細(xì)胞內(nèi)外的組織學(xué)屏障，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)活力，加速EMT 進(jìn)展[16-17]。而TIMP-2 能夠特異性抑制MMP-2 的活性[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，蒼術(shù)酮能顯著下調(diào)MHCC97-H 細(xì)胞中α-SMA、Vimentin、N-cad、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)，上調(diào)E-cad和TIMP-2蛋白表達(dá)，通過(guò)抑制基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)的降解來(lái)逆轉(zhuǎn)EMT。

無(wú)限制增生是癌細(xì)胞的三大特征之一，促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡是重要的抗腫瘤手段。Bcl-2是抗凋亡的關(guān)鍵調(diào)控基因，而caspase-3 可通過(guò)激活下游細(xì)胞凋亡靶點(diǎn)，發(fā)揮促凋亡作用[19]。Bax 能拮抗Bcl-2 的抗凋亡作用，提高caspase-3 的活性，具有顯著的促凋亡作用[20]。通過(guò)檢測(cè)Bcl-2、caspase-3、Bax 蛋白表達(dá)可以從分子水平反映癌細(xì)胞的凋亡情況。本研究結(jié)果顯示，蒼術(shù)酮可能通過(guò)下調(diào)Bcl-2 蛋白表達(dá)，上調(diào)Cleaved caspase-3、Bax 蛋白表達(dá)，從而促進(jìn)人肝癌細(xì)胞MHCC97-H凋亡。

綜上所述，蒼術(shù)酮能夠抑制人肝癌細(xì)胞MHCC97-H 增殖、遷移和侵襲，并促進(jìn)其凋亡，可能與調(diào)控細(xì)胞EMT 及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)有關(guān)。本研究結(jié)果可為蒼術(shù)酮抗肝癌的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)，但由于肝癌發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，涉及多靶點(diǎn)、多通路，因此蒼術(shù)酮的抗肝癌作用及其可能機(jī)制仍需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。